结合CD83的嵌合抗原受体的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月23日提交的美国临时申请号62/634,435和于2018年5月30日提交的申请序列号62/677,783的权益，将这些申请特此通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请含有2019年2月21日创建的、以名为“320803-2200sequencelisting_st25”的ascii.txt文件的电子形式提交的序列表。将序列表的内容以其整体并入本文。

背景技术：

同种异体造血细胞移植(hct)是用于血液恶性肿瘤的有效疗法，但是它受到急性移植物抗宿主病(gvhd)的限制。gvhd在供体t细胞响应于宿主细胞上遗传确定的蛋白时出现，并且其是与hct相关联的高死亡率的关键促成因素。树突细胞(dc)在引起gvhd的同种异体t细胞刺激中起主要作用。供体dc是主要抗原递呈细胞，负责间接呈递移植后的同种异体抗原，并且此过程几乎在移植后立即开始。当前的免疫抑制措施可控制gvhd靶细胞，但损害患者的移植后免疫性。

技术实现要素：

披露了嵌合抗原受体(car)多肽，其可以与过继性细胞转移一起使用以抑制同种异体反应性细胞，例如供体t细胞。所披露的car多肽在胞外结构域中含有可以结合cd83表达细胞的抗cd83结合剂。还披露了经遗传修饰以表达所披露的car多肽的免疫效应细胞。

在一些实施例中，抗cd83结合剂是特异性结合cd83的抗体片段。例如，抗原结合结构域可以是特异性结合cd83的抗体的fab或单链可变片段(scfv)。在一些实施例中，抗cd83结合剂是特异性结合cd83的适配体。例如，抗cd83结合剂可以是肽适配体，基于其结合cd83的能力，其选自随机序列库。抗cd83结合剂还可以是cd83的天然配体，或其能够结合cd83的变体和/或片段。

在一些实施例中，抗cd83scfv可以包含具有cdr1、cdr2和cdr3序列的可变重(vh)结构域和具有cdr1、cdr2和cdr3序列的可变轻(vl)结构域。

例如，在一些实施例中，vh结构域的cdr1序列包含氨基酸序列gfsittggywwt(seqidno:1)、sdgis(seqidno:7)、或snami(seqidno:13)；vh结构域的cdr2序列包含氨基酸序列gyifssgntnynpsiks(seqidno:2)、iissggntyyaswakg(seqidno:8)、或amdsnsrtyyatwakg(seqidno:14)；vh结构域的cdr3序列包含氨基酸序列caraygklgfdy(seqidno:3)、vvggtysi(seqidno:9)、或gdggssdytem(seqidno:15)；vl结构域的cdr1序列包含氨基酸序列tlssqhstytig(seqidno:4)、qssqsvynndfls(seqidno:10)、或qssqsvygnnels(seqidno:16)；vl结构域的cdr2序列包含氨基酸序列vnsdgshskgd(seqidno:5)、yastlas(seqidno:11)、或qasslas(seqidno:17)；并且vl结构域的cdr3序列包含氨基酸序列gssdssgyv(seqidno:6)、tgtygnsawyeda(seqidno:12)、或lgeysisadnh(seqidno:18)。

例如，在一些实施例中，vh结构域的cdr1序列包含氨基酸序列gfsittggywwt(seqidno:1)，vh结构域的cdr2序列包含氨基酸序列gyifssgntnynpsiks(seqidno:2)，vh结构域的cdr3序列包含氨基酸序列caraygklgfdy(seqidno:3)，vl的cdr1序列包含氨基酸序列tlssqhstytig(seqidno:4)，vl结构域的cdr2序列包含氨基酸序列vnsdgshskgd(seqidno:5)，并且vl结构域的cdr3序列包含氨基酸序列gssdssgyv(seqidno:6)。

例如，在一些实施例中，vh结构域的cdr1序列包含氨基酸序列sdgis(seqidno:7)，vh结构域的cdr2序列包含氨基酸序列iissggntyyaswakg(seqidno:8)，vh结构域的cdr3序列包含氨基酸序列vvggtysi(seqidno:9)，vl的cdr1序列包含氨基酸序列qssqsvynndfls(seqidno:10)，vl结构域的cdr2序列包含氨基酸序列yastlas(seqidno:11)，并且vl结构域的cdr3序列包含氨基酸序列tgtygnsawyeda(seqidno:12)。

例如，在一些实施例中，vh结构域的cdr1序列包含氨基酸序列snami(seqidno:13)，vh结构域的cdr2序列包含氨基酸序列amdsnsrtyyatwakg(seqidno:14)，vh结构域的cdr3序列包含氨基酸序列gdggssdytem(seqidno:15)，vl的cdr1序列包含氨基酸序列qssqsvygnnels(seqidno:16)，vl结构域的cdr2序列包含氨基酸序列qasslas(seqidno:17)，并且vl结构域的cdr3序列包含氨基酸序列lgeysisadnh(seqidno:18)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：qvqlkesgpglvkpsqslsltcsvtgfsittggywwtwirqfpgqklewmgyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:19，vh-gbm00)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：qpvltqspsasaslgnsvkitctlssqhstytigwyqqhpdkapkyvmyvnsdgshskgdgipdrfsgsssgahrylsisniqpedeadyfcgssdssgyvfgsgtqltvl(seqidno:20，vl-gbm00)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslsnnainwvrqapgkglewigyiwsggltyyanwaegrftisktsttvdlkmtsptiedtatyfcarginnsalwgpgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(seqidno:21，20d04)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdmraptqllgllllwlpgarcadvvmtqtpasvsaavggtvtincqasesisnylswyqqkpgqppklliyrtstlasgvssrfkgsgsgteytltisgvqcddvatyycqctsggkfisdgaafgggtevvvkgdpvaptvllfppssdevatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfsrknc(seqidno:22，20d04)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgftisdydlswvrqapgeglkyigfiaidgnpyyatwakgrftisktsttvdlkitapttedtatyfcargagdlwgpgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(seqidno:23，11g05)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdtreptqllgllllwlpgarcadvvmtqtpasvsaavggtvtincqssknvynnnwlswfqqkpgqppklliyyastlasgvpsrfrgsgsgtqftltisdvqcddaatyycagdyssssdngfgggtevvvkgdpvaptvllfppssdevatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfsrknc(seqidno:24，11g05)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvhcqsveesggrlvtpgtpltltctasgfsrssydmswvrqapgkglewvgvistaynshyaswakgrftisrtsttvdlkmtslttedtatyfcarggswldlwgqgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(seqidno:25，14c12)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdxraptqllgllllwlpgarcalvmtqtpasvsaavggtvtincqssqsvydndelswyqqkpgqppklliyalasklasgvpsrfkgsgsgtqfaltisgvqcddaatyycqathyssdwyltfgggtevvvkgfpvaptvllfppssdevatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgtensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfsrknc(seqidno:26，14c12)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslssydmtwvrqapgkglewigiiyasgttyyanwakgrftisktsttvdlkvtsptigdtatyfcaregagvsmtlwgpgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(seqidno:27，020b08)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdmraptqllgllllwlpgarcaydmtqtpasvevavggtvtikcqasqsistyldwyqqkpgqppklliydasdlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecadaatyycqqgythsnvdnvfgggtevvvkgdpvaptvllfppssdevatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfsrknc(seqidno:28，020b08)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvspgtpltltctasgfslssydmswvrqapgkgleyigiisssgstyyaswakgrftisktsttvdlevtslttedtatyfcsrehagysgdtghlwgpgtlvtvssgqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvgigppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflynklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk(seqidno:29，006g05)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdmraptqllgllllwlpgarcaydmtqtpasvevavggtvaikcqasqsvssylawyqqkpgqppkpliyeasmlaagvssrfkgsgsgtdftltisdlecddaatyycqqgysisdidnafgggtevvvkgdpvaptvllfppssdevatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfsrknc(seqidno:30，006g05)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgidlssdgiswvrqapgkglewigiissggntyyaswakgrftisrtsttvdlkmtslttedtatyfcarvvggtysiwgqgtlvtvssastkgpsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seqidno:31，96g08)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdtraptqllgllllwlpgatfaqvltqtaspvsapvggtvtincqssqsvynndflswyqqkpgqppklliyyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyctgtygnsawyedafgggtevvvkrtpvaptvllfppssaelatgtativcvankyfpdgtvtwkvdgitqssginnsrtpqnsadctynlsstltlssdeynshdeytcqvaqdsgspvvqsfsrksc(seqidno:32，96g08)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：metglrwlllvavlkgvqcqsveesggrlvtpgtpltltctvsgidlssnamiwvrqapreglewigamdsnsrtyyatwakgrftisrtssitvdlkitspttedtatyfcargdggssdytemwgpgtlvtvssastkgpsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seqidno:33，95f04)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mdtraptqllgllllwlpgatfaqavvtqttspvsapvggtvtincqssqsvygnnelswyqqkpgqppklliyqasslasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaatyyclgeysisadnhfgggtevvvkrtpvaptvllfppssaelatgtativcvankyfpdgtvtwkvdgitqssginnsrtpqnsadctynlsstltlssdeynshdeytcqvaqdsgspvvqsfsrksc(seqidno:34，95f04)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域包含氨基酸序列：qvqlvqsggavvqpgrslrlscaasgftfstygmhwvrqapgkglewvaavsydgsnkyyadfvkgrftisrdnpkntlylqmnslraddtavyycarrggldiwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscaaa(seqidno:35)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：ltqpppasgtpgqqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliyygndqrpsgvpdrfsasksgtsaslaisglqsedeahyycaawdgslnggvifgggtkvtlg(seqidno:36)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：vtqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigtnpvnwyqqlpgtapklliyttdqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyycaawddslsglyvfgtgtkvtvlg(seqidno:37)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mthtplslsvtpgqpasisckssqsllhsdgktylywylqrpgqspqpliyevsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrvqaedvgvyycmqslqlwtfgqgtkveikr(seqidno:38)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqsplslpvtlgqpasiscrssqslihsdgntyldwfqqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlrisrveaedigvyycmqathwprtfgqgtkveikr(seqidno:39)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqsplslpvtlgqpasiscrssqslvdsagntflhwfhqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgthwprtfgqgtkveikr(seqidno:40)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：ltqsplslpvtlgqpasisckssqslvdsdgntylnwfqqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgthwprtfgqgtkveikr(seqidno:41)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqsplslpvtlgqpasiscrssqslvhsdgnmylnwfqqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqatqptwtfgqgtkleikr(seqidno:42)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftissatyycqqtyqgtkleikr(seqidno:43)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqspsslsasvghpvtitcrasqslisylnwyhqkpgkapklliyaasilqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpenfasyycqhtdsfprtfghgtkveikr(seqidno:44)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：ltqppsasgtpgqgvtiscrgstsnignnvvnwyqhvpgsapklliwsniqrpsgipdrfsgsksgtsaslaisglqsedqavyycavwddglagwvfgggttvtvls(seqidno:45)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：mtqapvvsvaleqtvritcqgdslaiyydfwyqhkpgqapvlviygknnrpsgiphrfsgsssntdsltitgaqaedeadyycnsrdssgnhwvfgggtnltvlg(seqidno:46)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域包含氨基酸序列：ltqsplslpvtlgqpasiscksnqslvhsdgntylnwfqqrpgqsprrliykvsnrdsgvpdrfsgsgsgtdftlkinrveaedvgvyycmqgtqwprtfggqgtkldikr(seqidno:47)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:48，vh-gbm01)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqhpgkglewigyifssgntnynpsikslvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:49，vh-gbm02)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:50，vh-gbm03)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:51，vh-gbm04)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:52，vh-gbm05)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvh结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvss(seqidno:53，vh-gbm06)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：qlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:54，vl-gbm01)。

在一些实施例中，抗cd83scfvvl结构域已被人源化并且包含氨基酸序列：lpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:55，vl-gbm02)。

优选地，重链和轻链由接头隔开。scfv抗体的合适接头是本领域已知的。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列ggggsggggsggggs(seqidno:56)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qpvltqspsasaslgnsvkitctlssqhstytigwyqqhpdkapkyvmyvnsdgshskgdgipdrfsgsssgahrylsisniqpedeadyfcgssdssgyvfgsgtqltvlraaassggggsggggsggggsqpvltqspsasaslgnsvkitctlssqhstytigwyqqhpdkapkyvmyvnsdgshskgdgipdrfsgsssgahrylsisniqpedeadyfcgssdssgyvfgsgtqltvlraaa(seqidno:57)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlkesgpglvkpsqslsltcsvtgfsittggywwtwirqfpgqklewmgyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqvqlkesgpglvkpsqslsltcsvtgfsittggywwtwirqfpgqklewmgyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtv(seqidno:58)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:59)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqhpgkglewigyifssgntnynpsikslvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:60)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:61)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:62)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:63)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqlvltqspsasaslgasvkltctlssqhstytigwhqqqpekgprylmkvnsdgshskgdgipdrfsgsssgaeryltisslqsedeadyycgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:64)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:65)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqhpgkglewigyifssgntnynpsikslvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:66)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:67)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:68)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrvtisvdtsknqfslklssvtaadtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:69)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsittggywwtwirqppgkglewigyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggslpvltqppsasallgasikltctlssqhstytigwyqqrpgrspqyimkvnsdgshskgdgipdrfmgsssgadryltfsnlqsddeaeyhcgssdssgyvfgsgtkvtvl(seqidno:70)。

在一些实施例中，抗cd83scfv包含氨基酸序列：qvqlkesgpglvkpsqslsltcsvtgfsittggywwtwirqfpgqklewmgyifssgntnynpsiksrisitrdtsknqfflqlnsvttegdtaryycaraygklgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggggsqpvltqspsasaslgnsvkitctlssqhstytigwyqqhpdkapkyvmyvnsdgshskgdgipdrfsgsssgahrylsisniqpedeadyfcgssdssgyvfgsgtqltvl(seqidno:71)。

正如其他car，所披露的多肽还可以含有跨膜结构域和能够激活免疫效应细胞的胞内结构域。例如，胞内结构域可以含有信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导区域。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域是cd3zeta(cd3ζ)信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区域包含cd28、4-1bb的胞质结构域，或其组合。在一些情况下，共刺激信号传导区域含有一种或多种细胞内信号传导分子和/或共刺激分子的1、2、3、或4个胞质结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导区域含有cd28和/或4-1bb的胞质结构域中的增强信号传导的一个或多个突变。

在一些实施例中，car多肽含有不完全胞内结构域。例如，car多肽可以仅含有细胞内信号传导结构域或共刺激结构域，但不含有这两者。在这些实施例中，免疫效应细胞不被激活，除非它和含有缺失结构域的第二car多肽(或内源t细胞受体)都结合其各自抗原。因此，在一些实施例中，car多肽含有cd3zeta(cd3ζ)信号传导结构域，但是并不含有共刺激信号传导区域(csr)。在其他实施例中，car多肽含有cd28、4-1bb的胞质结构域，或其组合，但是并不含有cd3zeta(cd3ζ)信号传导结构域(sd)。

还披露了编码披露的car多肽的分离的核酸序列、包含这些分离的核酸的载体、和含有这些载体的细胞。例如，细胞可以是选自由以下组成的组的免疫效应细胞：α-βt细胞、γ-σt细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、b细胞、先天淋巴细胞(ilc)、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、淋巴因子活化杀伤(lak)细胞、和调节性t细胞。

在一些实施例中，当car的抗原结合结构域结合cd83时，细胞抑制同种异体反应性供体细胞，例如t细胞。

还披露了在受试者中预防gvhd的方法，该方法涉及向该受试者施用有效量的用披露的cd83特异性car遗传修饰的免疫效应细胞。在一些实施例中，受试者接受组织移植。在一些实施例中，组织移植包括骨髓移植。在一些实施例中，组织移植包括实体器官移植，包括但不限于面部移植、腹壁移植、肢体移植、上肢移植、血管化复合物同种异体移植、或整个组织移植。在一些实施例中，受试者患有自身免疫性疾病、败血症、风湿病、糖尿病、和/或哮喘。还披露了在受试者中治疗自身免疫的方法，该方法涉及向该受试者施用有效量的用披露的cd83特异性car遗传修饰的免疫效应细胞。还披露了在受试者中预防实体器官同种异体移植和现有car-t细胞的排斥，该方法涉及向该受试者施用有效量的用披露的cd83特异性car遗传修饰的免疫效应细胞。

在以下的附图和说明中阐述本发明的一个或多个实施例的细节。根据说明书和附图，并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见。

附图说明

图1是根据本文披露的一个实施例的人cd83car构建体的示意图。抗cd83单链可变片段后面是cd8铰链和跨膜结构域，以及41bb共刺激结构域和cd3ζ激活结构域。在3'末端用荧光报告子标记car。将car报告基因克隆到sfg逆转录病毒载体中。

图2a至2e示出人cd83cart细胞的表征。图2a是条形图，示出在模拟物转导的(egfp阴性的)t细胞或cd83car(egfp阳性的)t细胞中，产生后表达egfp报告子的t细胞的量(平均值±sem)。图2b是条形图，展示在模拟物转导的t细胞或cd83cart细胞中，cd4或cd8表达的相对量(平均值±sem)，西达克检验(sidak’stest)。图2c示出在用cd83+dc刺激后，由模拟物转导的t细胞或cd83cart细胞释放的ifnγ的量。图2d示出经实时细胞分析系统测量的、与cd83+dc共培养的cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞的细胞毒性。数据呈现为对于一式两个的孔，随时间的平均归一化细胞指数。将归一化细胞指数计算为在给定时间点的细胞指数除以为在添加t细胞后第1天的归一化时间点的细胞指数。示出了2个代表性实验中的1个，邓尼特检验(dunnett’stest)。图2e示出经14天时段，每周计算的、针对cd83+dc刺激的cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞的、t细胞绝对数量。示出了2个代表性实验中的1个，西达克检验。**p＝0.001-0.01，***p＝0.0001-0.001，和****p<0.0001。

图3示出人cd83嵌合抗原受体t细胞减小同种异体反应性。按1:30的dc:t细胞比率(即100,000个t细胞和3333个modc)，将人t细胞与同种异体的、细胞因子成熟的、单核细胞衍生的树突细胞(modc)一起培养。按与modc的具体比率(3:1至1:10，其中添加的cart的最低量是333个细胞)，添加cd83cart(对于培养的t细胞是自体的)。在第+5天，通过ki-67表达来测量t细胞增殖。通过它们的gfp的表达，门输出cart。对照包括单独的t细胞(即没有增殖)、模拟物转导的t细胞、和cd19cart细胞。这些模拟物转导的t细胞不表达嵌合抗原受体，但是以与转导的cd83细胞相同的方式进行处理。在此系统中，cd19cart细胞使用41bb共刺激结构域，并且靶向无关抗原。示出了2个代表性实验中的1个。

图4a至4d示出与调节性t细胞(treg)相比，cd83在人激活的常规cd4+t细胞(tcon)上差异性表达。用同种异体modc(dc:t细胞配给1:30)或cd3/cd28珠(珠:t细胞比率1:30)刺激人t细胞。在基线、刺激后4小时、8小时、24小时、和48小时测量激活的tcon(cd4+、cd127+、cd25+)或treg(cd4+、cd127-、cd25+、foxp3+)上的cd83表达。图4a和4b是显示在刺激后不同时间点、在tcon(图4a)和treg(图4b)中的cd83表达的代表性等值线图。示出了3个代表性实验中的1个。图4c和4d是条形图，显示了在同种异体dc(图4c)或cd3/cd28珠(图4d)刺激后，cd83+tconv或treg的量(平均值±sem)。n＝5个独立实验，西达克检验。*p<0.05，**p＝0.001-0.01，***p＝0.0001-0.001，和****p<0.0001。

图5a和5b示出人cd83cart细胞防止异种gvhd。nsg小鼠接受25x10⁶个人pbmc，并且接种低(1x10⁶个)或高剂量(10x10⁶个)cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。car对于pbmc供体而言是自体的。另外的对照组的小鼠接受单独的pbmc。图5a和5b示出存活率(图5a)和(b)gvhd临床评分(图5b)。临床评分合并了活性、皮毛和皮肤状况、体重丧失、和姿势的综合评估。合并的数据来自3个独立实验，每个实验组多达9只小鼠。对数秩检验。**p＝0.001-0.01。

图6a至6d示出cd83cart细胞显著减少人t细胞对gvhd靶器官的损伤。nsg小鼠移植有25x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。对照组由以下组成：不接受pbmc的小鼠(阴性对照)，和接受pbmc但不接受修饰的t细胞的小鼠(第二阳性对照)。在第+21天将接受者小鼠人道安乐死，并且由专业的、不知情的病理学家评估组织gvhd严重性。针对接受者肺(图6a、6b)和肝(图6c、6d)，示出异种gvhd路径评分(图6a、6c)和代表性h&e图像(图6b、6d)。合并的数据来自2个独立实验，每个实验组多达6只小鼠。邓尼特检验。**p＝.001-.01和***p＝0.0001-0.001。

图7示出人cd83cart细胞减少体内供体细胞扩增的扩增。nsg小鼠移植有25x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。对照组由以下组成：不接受pbmc的小鼠(阴性对照)，和接受pbmc但不接受修饰的t细胞的小鼠(第二阳性对照)。在第+21天将接受者小鼠人道安乐死，并且取出它们的脾用于总体评估和流式细胞术研究。代表性图像显示，接受pbmc和cd83cart细胞的小鼠表现出减小的脾大小，这支持对体内供体t细胞扩增的抑制。2个代表性实验中的1个，每个实验组多达6只小鼠。

图8a至8e显示，人cd83cart细胞显著减少体内循环的成熟cd83+dc。nsg小鼠接受25x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。图8a含有代表性等值线图，显示在第+21天，小鼠脾中的人cd83+、cd1c+dc的频率。图8b\是条形图，显示在第+21天，小鼠脾中的人cd83+、cd1c+dc的绝对数量(平均值±sem)，邓尼特检验。图8c含有代表性等值线图，显示在第+21天，接受者脾中的mhcii+类cd1c+dc的百分比。图8d是条形图，描绘了这些细胞的绝对数量(平均值±sem)，邓尼特检验。图8e是代表性等值线图，显示与接受模拟物转导的t细胞的小鼠相比，在第+21天，在接种小鼠中的egfp+cd83cart细胞的量。合并的数据来自2个独立实验，每个实验组多达6只小鼠。**p＝.001-.01。

图9a至9i显示人cd83cart细胞显著减少致病th1细胞，并且增加treg:tconv比率。nsg小鼠接受25x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个如所述的cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。在第+21天，将小鼠人道安乐死，并且计算并且表征供体人t细胞的量。图9a含有代表性等值线图，显示接受者脾中的人cd4+t细胞的频率。图9b和9c是条形图，显示在第+21天，小鼠脾中的cd4+(图9b)和cd8+(图9c)t细胞的绝对数量(平均值±sem)，邓尼特检验。图9d含有等值线图，描绘了在第+21天，小鼠脾中的cd4+、cd127-、cd25+、foxp3+treg的百分比。图9e和9f是条形图，显示在接受者小鼠中，在第+21天，treg(图9e)和treg:cd4+、cd25+同种异体反应性tconv(图9f)的量(平均值±sem)，邓尼特检验。图9g含有等值线图，描绘了在第+21天，小鼠脾中的cd4+、ifnγ+th1细胞和cd4+、il-4+th2细胞的频率。图9h和9i是条形图，显示接受者脾中th1(图9h)和th2(图9i)细胞的绝对数量(平均值±sem)，邓尼特检验。合并的数据来自2个独立实验，每个实验组多达6只小鼠。*p<0.05，**p＝0.001-0.01。

图10：人cd83cart细胞允许ctl介导的抗肿瘤免疫性。nsg小鼠接受25x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个如所述的cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。a)在第+21天，计算供体人cd8+t细胞的量，邓尼特检验。合并的数据来自2个独立实验，每个实验组多达6只小鼠。b)nsg小鼠移植有30x10⁶个人pbmc加上1x10⁶个cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞。在第0和+7天给予经辐射的k562细胞(10⁷个)的接种物。在第+12天，将小鼠人道安乐死，并且从接受者脾纯化人cd8t细胞。将纯化的人cd8t细胞与新鲜k562细胞按10:1的e/t比率共培养，并且使用xcelligencertca系统监测靶细胞杀伤，邓尼特检验。示出了2个代表性实验中的1个。*p<.05，***p＝.0001-.001，和****p<.0001。

图11a和11b显示在同种异体树突细胞(图11a)或cd3/cd28珠(图11b)的刺激后，在人cd8+t细胞中的cd83表达。

具体实施方式

本文披露了靶向抗原呈递细胞上的cd83的嵌合抗原受体(car)。还披露了被工程化以表达这些car的免疫效应细胞，例如t细胞或自然杀伤(nk)细胞。表达这些car的cart细胞可以抑制同种异体反应性供体细胞，例如t细胞。因此，还披露了用于在受试者中预防gvhd的方法，这些方法涉及被工程化以表达所披露的cd83特异性car的所披露的免疫效应细胞的过继性转移。

cd83特异性嵌合抗原受体(car)

car通常合并了来自单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)的抗原识别结构域与淋巴细胞激活涉及的跨膜信号传导基序(sadelainm等人，natrevcancer[癌症自然评论]20033:35-45)。本文披露了cd83特异性嵌合抗原受体(car)，其可以在可以在免疫效应细胞中表达以抑制同种异体反应性供体细胞。

披露的car通常由三个结构域构成：胞外结构域、跨膜结构域、和胞内结构域。胞外结构域包含cd83结合区并且负责抗原识别。它还任选地含有信号肽(sp)，使得car可以被糖基化并且被锚定在免疫效应细胞的细胞膜中。如跨膜结构域的名字所提示，当由细胞表达时，跨膜结构域(td)将胞外结构域连接至胞内结构域，并且位于细胞膜内。胞内结构域是car的起作用的一端，其在抗原识别后，将激活信号传递至免疫效应细胞。例如，胞内结构域可以含有细胞内信号传导结构域(isd)和任选地共刺激信号传导区域(csr)。

“信号传导结构域(sd)”通常含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)，当itam磷酸化时，这些基序激活信号级联反应。术语“共刺激信号传导区域(csr)”是指能够通过t细胞受体增强t细胞激活的、来自共刺激蛋白受体(例如cd28、41bb、和icos)的细胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，胞内结构域含有sd或csr，但不含有这两者。在这些实施例中，如果另一种含有缺失结构域的car(或t细胞受体)也结合其各自抗原，则仅含有披露的car的免疫效应细胞被激活。

在一些实施例中，所披露的car由下式限定：

sp-cd83-hg-tm-csr-sd；或者

sp-cd83-hg-tm-sd-csr；

其中“sp”表示任选的信号肽，

其中“cd83”表示cd83结合区，

其中“hg”表示任选的铰链结构域，

其中“tm”表示跨膜结构域，

其中“csr”表示一种或多种共刺激信号传导区域，

其中“sd”表示信号传导结构域，并且

其中“-”表示肽键或接头。

例如，在以下文献中描述了另外的car构建体：fresnakad等人，engineeredtcells:thepromiseandchallengesofcancerimmunotherapy.[工程化的t细胞：癌症免疫治疗的前景和挑战]natrevcancer.[癌症自然评论]2016年8月23日；16(9):566-81，将其通过引用以其全文并入，用于教授这些car模型。

例如，car可以是truck、通用car、自驱动car、装甲的car、自毁car、条件car、标记的car、tencar、双重car、或scar。

被工程化以抵抗免疫抑制的cart细胞(装甲的car)可以被遗传修饰以不再表达具有免疫检查点开关受体的不同免疫检查点分子(例如，细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4)或程序性细胞死亡蛋白1(pd1))，或可以与阻断免疫检查点信号传导的单克隆抗体一起施用。

可以使用通过电穿孔递送的、编码car的rna设计自毁car。可替代地，可以基于基因修饰的淋巴细胞中的结合胸苷激酶的更昔洛韦或更近描述的通过小分子二聚化因子激活人半胱天冬酶9的系统，实现t细胞的可诱导性细胞凋亡。

条件cart细胞是默认无应答性的，或“关闭”，直至添加小分子来完成回路，实现信号1和信号2的完全转导，由此激活cart细胞。可替代地，可以将t细胞工程化以表达对于随后施用的针对靶抗原的第二抗体具有亲和力的衔接物特异性受体。

串联car(tancar)t细胞表达由以下组成的单个car：具有与一个或多个细胞内共刺激结构域和cd3ζ结构域融合的不同亲和力的、两个连接的单链可变片段(scfv)。仅当靶细胞共表达这两种靶标时，才能实现tancart细胞激活。

双重cart细胞表达具有不同配体结合靶标的两个分开的car；一个car仅包括cd3ζ结构域并且另一个car仅包括一个或多个共刺激结构域。双重cart细胞激活需要这两个靶标的共表达。

安全性car(scar)由以下组成：融合至细胞内抑制结构域的细胞外scfv。仅当遇到具有标准car靶标但缺乏scar靶标的靶细胞时，共表达标准car的scart细胞才被激活。

披露的car的抗原识别结构域通常是scfv。然而，存在很多替代方案。已经描述了来自天然t细胞受体(tcr)α和β单链的抗原识别结构域，它具有简单胞外结构域(例如，用来识别hiv感染的细胞的cd4胞外结构域)和更外来的识别组分(例如连接的细胞因子，其导致携带该细胞因子受体的细胞的识别)。实际上，以高亲和力结合给定靶标的几乎任何事物都可以用作抗原识别区域。

胞内结构域是car的起作用的一端，其在抗原识别后，将信号传递至免疫效应细胞，激活免疫效应细胞的正常效应子功能中的至少一种。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，胞内结构域可以包含t细胞受体(tcr)和任选的辅助受体的“细胞内信号传导结构域”。尽管通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在很多情况下，没有必要使用整个链。为达到使用细胞内信号传导结构域的截短部分的这种程度，可以使用此类截短的部分代替完整链，只要它转导效应子功能信号。

调节以共刺激方式发挥作用的tcr复合物的主要激活的胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，这些信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。含有胞质信号传导序列的itam的实例包括源自以下的那些：cd8、cd3ζ、cd3δ、cd3γ、cd3ε、cd32(fcγriia)、dap10、dap12、cd79a、cd79b、fcγriγ、fcγriiiγ、fcεriβ(fcerib)、和fcεriγ(fcerig)。

在具体的实施例中，细胞内信号传导结构域源自cd3zeta(cd3ζ)(tcrzeta，genbank登录号bag36664.1)。t细胞表面糖蛋白cd3zeta(cd3ζ)链(也称为t细胞受体t3zeta链或cd247(分化簇247))是人体中由cd247基因编码的蛋白。

第一代car典型地具有来自cd3ζ链的胞内结构域，其是来自内源tcr的信号的主要发送器。第二代car将来自不同共刺激蛋白受体(例如cd28、41bb、icos)的细胞内信号传导结构域添加至car的胞内结构域，从而向t细胞提供另外的信号。更近地，第三代car组合多个信号传导结构域以进一步增强效能。移植有这些car的t细胞已显示出改善的扩增、激活、持久性、和肿瘤根除功效，而这些不依赖共刺激受体/配体相互作用(imaic等人leukemia[白血病]200418:676-84；maherj等人natbiotechnol[自然生物技术]200220:70-5)。

例如，可以将car的胞内结构域设计为包含单独的或与本发明的car背景下有用的任何其他一种或多种所希望的胞质结构域组合的cd3ζ信号传导结构域。例如，car的胞质结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区域是指car的一部分，其包含共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，该共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3，以及特异性结合cd123、cd8、cd4、b2c、cd80、cd86、dap10、dap12、myd88、btnl3、和nkg2d的配体。因此，尽管例证car主要具有cd28作为共刺激信号传导元件，但是其他共刺激元件可以单独使用或与其他共刺激信号传导元件组合使用。

在一些实施例中，car包含铰链序列。铰链序列是有助于抗体柔性的短氨基酸序列(参见例如woof等人，nat.rev.immunol.[自然免疫学评论],4(2):89-99(2004))。铰链序列可以位于抗原识别部分(例如，抗cd83scfv)和跨膜结构域之间。铰链序列可以是源自或获得自任何合适的分子的任何合适的序列。在一些实施例中，例如，铰链序列源自cd8a分子或cd28分子。

跨膜结构域可以源自天然的或合成的来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合的蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜区可以源自(即至少包含以下的一个或多个跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cd8(例如cd8α，cd8β)，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，或cd154，kirds2，ox40，cd2，cd27，lfa-1(cd11a、cd18)，icos(cd278)，4-1bb(cd137)，gitr，cd40，baffr，hvem(lightr)，slamf7，nkp80(klrf1)，cd160，cd19，il2rβ，il2rγ，il7rα，itga1，vla1，cd49a，itga4，ia4，cd49d，itga6，vla-6，cd49f，itgad，cd11d，itgae，cd103，itgal，cd11a，lfa-1，itgam，cd11b，itgax，cd11c，itgb1，cd29，itgb2，cd18，lfa-1，itgb7，tnfr2，dnam1(cd226)，slamf4(cd244，2b4)，cd84，cd96(tactile)，ceacam1，crtam，ly9(cd229)，cd160(by55)，psgl1，cd100(sema4d)，slamf6(ntb-a，ly108)，slam(slamf1，cd150，ipo-3)，blame(slamf8)，selplg(cd162)，ltbr，和pag/cbp。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些情况下，将在合成的跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。短寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间，可以形成car的跨膜结构域和内质结构域之间的连接。

在一些实施例中，car具有多于一个跨膜结构域，其可以是同一跨膜结构域的重复，或可以是不同的跨膜结构域。

在一些实施例中，car是多链car，如描述于wo2015/039523中，将其通过引用而并入，用于此教授内容。多链car可以包含不同跨膜多肽中的分开的细胞外配体结合结构域和信号传导结构域。可以将信号传导结构域设计为在近膜位置组装，其形成更接近赋予最佳信号转导的天然受体的柔性架构。例如，多链car可以包含fceriα链的一部分和fceriβ链的一部分，使得fceri链自发二聚在一起，从而形成car。

下表1、2、和3提供了可以在披露的car中存在的cd83结合区、共刺激信号传导区域、和细胞内信号传导结构域的一些实例组合。

表1.第一代car

表3.第三代car

表4.缺乏共刺激信号的car(用于双重car方法)

表5.缺乏信号结构域的car(用于双重car方法)

表6.缺乏信号结构域的第三代car(用于双重car方法)

在一些实施例中，抗cd83结合剂是单链可变片段(scfv)抗体。抗cd83scfv的亲和力/特异性在很大程度上由重链(vh)和轻链(vl)中的互补决定区(cdr)内的特定序列驱动。每个vh和vl序列将具有三个cdr(cdr1、cdr2、cdr3)。

在一些实施例中，抗cd83结合剂源自天然抗体，例如单克隆抗体。在一些情况下，抗体是人抗体。在一些情况下，抗体经历改变，使得当施用于人类时，它具有更小的免疫原性。例如，改变包括选自由以下组成的一种或多种技术：框架氨基酸的嵌合化、人源化、cdr移植、脱免疫、和突变，以对应于最近的人种系序列。

还披露了靶向cd83和至少一种另外的抗原的双特异性car。还披露了设计为仅在结合另一种car(其结合不同抗原)时工作的car。例如，在这些实施例中，披露的car的胞内结构域可以仅含有信号传导结构域(sd)或共刺激信号传导区域(csr)，但不含有这两者。如果被激活，第二car(或内源t细胞)则会提供缺失信号。例如，如果披露的car含有sd但不含有csr，则仅在含有csr的另一种car(或t细胞)结合其各自抗原的情况下，激活含有此car的免疫效应细胞。同样，如果披露的car含有csr但不含有sd，则仅在含有sd的另一种car(或t细胞)结合其各自抗原的情况下，激活含有此car的免疫效应细胞。

核酸和载体

还披露了编码披露的cd83特异性car的多核苷酸和多核苷酸载体，其允许cd83特异性car在披露的免疫效应细胞中表达。

可以使用本领域已知的重组方法，例如使用标准技术，通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括该基因的载体衍生该基因、或通过从含有该基因的细胞和组织直接分离，来获得编码披露的car、及其区域的核酸序列。可替代地，可以合成地产生，而不是克隆目的基因。

典型地通过将编码car多肽的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体合并到表达载体中，来实现编码car的核酸的表达。典型的克隆载体含有用于调节所希望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、初始序列、和启动子。

可以将披露的核酸克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到以下载体中，这些载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体、和测序载体。

此外，可以按病毒载体的形式，将表达载体提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory),纽约)中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点、和一种或多种选择性标记。在一些实施例中，多核苷酸载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

已经开发了多种基于病毒的系统用于基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中，并且包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并递送到受试者的细胞中(体内或离体)。

合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、mnd(骨髓增生肉瘤病毒)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病毒启动子、埃-巴二氏(epstein-barr)病毒立即早期启动子、劳斯(rous)肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子(例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子)。可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。

另外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。典型地，它们位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已显示多种启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。

为了评估car多肽或其部分的表达，要引入细胞中的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞的群体鉴定或选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可以携带在分开的dna片段上并且用于共转染程序。选择性标记和报告基因二者都可以侧翼有适当的调节序列，以实现在宿主细胞中表达。例如，有用的选择性标记包括抗生素抗性基因。

将报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并且用于评估调节序列的功能。通常，报告基因是在接受者生物体或组织中不存在或不由其表达并且编码表达表现为一些容易检测的特性(例如酶活性)的多肽的基因。在将dna已经引入接受者细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因。合适的表达载体是熟知的并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，将显示报告基因的最高表达水平的、具有最小5′侧翼区的构建体鉴定为启动子。此类启动子区域可以连接至报告基因并且用于评估试剂的调节启动子驱动的转录的能力。

将基因引入细胞并且使基因在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域中任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母、或昆虫细胞。例如，可以通过物理的、化学的、或生物的手段，将表达载体转染到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册],冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，纽约)。

用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体已经成为最广泛使用的用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人细胞)中的方法。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶态分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、微团、混合胶束、和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶态系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接至脂质体、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为脂质中的悬浮液而含有、含有微团或与微团复合、或以其他方式与脂质缔合。与脂质、脂质/dna或脂质/表达载体缔合的成分不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可以按以下存在：双层结构、微团、或“塌陷”结构。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或性状并不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包括在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃的化合物及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛)的类别。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以获得自密苏里州圣路易斯(st.louis)西格玛公司(sigma)；磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)可以获得自k&k实验室(k&klaboratories)(普莱恩维尤(plainview)，纽约州)；胆固醇(“choi”)可以获得自calbiochem-behring公司；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可以获得自阿凡提极性脂质有限公司(avantipolarlipids,inc.)(伯明翰(birmingham)，阿拉巴马州)。

免疫效应细胞

还披露了被工程化以表达披露的car的免疫效应细胞(本文也称为“car-t”细胞)。优选地，这些细胞获得自待治疗的受试者(即，是自体的)。然而，在一些实施例中，使用免疫效应细胞系或供体效应细胞(同种异体的)。免疫效应细胞可以获得自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织、和肿瘤。免疫效应细胞可以获得自使用技术人员已知的任何多种技术(例如ficoll^tm分离)从受试者收集的血液。例如，来自个体的循环血液的细胞可以通过单采血液成分术获得。在一些实施例中，通过裂解红细胞并且耗尽单核细胞，例如，通过用percoll^tm梯度离心，或通过逆流离心淘洗，从外周血淋巴细胞分离免疫效应细胞。可以通过阳性或隐性选择技术，进一步分离免疫效应细胞的特定亚群。例如，可以使用针对阳性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合，例如通过与抗体缀合的珠一起孵育足以阳性选择所希望的免疫效应细胞的时段，来分离免疫效应细胞。可替代地，可以通过使用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合进行阴性选择，来实现免疫效应细胞群体的富集。

在一些实施例中，免疫效应细胞包括参与防御身体抵抗传染性疾病和外来物质的任何白细胞。例如，免疫效应细胞可以包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树枝状细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、或其任何组合。例如，免疫效应细胞可以包括t淋巴细胞。

t细胞或t淋巴细胞可以区别于其他淋巴细胞，例如b细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)，区别在于细胞表面上存在t细胞受体(tcr)。它们被称为t细胞，因为它们在胸腺中成熟(尽管一些也在扁桃体中成熟)。存在几个t细胞的子集，每个子集都具有不同的功能。

在免疫过程(包括b细胞成熟为浆细胞或记忆b细胞，以及细胞毒性t细胞和巨噬细胞的激活)中，t辅助细胞(th细胞)辅助其他白细胞。这些细胞也称为cd4+t细胞，因为它们在其表面上表达cd4糖蛋白。当辅助t细胞由在抗原呈递细胞(apc)表面上表达的mhcii类分子与肽抗原一起呈递时，它们变为激活的。一旦激活，它们迅速分裂并且分泌称为细胞因子的小蛋白，这些细胞因子调节或辅助主动免疫应答。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括th1、th2、th3、th17、th9、或tfh，它们分泌不同细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

细胞毒性t细胞(tc细胞或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还牵涉移植排斥。这些细胞也称为cd8⁺t细胞，因为它们在其表面上表达cd8糖蛋白。这些细胞通过结合与所有有核细胞表面上存在的mhci类分子缔合的抗原而识别其靶标。通过il-10、腺苷和调节性t细胞分泌的其他分子，可以将cd8+细胞灭活为无反应性状态，从而预防自身免疫性疾病。

记忆t细胞是在已经解决感染后，长期存在的抗原特异性t细胞的子集。当重新暴露于同源抗原时，它们迅速扩增为大量效应t细胞，由此为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆细胞可以是cd4⁺或cd8⁺。记忆t细胞典型地表达细胞表面蛋白cd45ro。

调节性t细胞(treg细胞)，以前称为抑制性t细胞，对于免疫耐受性的维持是至关重要的。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭t细胞介导的免疫，并且抑制逃脱胸腺中的阴性选择过程的自体反应性t细胞。已经描述了两种主要类别的cd4⁺treg细胞—天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。

自然杀伤t(nkt)细胞(不要与自然杀伤(nk)细胞混淆)桥接适应性免疫系统与先天性免疫系统。不同于识别由主要组织相容性复合物(mhc)分子呈递的肽抗原的常规t细胞，nkt细胞识别由称为cd1d的分子呈递的糖脂质抗原。

在一些实施例中，t细胞包括cd4+细胞的混合物。在其他实施例中，基于细胞表面表达，使t细胞富含一个或多个子集。例如，在一些情况下，t细胞包含细胞毒性cd8⁺t淋巴细胞。在一些实施例中，t细胞包含γδt细胞，其具有独特的t细胞受体(tcr)(该受体具有一个γ链和一个δ链而不是α和β链)。

自然杀伤(nk)细胞是可以杀死病毒感染和转化的细胞、并且构成先天性免疫系统的关键细胞子集的cd56⁺cd3^-大颗粒淋巴细胞(godfreyj等人leuklymphoma[白血病淋巴瘤]201253:1666-1676)。不同于细胞毒性cd8⁺t淋巴细胞，nk细胞发起针对肿瘤细胞的细胞毒性而不需要之前的敏化作用，并且还可以根除mhc-i阴性细胞(narni-mancinellie等人intimmunol[国际免疫学]201123:427-431)。nk细胞是更安全的效应细胞，因为它们避免了细胞因子风暴的潜在致命并发症(morganra等人molther[分子治疗]201018:843-851)、肿瘤溶解综合征(porterdl等人nengljmed[新英格兰医学杂志]2011365:725-733)、以及中靶脱肿瘤(off-tumor)效应。

治疗方法

表达披露的car的免疫效应细胞抑制同种异体反应性供体细胞，例如t细胞，并且预防gvhd。因此，可以将披露的car施用于处于gvhd风险的任何受试者。在一些实施例中，受试者接受骨髓移植，并且披露的car修饰的免疫效应细胞抑制供体t细胞或树突细胞的同种异体反应性。

披露的car修饰的免疫效应细胞可以单独施用，或作为与稀释剂和/或与其他组分(例如il-2、il-15、或其他细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物施用。

在一些实施例中，与er应激阻断物(靶向ire-1/xbp-1途径的化合物(例如b-i09))组合施用披露的car修饰的免疫效应细胞。在一些实施例中，与jak2抑制剂、stat3抑制剂、极光激酶抑制剂、mtor抑制剂、或其任何组合进行组合来施用披露的car修饰的免疫效应细胞。

简而言之，药物组合物可以包含如本文所述的靶细胞群体与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，配制本披露的方法中使用的组合物以静脉内施用。可以按适合治疗mm的任何方式施用药物组合物。将按此类因素(如患者的状况以及患者疾病的严重程度)确定施用的量和频率，尽管可以通过临床试验确定适当的剂量。

当指示“治疗量”时，可以由医师考虑年龄、体重、移植的程度、和患者(受试者)的状况的个体差异来确定要施用的本发明的组合物的精确量。总体上可以说明，可以按10⁴至10⁹个细胞/kg体重，例如10⁵至10⁶个细胞/kg体重(包括哪些范围内的所有整数值)的剂量，施用包含本文所述的t细胞的药物组合物。还可以按这些剂量多次施用t细胞组合物。可以通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术施用这些细胞(参见例如rosenberg等人，neweng.j.ofmed.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。可以由医药领域技术人员通过监测患者的疾病迹象并且相应地调整治疗，容易地确定用于具体患者的最佳剂量和治疗方案。

在某些实施例中，可能希望向受试者施用激活的t细胞，并且然后重新抽血(或进行单采血液成分术)，由此根据披露的方法激活t细胞，并且将这些激活并扩增的t细胞重新输注至患者。此过程可以每几周进行多次。在某些实施例中，可以从10cc至400cc的抽血来激活t细胞。在某些实施例中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc的抽血来激活t细胞。使用此多次抽血/多次重新输注方案可以选择出某些t细胞群。

可以按任何方便的方式，包括通过注射、输血、或植入，来施用披露的组合物。可以将本文所述的组合物皮下地、皮内地、结内地、髓内地、肌内地、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内地施用于患者。在一些实施例中，通过皮内或皮下注射，将披露的组合物施用于患者。在一些实施例中，通过i.v.注射，施用披露的组合物。还可以将组合物直接注射到移植的部位。

在某些实施例中，与(例如在其之前、同时或之后)任何数量的相关治疗方式(包括但不限于沙利度胺、地塞米松、硼替佐米、和来那度胺)结合，将披露的car修饰的免疫效应细胞施用于患者。在另外的实施例中，可以与化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和fk506)、抗体、或其他免疫去除剂(例如campath)、抗cd3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、fk506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子、和辐射组合使用car修饰的免疫效应细胞。在一些实施例中，与(例如在其之前、同时或之后)骨髓移植、使用化学治疗剂(例如氟达拉滨)的t细胞去除疗法、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺、或抗体(例如okt3或campath)结合，向患者施用car修饰的免疫效应细胞。在另一个实施例中，在b细胞去除疗法(例如与cd20反应的药剂，例如美罗华)后，施用本发明的细胞组合物。例如，在一些实施例中，受试者可以经历标准治疗，其中高剂量化疗之后是外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施例中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

关于作为“活的治疗剂”的形式的car-t细胞的一个主要问题是，它们在体内的可操纵性和它们潜在的免疫刺激副作用。为了更好地控制car-t疗法并且防止不需要的副作用，已经将多种特征工程化，包括关闭开关、安全机制、和条件控制机制。例如，将自毁以及标记(marked/tagged)的car-t细胞工程化以具有促进car表达t细胞的清除的“关闭开关”。自毁car-t含有car，但是也被工程化以表达当施用外源分子时可诱导的促凋亡自杀基因或“消除基因”。出于此目的，可以采用多种自杀基因，包括hsv-tk(单纯疱疹病毒的胸苷激酶)、fas、icasp9(可诱导的半胱天冬酶9)、cd20、myctag、和截短的egfr(内皮生长因子受体)。例如，hsk会将前药更昔洛韦(gcv)转化为gcv三磷酸盐，该gcv三磷酸盐将自身合并到复制型dna中，最终导致细胞死亡。icasp9是含有结合小分子ap1903的fk506结合蛋白组分的嵌合蛋白，导致半胱天冬酶9二聚化和凋亡。然而，标记的(marked/tagged)car-t细胞是具有car但被工程化以表达选择标记的t细胞。施用针对此选择标记的mab将促进car-t细胞的清除。截短的egfr是这样一种抗egfrmab可靶向的抗原，并且施用西妥昔单抗可促进car-t细胞的消除。产生的具有这些特征的car也称为scar(针对“可开关的car”)，和rcar(针对“可调节的car”)。“安全性car”也称为“抑制性car”(icar)，其被工程化以表达两个抗原结合结构域。这些细胞外结构域中的一个针对第一抗原并且结合细胞内共刺激结构域和刺激结构域。然而，第二细胞外抗原结合结构域对正常组织具有特异性并且结合细胞内检查点结构域，例如ctla4、pd1、或cd45。也可以将多个细胞内抑制结构域合并到icar中。可以提供这些抑制性结构域的一些抑制性分子包括b7-h1、b7-1、cd160、pih、2b4、ceacam(ceacam-1、ceacam-3、和/或ceacam-5)、lag-3、tigit、btla、lair1、和tgfβ-r。在正常组织存在的情况下，此第二抗原结合结构域的刺激将起到抑制car的作用。应注意，由于此双重抗原特异性，icar还处于双特异性car-t细胞的形式。安全性car-t工程化增强了car-t细胞对组织的特异性，并且在以下情况中是有利的，其中某些正常组织可以表达极低水平的抗原，该抗原将导致在标准car下的脱靶效应(morgan2010)。条件cart细胞表达与细胞内共刺激结构域和单独的细胞内共刺激因子连接的细胞外抗原结合结构域。以这样一种方式将共刺激结构域序列和刺激结构域序列工程化，该方式使得当施用外源分子时，所得蛋白将在细胞内聚集在一起以完成car回路。以这种方式，可以调节car-t激活，并且甚至可能针对具体患者‘微调’或个性化。类似于双重car设计，当在条件car中无活性时，将刺激结构域和共刺激结构域物理上分开；出于此理由，这些也称为“分开的car”。

典型地，使用α-βt细胞，然而也可以使用γ-δt细胞，产生car-t细胞。在一些实施例中，用于产生car-t细胞的描述的car构建体、结构域、和工程化的特征可以类似地用于产生其他类型的car表达免疫细胞，包括nk(自然杀伤)细胞、b细胞、肥大细胞、骨髓来源的吞噬细胞、和nkt细胞。可替代地，可以产生car表达细胞以具有t细胞和nk细胞二者的特性。在一个另外的实施例中，用car转导可以是自体的或同种异体的。

可以使用几种不同的car表达方法，包括逆转录病毒转导(包括γ-逆转录病毒)、慢病毒转导、转座子/转座酶(睡美人(sleepingbeauty)和piggybac系统)、以及信使rna转移介导的基因表达。相对于将car-t细胞工程化的可能性，基因编辑(基因插入或基因缺失/破坏)也已经变得越来越重要。crispr-cas9、zfn(锌指核酸酶)、和talen(转录激活子样效应核酸酶)系统是通过其可以产生car-t细胞的三种潜在方法。

定义

术语“氨基酸序列”是指表示氨基酸残基的缩写、字母、字符或单词的列表。本文使用的氨基酸缩写是氨基酸的常规单字母代码，并表示如下：a，丙氨酸；b，天冬酰胺或天冬氨酸；c，半胱氨酸；d，天冬氨酸；e，谷氨酸盐、谷氨酸；f，苯丙氨酸；g，甘氨酸；h，组氨酸；i，异亮氨酸；k，赖氨酸；l，亮氨酸；m，甲硫氨酸；n，天冬酰胺；p，脯氨酸；q，谷氨酰胺；r，精氨酸；s，丝氨酸；t，苏氨酸；v，缬氨酸；w，色氨酸；y，酪氨酸；z，谷氨酰胺或谷氨酸。

术语“抗体”是指免疫球蛋白、维持特异性结合能力的其衍生物、以及具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的蛋白。这些蛋白可以源自天然来源，或可以部分或全部经合成产生。抗体可以是单克隆的或多克隆的。这些抗体可以是来自任何物种的任何免疫球蛋白类别的成员，包括人类别的任何成员：igg、igm、iga、igd、和ige。在示例性实施例中，与本文所述的方法和组合物一起使用的抗体是igg类别的衍生物。除了完整免疫球蛋白分子以外，还包括在术语“抗体”中的是那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及选择性结合靶抗原的、免疫球蛋白分子的人形式或人源化形式。

术语“抗体片段”是指小于全长的抗体的任何衍生物。在示例性实施例中，抗体片段至少保留了具有全长抗体的特异性结合能力的重要部分。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab′、f(ab′)2、scfv、fv、dsfv双抗体、fc、和fd片段。可以通过任何手段产生抗体片段。例如，可以通过完整抗体的片段化，酶促地或化学地产生抗体片段，它可以从编码部分抗体序列的基因重组产生，或它可以全部或部分经合成产生。抗体片段可以任选地是单链抗体片段。可替代地，片段可以包含例如由二硫键连接在一起的多个链。片段还可以任选地是多分子复合物。功能抗体片段将典型地包含至少约50个氨基酸，并且更典型地将包含至少约200个氨基酸。

术语“抗原结合位点”是指特异性结合抗原上的表位的抗体区域。

术语“适配体”是指结合特定靶分子的寡核酸或肽分子。这些分子通常选自随机序列库。选择的适配体能够适配特有的三级结构并且以高亲和力和特异性识别靶分子。“核酸适配体”是经由其构象结合靶分子，并且由此抑制(inhibit或suppress)此类分子的功能的dna或rna寡核酸。可以由dna、rna或其组合构成核酸适配体。“肽适配体”是具有插入到恒定支架蛋白内的可变肽序列的组合蛋白分子。典型地在严格酵母双杂交条件下进行肽适配体的鉴定，这增强了选择的肽适配体在细胞内环境中稳定表达并且正确折叠的可能性。

术语“载体”意指化合物、组合物、物质、或结构，当与化合物或组合物组合时，它们有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性、或任何其他特征用于其预期用途或目的。例如，可以选择载体以最小化活性成分的任何降解，并且最小化受试者中的任何不良副作用。

术语“嵌合分子”是指通过连接以其天然状态分开存在的两个或更多个分子而产生的单个分子。该单个嵌合的分子具有全部其组分分子的所希望的功能性。一种类型的嵌合分子是融合蛋白。

术语“工程化的抗体”是指重组分子，该重组分子至少包含抗体片段(该抗体片段包含源自抗体的重链和/或轻链的可变结构域的抗原结合位点)，并且可以任选地包含来自ig类别(例如iga、igd、ige、igg、igm和igy)中任一项的抗体的可变结构域和/或恒定结构域的全部或一部分。

术语“表位”是指抗体优先并且特异性结合的抗原区域。单克隆抗体优先结合分子的单个特定表位，该分子可以被分子地进行定义。在本发明中，可以由多特异性抗体识别多个表位。

术语“融合蛋白”是指通过用肽键连接两个或更多个多肽而形成的多肽，该肽键在一个多肽的氨基末端和另一个多肽的羧基末端之间形成。可以通过组分多肽的化学偶联形成融合蛋白，或它可以由编码单个连续融合蛋白的核酸序列表达为单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽骨架的融合蛋白。可以使用分子生物学中将框内的两个基因连接成单个核酸的常规技术，并且然后在产生融合蛋白的条件下在适当宿主细胞中表达该核酸，来制备融合蛋白。

术语“fab片段”是指包含通过用木瓜蛋白酶切割抗体产生的抗原结合位点的抗体片段，该木瓜蛋白酶在绞链区n-末端切割h链间二硫键并且从一个抗体分子产生两个fab片段。

术语“f(ab′)2片段”是指含有通过用胃蛋白酶切割抗体分子产生的两个抗原结合位点的抗体片段，该胃蛋白酶在绞链区c-末端切割h链间二硫键。

术语“fc片段”是指包含其重链的恒定结构域的抗体片段。

术语“fv片段”是指包含其重链和轻链的可变结构域的抗体片段。

“基因构建体”是指核酸，例如载体、质粒、病毒基因组等，其包括多肽的“编码序列”，或其另外可转录为生物活性rna(例如反义、诱饵、核酶等)，可以转染到细胞中，例如在某些实施例中，转染到哺乳动物细胞中，并且可以使编码序列在用该构建体转染的细胞中表达。基因构建体可以包括可操作地连接至编码序列、以及内含子序列、聚腺苷酸化位点、复制起点、标记基因等的一个或多个调节元件。

术语“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较可出于比较目的比对的每个序列中的位置来确定同一性。当比较的序列中的位置被相同碱基占据时，则这些分子在那个位置处具有同一性。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列共享的位置处相同或匹配的核苷酸的数目的函数。可以使用不同比对算法和/或程序来计算两个序列之间的同一性，包括可用作gcg序列分析包(威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州)的一部分的fasta或blast，并且可以与例如默认设置一起使用。例如，考虑了与本文所述的具体多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选表现出基本上相同的功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。除非另外指明，相似性评分将基于blosum62的使用。当使用blastp时，相似性百分比基于blastp阳性评分，并且序列同一性百分比基于blastp同一性评分。blastp“同一性”示出相同的高评分序列对中的总残基的数量和分数；并且blastp“阳性”示出比对评分具有正值并且彼此相似的残基的数量和分数。本披露考虑并且涵盖了与本文披露的氨基酸序列具有这些程度的同一性或相似性或任何中间程度的同一性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导出相似多肽的多核苷酸序列，并且其可以通过常规手段获得，特别是通过使用遗传密码将其氨基酸序列反向翻译。

术语“接头”是本领域公认的，并且是指连接两个化合物(例如两个多肽)的分子或分子组。接头可以包含单个连接分子，或可以包含连接分子和间隔子分子，间隔子分子旨在将连接分子和化合物分开特定距离。

术语“多价抗体”是指包含多于一个抗原识别位点的抗体或工程化的抗体。例如，“二价”抗体具有两个抗原识别位点，而“四价”抗体具有四个抗原是别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相对)。例如，“单特异性”抗体的抗原识别位点都结合相同表位。“双特异性”抗体具有结合第一表位的至少一个抗原识别位点和结合不同于第一表位的第二表位的至少一个抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有都结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点，其中的一些结合第一表位并且其中的一些结合不同于第一表位的第二表位。

术语“核酸”是指包含单个核苷酸或两个或更多个核苷酸的天然或合成分子，该两个或更多个核苷酸通过在一个核苷酸的3'位置处的磷酸基团连接至另一个核苷酸的5’末端。核酸的长度并没有限制，并且因此核酸可以包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。

术语“可操作地连接至”是指核酸与另一个核酸序列的功能关系。启动子、增强子、转录和翻译终止位点、以及其他信号序列是可操作地连接至其他序列的核酸序列的实例。例如，dna与转录控制元件的可操作连接是指dna和启动子之间的物理关系和功能关系，使得通过特异性识别、结合并且转录该dna的rna聚合酶，从启动子启动此类dna的转录。

术语“肽”、“蛋白”、和“多肽”可互换使用，是指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成的分子，该两个或更多个氨基酸由一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的α氨基基团连接。

术语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，它们在合理医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。

当关于具体多肽使用时，术语“多肽片段”或“片段”是指与参考氨基酸自身相比，其中缺失氨基酸残基、但其中剩余氨基酸序列通常与参考多肽的氨基酸序列相同的多肽。此类缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端处，或可替代地发生在以上二者处。片段典型地是至少约5、6、8或10个氨基酸长，至少约14个氨基酸长，至少约20、30、40或50个氨基酸长，至少约75个氨基酸长，或至少约100、150、200、300、500或更多个氨基酸长。片段可以保留参考多肽的一种或多种生物活性。在不同实施例中，片段可以包含参考多肽的酶活性和/或相互作用位点。在另一个实施例中，片段可以具有免疫原性特性。

术语“蛋白质结构域”是指蛋白质的一个部分、蛋白质的多个部分、或示出结构整体性的整个蛋白质；这一测定可以基于蛋白质的一个部分、蛋白质的多个部分、或整个蛋白质的氨基酸组成。

术语“单链可变片段或scfv”是指其中连接了重链结构域和轻链结构域的fv片段。可以将一个或多个scfv片段连接至其他抗体片段(例如重链或轻链的恒定结构域)，以形成具有一个或多个抗原识别位点的抗体构建体。

如本文使用的“间隔子”是指连接包含融合蛋白的蛋白的肽。通常，除连接蛋白或保存它们之间的最小距离或其他空间关系以外，间隔子不具有特定的生物活性。然而，可以选择间隔子的组成氨基酸，以影响分子的一些特性，例如分子的折叠、净电荷、或疏水性。

如本文使用的，当关于多肽(包括抗体)或受体时，术语“特异性结合”是指在蛋白的异质群体和其他生物制剂中，决定蛋白或多肽或受体的存在的结合反应。因此，在指定条件(例如在抗体的情况下，免疫测定条件)下，当特定的配体或抗体不以显著量结合样品中存在的其他蛋白或结合生物体中配体或抗体可以接触的其他蛋白时，特定的配体或抗体“特异性结合”其特定“靶标”(例如，抗体特异性结合内皮抗原)。通常，“特异性结合”第二分子的第一分子具有与该第二分子的大于约10⁵m^-1(例如10⁶m^-1、10⁷m^-1、10⁸m^-1、10⁹m^-1、10¹⁰m^-1、10¹¹m^-1、和10¹²m^-1或更大)的亲和力常数(ka)。

如本文使用的，术语“特异性递送”是指分子与携带特定靶分子或标记的细胞或组织的优先缔合，并且不与缺乏该靶分子的细胞或组织缔合。当然，已经认识到某种程度的非特异性相互作用可以发生在分子和非靶细胞或组织之间。尽管如此，特异性递送可以通过靶分子的特异性识别介导来区分。典型地，特异性递送导致递送的分子和携带靶分子的细胞之间的缔合比递送的分子和缺乏靶分子的细胞之间的缔合强的多。

术语“受试者”是指作为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医师，例如医师的治疗下的受试者。

术语“治疗有效的”是指使用的组合物的量是足以改善疾病或障碍的一种或多种原因或症状的量。此类改善仅需要减少或改变，并不需要消除。

术语“转化”和“转染”意指将核酸(例如表达载体)引入接受者细胞，包括将核酸引入所述细胞的染色体dna中。

术语“治疗”是指患者的医疗管理，其中有意治愈、改善、稳定、或预防疾病、病理病症、或障碍。此术语包括积极治疗，即治疗特异性针对疾病、病理病症、或障碍的改善，并且还包括病因治疗，即治疗针对相关疾病、病理病症、或障碍的病因的去除。此外，此术语包括姑息治疗，即设计治疗用于减轻症状而不是治愈疾病、病理病症、或障碍；预防治疗，即治疗针对将相关疾病、病理病症、或障碍的发展最小化或部分或完全抑制其发展；和支持性治疗，即治疗用于补充针对相关疾病、病理病症、或障碍的改善的另一种特定治疗。

术语“变体”是指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(即简并变体)、每个编码氨基酸的密码子(即dna和rna)的摆动位置内的取代的氨基酸或肽序列，添加至肽的c-末端的氨基酸，或与参考序列具有60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的肽。

术语“载体”是指能够转运已经与载体序列连接的另一种核酸到细胞中的核酸序列。术语“表达载体”包括含有处于适合细胞表达的形式(例如连接至转录控制元件)的基因构建体的任何载体(例如质粒、粘粒或噬菌体染色体)。

已经描述了本发明的许多实施例。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可做出诸多改变。因此，其他实施例也处于以下权利要求书的范围内。

实例

实例1：新型人cd83嵌合抗原受体t细胞预防gvhd同时维持供体抗肿瘤免疫性

介绍

同种异体-hct是伴随针对高风险血液恶性肿瘤和骨髓衰竭综合征的治愈性目的而进行的程序。全世界每年有30,000个患者接受同种异体-hct，并且尽管存在标准药理学免疫抑制，仍有34％-89％的患者发展为急性gvhd(cutlerc.等人，blood[血液]2014124:1372-1377；pidalaj.等人，haematologica[血液学]201297:1882-1889)。现行方法是广泛使用抑制性钙调磷酸酶抑制剂与甲氨蝶呤、西罗莫司、或霉酚酸酯的组合来预防gvhd。尽管已知有益gvl的脱靶损害和有限的耐受性诱导(zeiserr.等人，blood[血液]2006108:390-399)，但是钙调磷酸酶抑制剂已经包括在gvhd预防和治疗中持续了超过30年(powlesr.l.等人，lancet[柳叶刀]19782:1327-1331；storbr.等人，blood[血液]198668:119-125；storbr.等人，nengljmed[新英格兰医学杂志]1986314:729-735)。尽管在供体和移植物来源选择方面取得进步(pidalaj.等人，blood[血液]2014124:2596-2606；anasettic.等人，nengljmed[新英格兰医学杂志]2012367:1487-1496)，但是接受者伴随疾病的评估(sorrorm.l.等人，blood[血液]2004104:961-968；thakarm.等人，blood.[血液]2019133(7):754-762)和调理方案已经改善了同种异体-hct的结果(solhm.m.等人，biolbloodmarrowtransplant.[血液和骨髓移植生物学]2018年9月19日；scottb.l.等人，jclinoncol[临床肿瘤学杂志]201735:1154-1161)，令人惊奇的是，钙调磷酸酶抑制剂仍然是当今gvhd预防的普遍免疫抑制骨架(cutlerc.等人，blood[血液]2014124:1372-1377)。

除了钙调磷酸酶抑制剂以外，基于细胞的免疫抑制越来越多地在gvhd预防中进行研究。部分地，基于细胞(例如treg)的策略提供了同种异体反应性t细胞的强效且潜在的抗原特异性抑制(veerapathrana.等人，blood[血液]2011118:5671-5680；veerapathrana.等人，blood[血液]2013122:2251-2261)。将treg合并到gvhd预防中的过去的临床试验已经证明，细胞介导的免疫抑制向供体t细胞递送了安全并且有效的控制，而不损害gvl(brunsteinc.g.等人，blood[血液]2011117:1061-1070；brunsteinc.g.等人，blood[血液]2016127:1044-1051；kellnerj.n.等人，oncotarget[肿瘤靶标]20189:35611-35622)。临床前和临床证据也支持新型细胞产品(包括自然杀伤(nk)细胞、恒定型nkt细胞、髓源性抑制细胞、和2型先天淋巴细胞)的转化潜力，从而减轻gvhd并且保留gvl(ruggeril.等人，science[科学]2002295:2097-2100；olsonj.a.等人，blood[血液]2010115:4293-4301；asaio.等人，jclininvest[临床研究杂志]1998101:1835-1842；duj.等人，blood[血液]2017129(23):3121-3125；highfills.l.等人，blood[血液]2010116:5738-5747；bruced.w.等人，jclininvest[临床研究杂志]2017127:1813-1825)。现在，这些细胞产品仍大部分在进行研究，尽管在临床环境中已经广泛研究了nk细胞。最近，cart细胞已经展示了在难治性急性淋巴母细胞性白血病和弥漫性大b细胞淋巴瘤中的空前的活性(neelapus.s.等人，nengljmed[新英格兰医学杂志]2017377:2531-2544；schusters.j.等人，nengljmed[新英格兰医学杂志]2019380:45-56；maudes.l.等人，nengljmed[新英格兰医学杂志]2018378:439-448)。因此，fda指示授予了cd19cart细胞用于这些高风险血液恶性肿瘤中。尽管这些cart细胞确实具有细胞溶解作用并且决不具有免疫抑制，但是它们确实突出了cart细胞在靶向gvhd发病机制的媒介物方面的潜在作用。此外，cart细胞是独特的，因为当在同种异体-hct后作为供体来源的产品施用时，它们具有降低的引发gvhd的能力(ghosha.等人，natmed[自然医学]201723:242-249)。

cd83代表用来消除炎症性树突细胞以及同种异体反应性供体t细胞的临床相关靶标。cd83是免疫球蛋白超家族的蛋白成员并且在激活的人树突细胞的表面上表达(jux.等人，jimmunol[免疫学杂志]2016197:4613-4625)。cd83还在被同种异体抗原刺激后，在人t细胞上表达，并且存在于患有gvhd的患者体内的循环t细胞上(jux.等人，jimmunol[免疫学杂志]2016197:4613-4625)。用单克隆抗体靶向cd83减轻了小鼠中的异种gvhd，而不损害gvl或针对致病病毒的t细胞应答(wilsonj.等人，jexpmed[实验医学杂志]2009206:387-398)。然而，抗体的免疫抑制效应是暂时的并且取决于nk细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(adcc)(wilsonj.等人，jexpmed[实验医学杂志]2009206:387-398；seldont.a.等人，leukemia[白血病]201630:692-700)。

为了克服cd83的抗体靶向的限制，设计了cd83cart细胞。此实例描述了人cd83cart细胞的产生及其在gvhd预防中的临床前功效。不同于单克隆抗体，cd83cart细胞并不需要adcc来杀死其靶标。此外，cd83cart细胞提供了在人t细胞介导的异种gvhd模型中的持久gvhd预防，即使在细胞的单次输注后。部分地，披露的car利用了cd83在激活的tconv对比tregs上的差异表达。因此，cd83cart细胞消除了致病th1细胞，并且显著增加了体内treg与tconv的比率。此外，cd83cart细胞允许供体t细胞的强效抗肿瘤免疫性。cd83cart细胞表示用于gvhd预防的新的基于细胞的方法，并且递送持久且选择性免疫抑制，而不需要广泛起作用的钙调磷酸酶抑制剂。

材料与方法

研究设计。这是用于gvhd预防的新的人cd83cart细胞的设计、产生、和功效的临床前研究。研究的第一部分描述了car构建体以及cd83cart细胞关于表型、细胞因子产生、中靶杀伤、和响应于cd83+靶标的增殖的体外活性。接下来展示的是使用标准allomlr，体外cd83cart细胞的免疫抑制作用。另外，cd83表达是在示出cd83在tconv对比treg细胞上的差异表达的人t细胞中的量度。在人t细胞介导的异种gvhd模型中(bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587；bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372)；bettsb.c.等人，frontimmunol.[免疫学前沿]20189:2887)，证明了cd83car在gvhd预防中的临床前功效。这包括cd83+树突细胞和tconv的体内靶标杀伤的全面评估。还示出了cd83cart细胞对体内不同t细胞子集的作用。最后，使用为在体内产生人肿瘤特异性cd8ctl而建立的异种模型，示出cd83cart细胞不伤害供体抗肿瘤免疫性(bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587；bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372)；bettsb.c.等人，frontimmunol.[免疫学前沿]20189:2887)，并且在体外使用xcelligencertca(实时细胞分析)系统测试了由ctl进行的杀伤(lig.等人，jciinsight.[jci洞察力]20183(18))。

cd83cart细胞构建体和产生。[请提供]

单克隆抗体和流式细胞术。荧光染料缀合的小鼠抗人单克隆抗体包括抗cd3、cd4、cd25、cd83、cd127、mhcii、foxp3、ki-67、ifnγ、il-17a、和il-4(bd生物科学公司(bdbiosciences)，圣何塞(sanjose)，加利福尼亚州，美国；e生物科学公司(ebioscience)，圣何塞(sanjose)，加利福尼亚州，美国；细胞信号转导技术公司(cellsignalingtechnology)，波士顿，马萨诸塞州，美国)。使用活的或死的可固定黄色或浅绿色死细胞染色(生命技术公司(lifetechnologies)，格兰德岛，纽约州)来确定活力。在bdfacscantoii流式细胞仪(flowjo软件，7.6.4版；treestar，亚什兰集团公司(ashland)，俄勒冈州，美国)上获取现场事件。

细胞因子免疫测定。将cd83car和模拟物转导的t细胞(1x10⁶个)与cd83+modc(1x10⁵个)一起共培养24小时。收获上清液并且使用simpleplex测定试剂盒(r&d系统公司(r&dsystems)在ella机器(proteinsimple公司)上进行分析。遵循制造商的说明书(47)。

人cd83cart细胞体外增殖。将每孔归一化数量(1或2x10⁶个)的人cd83cart细胞与2x10⁵个cd83+modc在非组织培养处理的6孔板中以一式三份共培养。使细胞在补充有60iu/mlil-2的人t细胞完全培养基中生长并且每2至3天分开，或无论何时，只要培养基变黄就分开。每天或每2至4天(t分离为第0天)在细胞计数器(伯乐公司(bio-rad))上在台盼蓝染色下测量每个孔中的细胞活力和总细胞数。

体外allomlr。人单核细胞来源的树突细胞(modc)是细胞因子产生的、分化的、并且成熟的，如(bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372))所述。在补充有10％热灭活的合并的人血清的100ul完全rpmi中，将从白细胞浓缩物(oneblood公司或纪忆血液中心(memorialbloodcenter))纯化的纯化的t细胞(10⁵)与同种异体modc一起培养(t细胞:dc比率30:1)。按car与dc比率的范围，将cd83car、cd19car或模拟物转导的t细胞(相对于t细胞供体是自体的)添加至allomlr。在5天后，通过ki-67表达来测量t细胞增殖。

cd83表达时程。用同种异体modc(t细胞:dc比率30:1)或cd3/cd28珠(t细胞:珠比率30:1)刺激纯化的人t细胞。在培养4、8、24、和48小时时，在96孔板中，从一式三个的孔收获t细胞。染色t细胞的cd3、cd4、cd127、cd25、和cd83，然后固定。在激活的tconv(cd3⁺、cd4⁺、cd127⁺、cd25⁺)(38)、treg(cd3⁺、cd4⁺、cd127^-、cd25⁺)(38)、和cd8t细胞(cd3⁺、cd4^-)中评估cd83表达。

异种gvhd模型。在moffitt/usf动物饲养所维持的iacuc批准的动物栖息地内饲养nodscidγ(nsg)小鼠(雄性或雌性，6-24周龄)。在移植的第0天，接受者小鼠接受一次25x10⁶个新鲜的人pbmc(oneblood公司)。如所指示，小鼠接受单独的pbmc、pbmc加上cd83cart细胞(低剂量：1x10⁶个，或高剂量：10x10⁶)、或pbmc加上模拟物转导的t细胞(10x10⁶个)。用不同人pbmc供体进行每个独立的实验，其中cart细胞和模拟物转导的t细胞源自pbmc供体。监测小鼠的gvhd临床评分和濒死前状态。在有指示的情况下，在第+21天经由人道安乐死完成短期实验，以评估gvhd靶器官病理学(bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587；bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372)；bettsb.c.等人，frontimmunol.[免疫学前沿]20189:2887)、组织驻留淋巴细胞、以及鼠脾内的人dc和t细胞子集的含量。这些小鼠移植有pbmc(25x10⁶个)，移植有或未移植有cd83cart细胞(1x10⁶个)或模拟物转导的t细胞(1x10⁶个)。所有脊椎动物操作在aicuc批准的方案下进行。

人抗肿瘤ctl的体内产生。nsg小鼠移植有人pbmc(25x10⁶个)，移植有或未移植有cd83cart细胞(1x10⁶个)或模拟物转导的t细胞(1x10⁶个)。另外，在第0天和第+7天，接受者小鼠接受经辐射的k562细胞(10⁷个/小鼠)的接种物(bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587；bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372)；bettsb.c.等人，frontimmunol.[免疫学前沿]20189:2887)。在第+12天将小鼠人道安乐死，并且收获脾，并且通过磁珠分离来分离人cd8⁺t细胞。将纯化的人cd8t细胞与新鲜k562细胞按10:1的e/t比率共培养，并且使用xcelligencertca系统监测靶细胞杀伤(lig.等人，jciinsight.[jci洞察力]20183(18))。

统计学分析。将数据报告为平均值±sem。使用方差分析进行组比较，包括具有用于多重比较的校正的邓尼特或西达克事后检验。为了比较存活曲线，使用时序检验。使用prism软件5.04版(graphpad公司)进行统计分析。用p<0.05(双尾)定义统计显著性。

结果

人cd83car构建体的示意图。基于抗cd83抗体c312的单链可变片段设计cd83cart细胞(wilsonj.等人，jexpmed[实验医学杂志]2009206:387-398)。cd83cart细胞构建体使用41bb共刺激结构域和cd3ζ激活结构域。为了促进追踪cart细胞，构建体含有egfp标签，该标记可以用于在正常非cart细胞中鉴定cart细胞。靶向cd83的cart细胞被逆转录病毒转导并完全按照已发表的方法产生(图1)(lig.等人，methodsmolbiol[分子生物学方法]20171514:111-118)。

人cd83cart细胞的表征。cd83car构建体表现出高度的转导效率，其中在产生后，超过60％的t细胞表达egfp(图2a)。尽管两组之间的cd4表达是相似的，但是与模拟物转导的t细胞相比，在cd83cart细胞中观察到cd8表达显著减少(图2b)。然而，当与细胞因子成熟的cd83⁺人modc一起培养时，cd83cart细胞展示了稳健的ifnγ生产(图2c)。另外，与模拟物转导的t细胞相比，cd83cart细胞展示了对cd83⁺modc的强效的杀伤和增殖(图2d、2e)。在这些实验中，靶标modc与t细胞是同种异体的，因此模拟物转导的t细胞的基线溶解和增殖代表了基线同种异体反应性(图2d、2e)。

人cd83cart细胞减小同种异体反应性。为了测试人cd83cart是否可以在体外减小同种异体反应性，研究了它们在同种异体混合型白细胞反应(allomlr)中的抑制功能。从健康供体人t细胞产生cd83cart细胞和模拟物转导的cart细胞。因为cd19cart细胞靶向b细胞，因此也测试了allomlr中的无关细胞类型作为另外的对照。cd19和cd83cart细胞是相似的，其中它们都接受经由41bb的共刺激。将cart细胞添加至由以下组成的5日allomlr中：自体的未转导的t细胞(1x10⁵个)和同种异体的、细胞因子成熟的cd83⁺modc(3.33x10³个)。cart细胞:modc比率范围是从3:1至1:10。在3:1至1:3的目标比率下，cd83cart强烈减少同种异体反应性增殖(图3，上部小图)。模拟物转导的cart细胞和cd19cart细胞对同种异体反应性t细胞不具有抑制作用(图3，中部和下部小图)。此外，cd19cart细胞对照组示出，cd83cart细胞对同种异体反应性t细胞的抑制与互相杀伤无关(图3，上部和下部小图)。

与treg相比，cd83在激活的人tcon上差异性表达。cd83是人树突细胞成熟的确定标志物，并且其也在激活的人b细胞上表达。使用cd83报告基因小鼠系统，先前示出cd83的鼠b细胞表达主要受限于晚期的前b细胞(lechmannm.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2008105:11887-11892)。此外，在来自报告基因小鼠的t细胞上发现了cd83(lechmannm.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2008105:11887-11892)。已知在刺激后，cd83在人t细胞上表达，并且在同种异体-hct后，其可在循环t细胞上检测到(jux.等人，jimmunol[免疫学杂志]2016197:4613-4625)。然而，cd83在treg对比tconv上的精确表达是不清楚的。如本文披露的，cd83的人t细胞表达伴随刺激发生，该刺激包括同种异体树突细胞或cd3/cd28珠(图3a-3d)。重要地，与免疫抑制性cd4⁺treg相比，cd83在人cd4+tconv上差异性表达，这响应于dc-同种异体激活(图3c)。cd83的cd4⁺tconv表达在dc-同种异体刺激后4-8小时达到峰值，并且到48小时下降至基线水平，其中在treg上观察到最小量(图3c)。在超生理cd3/cd28珠的刺激下，cd83的表达更加丰富，该刺激还引起到48小时的激活时，在treg上的cd83表达的晚期增加(图3d)。尽管据报道在鼠cd8+t细胞上表达(jux.等人，jimmunol[免疫学杂志]2016197:4613-4625)，但是在dc-同种异体刺激或cd3/cd28珠激活后，在体外人cd8⁺t细胞上没有检测到显著量的cd83(图11a、11b)。

人cd83cart细胞预防异种gvhd。使用异种gvhd模型来评估体内人cd83cart细胞的功效。使用良好建立的nsg小鼠模型，其中都在第0天，使接受者接种有25x10⁶个人pbmc、加上1-10x10⁶个自体cd83cart细胞或模拟物转导的cart细胞。每天监测移植的小鼠的异种gvhd的临床迹象，直至第+100天。cd83cart细胞和模拟物转导的cart细胞在nsg小鼠中是安全的，与单独的pbmc相比，没有早期gvhd或毒性的任何证据(图5a、5b)。在移植后，与单独的pbmc或模拟物转导的cart细胞相比，cd83cart细胞显著改善了异种gvhd存活率(图5a)。另外，cd83cart细胞减小了异种gvhd临床严重性(图5b)。值得注意的是，在cd83cart细胞的两个剂量群组中的小鼠展示了90％或更好的3个月存活率(图5a)。在分开的实验中，移植的nsg小鼠接受单独的pbmc或模拟物转导的t细胞(1x10⁶个)或cd83cart细胞(1x10⁶个)，并且在第+21天使其人道安乐死以评估靶器官gvhd严重性。由不知情的专业病理学家确定gvhd评分。与单独的pbmc或模拟物转导的t细胞相比，cd83cart细胞基本上消除了在接受者肺(图6a、6b)和肝(图6c、6d)中被人t细胞引起的靶器官组织损伤。

人cd83cart显著减少体内循环的成熟cd83⁺dc。成熟的cd83+树突细胞与同种异体反应性供体t细胞的敏化作用有关。因此，我们确定了在移植的小鼠中，cd83cart细胞对人cd1c⁺dc的免疫恢复的作用。在第+21天，对用人pbmc、加上cd83cart细胞或模拟物转导的t细胞移植的nsg小鼠实施安乐死。当收获接受者脾时，清楚的是，cd83cart细胞减少了供体细胞的体内扩增，如该处理组中小得多的脾所示(图7)。在接受者小鼠中，cd83cart细胞显著减少了人cd1c⁺、cd83⁺dc的量(图8a、8b)。尽管在各实验组中表达mhcii类的cd1c⁺dc的比例是相似的，但是移植有cd83cart细胞的小鼠表现出总共显著更少的dc(图8c、8d)。使用egfp标签，证实了在第+21天，输注的人cd83cart细胞在鼠脾中是可检测的(图8e)。

人cd83cart细胞显著减少致病th1细胞并且增加treg:tconv比率。在第+21天，在用cd83cart细胞处理的小鼠的脾中，人cd4⁺的总量显著减少(图9a、9b)。随着在体外dc-同种异体刺激后存在显著量的cd83⁺、cd4⁺tconv，证实在第+21天，在用单独的pbmc或用模拟物转导的t细胞处理的小鼠中，cd83⁺tconv增加(图9c)。此外，在cd83cart细胞的接受者的体内，cd83⁺tconv的量显著减少(图9c)。在分开的实验中，nsg移植有单独的人t细胞或t细胞加上树突细胞。尽管缺乏树突细胞略微延迟了gvhd发作，但是在两个组中的中位gvhd存活率是相似的。因此，推测cd83cart主要通过消除牵涉gvhd的同种异体反应性tconv来保护接受者免于gvhd(图9c)。在第+21天，在所有试验组中，鼠脾中人treg的频率是相似的(图9d)。与总cd4⁺t细胞的减少相似，在用cd83cart细胞处理的小鼠中，treg的绝对数量显著减少(图9d、9e)。然而，在接受cd83cart细胞的小鼠中，treg与同种异体反应性tconv的比率显著增加(图9f)。th1细胞有助于gvhd发病机制。重要地，用cd83cart细胞处理的小鼠表现出人th1细胞的大幅减少(图9g、9h)。另外，在注射有cd83cart细胞的小鼠中，脾驻留的人th2细胞的量也显著减少(图9g、9i)。相反，与单独的pbmc或模拟物转导的car相比，cd83cart细胞不抑制鼠脾中人th17细胞的量。

人cd83cart细胞不伤害cd8+细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的抗肿瘤活性。如同cd4⁺t细胞，与注射有pbmc或模拟物转导的t细胞的小鼠相比，在用pbmc和cd83cart细胞处理的小鼠中，在第+21天，人cd8⁺t细胞的总量也显著减少(图10a)。为了测试cd83cart细胞如何影响供体抗肿瘤免疫性，通过用pbmc、随后是模拟物转导的t细胞或cd83cart细胞注射小鼠，在体内产生对k562具有特异性的人cd8ctl。在第0和+10天，小鼠还接受了经辐射的k562的接种物。在第+12天将小鼠人道安乐死，并且从接受者脾纯化cd8t细胞。使用xcelligence平台，体外评估针对新鲜k562细胞的特异性肿瘤溶解。与移植有单独的pbmc的对照小鼠相比，注射有人pbmc和经辐射的k562细胞的所有小鼠都展示出从它们的脾纯化的cd8ctl的完整杀伤作用(图10b)。有趣的是，与用单独的pbmc或模拟物转导的t细胞处理的小鼠相比，用人cd83cart细胞处理的小鼠表现出优异的cd8ctl介导的抗肿瘤活性(图10b)。

讨论

使用作为细胞免疫疗法的cart细胞来预防gvhd是一种创新策略，与药理学免疫抑制或供体treg的过继性转移不同。表达cd83的靶向细胞有效耗尽了移植接受者的炎症性成熟dc以及同种异体反应性cd4+t细胞。从机理上讲，同种异体反应性tconv的体内消除可以驱动这些cart细胞的功效，因为在分开的异种实验中，供体树突细胞耗尽并不减轻gvhd。此外，cd83cart细胞不损害人细胞溶解性cd8⁺t细胞的抗肿瘤活性。尽管在用cd83cart细胞处理的小鼠中cd8t细胞减少，但是来自这些小鼠的ctl展示了增强的肿瘤杀伤作用。cd83cart细胞对同种异体反应性t效应细胞的体内耗尽也介导了treg:激活的tconv比率的显著升高。

cd83cart细胞可在体内显著减少致病的人th1和th2细胞。使用敲除了stat4和stat6的供体t细胞的实验表明，th1和th2细胞独立介导小鼠中的致死gvhd(nikolicb.等人，jclininvest[临床研究杂志]2000105:1289-1298)。另外，体内th1和th2的组合协作地恶化鼠gvhd(nikolicb.等人，jclininvest[临床研究杂志]2000105:1289-1298)。部分地，th1和th2细胞分别引起对肠和肺的组织特异性损伤(yit.等人，blood[血液]2009114:3101-3112)。现在存在针对靶供体th1应答的新策略，并且这些新策略很大程度上由p40细胞因子中和或相关下游受体信号转导的抑制驱动(pidalaj.等人，haematologica[血液学]2018103:531-539；fuj.等人，jimmunol[免疫学杂志]2016196:3168-3179；bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587；bettsb.c.等人，scitranslmed.[科学转化医学]20179(372)；bettsb.c.等人，frontimmunol.[免疫学前沿]20189:2887)。然而，很少有方法同时靶向供体th1和th2细胞的致病性应答。相反，在jak2的背景下，相关信号传导分子针对th1和th2分化；其中和或抑制产生了对th1细胞的抑制，同时显著增加了th2细胞(bettsb.c.等人，procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]2018115:1582-1587)。因此，人cd83cart细胞代表一种同时抑制同种异体hct后的供体th1/th2应答的新颖细胞产品。

披露的数据支持人cd83cart细胞提供了针对激活的tconv和gvhd死亡的持久保护。尽管cd83不在人treg上显著表达，但是用人cd83cart细胞处理的小鼠表现出减少量的treg。这可以归因于cd4+t细胞前体有限可用于itreg分化，或循环供体t细胞的总体减少造成的il-2浓度减小。在啮齿动物中，cd83参与了体内treg的稳定性，并且携带cd83缺乏的treg的小鼠易患自身免疫综合征(doebbelerm.等人，jciinsight.[jci洞察力]20183(11))。然而，在异种移植实验中，与对照相比，在用cd83cart细胞处理的小鼠中，人treg与激活的tconv的比率显著增加。treg与tconv的比率增加是临床相关的免疫指标，并且甚至与针对treg指导的gvhd疗法的应答(例如低剂量il-2)相关(korethj.等人，blood[血液]2016128:130-137)。此外，人cd83cart细胞是良好耐受的并且消除了体内免疫介导的器官损伤。因此，cd83的作用在鼠和人treg中可能不同。

有趣的是，与对照相比，cd83cart细胞的接受者在其脾中具有相似量的人th17细胞。与th1细胞相比，th17细胞在gvhd发病机制中的作用更不清楚。在小鼠中，同种异体th17细胞可以诱导致死gvhd。供体t细胞rorγt(th17细胞的一种关键转录因子)的缺乏增大，但是并不消除gvhd(yuy.等人，blood[血液]2011118:5011-5020)。然而，当由黏膜相关恒定t(mait)细胞产生时，il-17a也可以在gvhd中起保护作用，这部分归因于调节t细胞激活的臂板蛋白6d和4b的减少(vareliasa.等人，jclininvest[临床研究杂志]2018128:1919-1936)。此外，在炎症性结肠炎的鼠模型中，il-17已经示出抑制th1应答(o'connor,jr.w.等人，natimmunol[自然免疫学]200910:603-609)。因此，cd83cart细胞对人th17细胞的保留可以参与gvhd死亡率的总体减小。

cd83是独特的免疫调节分子。在小鼠中，可溶性cd83通过借助吲哚胺2,3-双加氧酶机制和tgfβ机制增强treg应答来介导免疫抑制作用(bockf.等人，jimmunol[免疫学杂志]2013191:1965-1975)。还显示，人cd83的细胞外结构域损害体外同种异体反应性t细胞的增殖(lechmannm.等人，jexpmed[实验医学杂志]2001194:1813-1821)。相反，用单克隆抗体3c12c直接中和cd83显著减少了体内人t细胞介导的异种gvhd(wilsonj.等人，jexpmed[实验医学杂志]2009206:387-398)。cd83抗体还保留了treg和由供体人cd8+t细胞产生的抗病毒应答(seldont.a.等人，leukemia[白血病]201630:692-700)。这表明尽管可溶性cd83可能具有免疫抑制特性，但靶向cd83的细胞表面表达可以预防gvhd同时保留了关键效应子功能和treg功能。披露的cd83cart细胞不同于单克隆抗体3c12c。两种方法之间的最大功能差异在于，cd83cart细胞可杀死其靶标，而不需要nk细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(seldont.a.等人，leukemia[白血病]201630:692-700)。当需要迅速、有效地消除同种异体反应性t细胞和成熟dc来预防gvhd时，这是有利的。此外，cd83cart细胞的保护作用在移植后3个月可实现超过90％的存活率，而使用cd83单克隆抗体的公开数据限制了30天的保护作用，存活率为约50％。

总之，cd83cart细胞代表被设计用于预防gvhd的第一个程序化细胞溶解性效应细胞。cd83cart细胞在gvhd预防中的转化潜力，尽管预期在预防实体器官和血管化复合物同种异体移植排斥方面也具有价值。cd83cart细胞可以克服hla不一致在造血细胞和实体器官供体选择中的屏障，将治愈性移植程序的应用范围扩大到有需要的患者。重要地，cd83cart细胞提供了用来消除同种异体反应性t细胞的平台，而不需要广泛抑制的、非选择性的钙调磷酸酶抑制剂或糖皮质激素。因此，cd83cart细胞具有减小移植相关的死亡率并且改善同种异体-hct后的结果的高可能性。

除非另外限定，否则在此使用的所有技术术语和科学术语均具有与披露的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和它们引用的材料都通过引用特别结合在此。

本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效形式旨在为下列权利要求所涵盖。

序列表

<110>h.leemoffitt癌症中心和研究所公司（h.leemoffittcancercenterandresearchinstitute,inc.）

<120>结合cd83的嵌合抗原受体

<130>320803-2200

<150>us62/634,435

<151>2018-02-23

<150>us62/677,783

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195200205

cysasnvalalahisproalathrasnthrlysvalasplysthrval

210215220

alaproserthrcysserlysprothrcysproproprogluleuleu

225230235240

glyglyproservalpheilepheproprolysprolysaspthrleu

245250255

metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser

260265270

glnaspaspprogluvalglnphethrtrptyrileasnasnglugln

275280285

valargthralaargproproleuarggluglnglnpheasnserthr

290295300

ileargvalvalserthrleuproilealahisglnasptrpleuarg

305310315320

glylysgluphelyscyslysvalhisasnlysalaleuproalapro

325330335

ileglulysthrileserlysalaargglyglnproleugluprolys

340345350

valtyrthrmetglyproproargglugluleuserserargserval

355360365

serleuthrcysmetileasnglyphetyrproseraspileserval

370375380

glutrpglulysasnglylysalagluaspasntyrlysthrthrpro

385390395400

alavalleuaspseraspglysertyrpheleutyrasnlysleuser

405410415

valprothrserglutrpglnargglyaspvalphethrcysserval

420425430

methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserileserarg

435440445

serproglylys

450

<210>24

<211>238

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>24

metaspthrarggluprothrglnleuleuglyleuleuleuleutrp

151015

leuproglyalaargcysalaaspvalvalmetthrglnthrproala

202530

servalseralaalavalglyglythrvalthrileasncysglnser

354045

serlysasnvaltyrasnasnasntrpleusertrppheglnglnlys

505560

proglyglnproprolysleuleuiletyrtyralaserthrleuala

65707580

serglyvalproserargpheargglyserglyserglythrglnphe

859095

thrleuthrileseraspvalglncysaspaspalaalathrtyrtyr

100105110

cysalaglyasptyrserserserseraspasnglypheglyglygly

115120125

thrgluvalvalvallysglyaspprovalalaprothrvalleuleu

130135140

pheproproserseraspgluvalalathrglythrvalthrileval

145150155160

cysvalalaasnlystyrpheproaspvalthrvalthrtrpgluval

165170175

aspglythrthrglnthrthrglyilegluasnserlysthrprogln

180185190

asnseralaaspcysthrtyrasnleuserserthrleuthrleuthr

195200205

serthrglntyrasnserhislysglutyrthrcyslysvalthrgln

210215220

glythrthrservalvalglnserpheserarglysasncys

225230235

<210>25

<211>454

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>25

metgluthrglyleuargtrpleuleuleuvalalavalleulysgly

151015

valhiscysglnservalglugluserglyglyargleuvalthrpro

202530

glythrproleuthrleuthrcysthralaserglypheserargser

354045

sertyraspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglu

505560

trpvalglyvalileserthralatyrasnserhistyralasertrp

65707580

alalysglyargphethrileserargthrserthrthrvalaspleu

859095

lysmetthrserleuthrthrgluaspthralathrtyrphecysala

100105110

argglyglysertrpleuaspleutrpglyglnglythrleuvalthr

115120125

valserserglyglnprolysalaproservalpheproleualapro

130135140

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145150155160

lysglytyrleuprogluprovalthrvalthrtrpasnserglythr

165170175

leuthrasnglyvalargthrpheproservalargglnsersergly

180185190

leutyrserleuserservalvalservalthrserserserglnpro

195200205

valthrcysasnvalalahisproalathrasnthrlysvalasplys

210215220

thrvalalaproserthrcysserlysprothrcysproproproglu

225230235240

leuleuglyglyproservalpheilepheproprolysprolysasp

245250255

thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalasp

260265270

valserglnaspaspprogluvalglnphethrtrptyrileasnasn

275280285

gluglnvalargthralaargproproleuarggluglnglnpheasn

290295300

serthrileargvalvalserthrleuproilealahisglnasptrp

305310315320

leuargglylysgluphelyscyslysvalhisasnlysalaleupro

325330335

alaproileglulysthrileserlysalaargglyglnproleuglu

340345350

prolysvaltyrthrmetglyproproargglugluleuserserarg

355360365

servalserleuthrcysmetileasnglyphetyrproseraspile

370375380

servalglutrpglulysasnglylysalagluaspasntyrlysthr

385390395400

thrproalavalleuaspseraspglysertyrpheleutyrasnlys

405410415

leuservalprothrserglutrpglnargglyaspvalphethrcys

420425430

servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserile

435440445

serargserproglylys

450

<210>26

<211>239

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<220>

<221>尚未归类的特征

<222>(3)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>26

metaspxaaargalaprothrglnleuleuglyleuleuleuleutrp

151015

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202530

valseralaalavalglyglythrvalthrileasncysglnserser

354045

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505560

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65707580

serglyvalproserargphelysglyserglyserglythrglnphe

859095

alaleuthrileserglyvalglncysaspaspalaalathrtyrtyr

100105110

cysglnalathrhistyrserserasptrptyrleuthrpheglygly

115120125

glythrgluvalvalvallysglypheprovalalaprothrvalleu

130135140

leupheproproserseraspgluvalalathrglythrvalthrile

145150155160

valcysvalalaasnlystyrpheproaspvalthrvalthrtrpglu

165170175

valaspglythrthrglnthrthrglythrgluasnserlysthrpro

180185190

glnasnseralaaspcysthrtyrasnleuserserthrleuthrleu

195200205

thrserthrglntyrasnserhislysglutyrthrcyslysvalthr

210215220

glnglythrthrservalvalglnserpheserarglysasncys

225230235

<210>27

<211>456

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>27

metgluthrglyleuargtrpleuleuleuvalalavalleulysgly

151015

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202530

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65707580

alalysglyargphethrileserlysthrserthrthrvalaspleu

859095

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100105110

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alaprocyscysglyaspthrproserserthrvalthrleuglycys

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leuvallysglytyrleuprogluprovalthrvalthrtrpasnser

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glythrleuthrasnglyvalargthrpheproservalargglnser

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serglyleutyrserleuserservalvalservalthrserserser

195200205

glnprovalthrcysasnvalalahisproalathrasnthrlysval

210215220

asplysthrvalalaproserthrcysserlysprothrcyspropro

225230235240

progluleuleuglyglyproservalpheilepheproprolyspro

245250255

lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval

260265270

valaspvalserglnaspaspprogluvalglnphethrtrptyrile

275280285

asnasngluglnvalargthralaargproproleuarggluglngln

290295300

pheasnserthrileargvalvalserthrleuproilealahisgln

305310315320

asptrpleuargglylysgluphelyscyslysvalhisasnlysala

325330335

leuproalaproileglulysthrileserlysalaargglyglnpro

340345350

leugluprolysvaltyrthrmetglyproproargglugluleuser

355360365

serargservalserleuthrcysmetileasnglyphetyrproser

370375380

aspileservalglutrpglulysasnglylysalagluaspasntyr

385390395400

lysthrthrproalavalleuaspseraspglysertyrpheleutyr

405410415

asnlysleuservalprothrserglutrpglnargglyaspvalphe

420425430

thrcysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

435440445

serileserargserproglylys

450455

<210>28

<211>236

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>28

metaspmetargalaprothrglnleuleuglyleuleuleuleutrp

151015

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202530

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354045

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505560

proprolysleuleuiletyraspalaseraspleualaserglyval

65707580

proserargphelysglyserglyserglythrglnphethrleuthr

859095

ileseraspleuglucysalaaspalaalathrtyrtyrcysglngln

100105110

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115120125

valvalvallysglyaspprovalalaprothrvalleuleuphepro

130135140

proserseraspgluvalalathrglythrvalthrilevalcysval

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alaasnlystyrpheproaspvalthrvalthrtrpgluvalaspgly

165170175

thrthrglnthrthrglyilegluasnserlysthrproglnasnser

180185190

alaaspcysthrtyrasnleuserserthrleuthrleuthrserthr

195200205

glntyrasnserhislysglutyrthrcyslysvalthrglnglythr

210215220

thrservalvalglnserpheserarglysasncys

225230235

<210>29

<211>459

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>29

metgluthrglyleuargtrpleuleuleuvalalavalleulysgly

151015

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202530

glythrproleuthrleuthrcysthralaserglypheserleuser

354045

sertyraspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglu

505560

tyrileglyileileserserserglyserthrtyrtyralasertrp

65707580

alalysglyargphethrileserlysthrserthrthrvalaspleu

859095

gluvalthrserleuthrthrgluaspthralathrtyrphecysser

100105110

arggluhisalaglytyrserglyaspthrglyhisleutrpglypro

115120125

glythrleuvalthrvalserserglyglnprolysalaproserval

130135140

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145150155160

leuglycysleuvallysglytyrleuprogluprovalthrvalthr

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180185190

argglnserserglyleutyrserleuserservalvalservalthr

195200205

serserserglnprovalthrcysasnvalalahisproalathrasn

210215220

thrlysvalasplysthrvalalaproserthrcysserlysprothr

225230235240

cysproproprogluleuleuglyglyproservalglyileglypro

245250255

prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr

260265270

cysvalvalvalaspvalserglnaspaspprogluvalglnphethr

275280285

trptyrileasnasngluglnvalargthralaargproproleuarg

290295300

gluglnglnpheasnserthrileargvalvalserthrleuproile

305310315320

alahisglnasptrpleuargglylysgluphelyscyslysvalhis

325330335

asnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalaarg

340345350

glyglnproleugluprolysvaltyrthrmetglyproproargglu

355360365

gluleuserserargservalserleuthrcysmetileasnglyphe

370375380

tyrproseraspileservalglutrpglulysasnglylysalaglu

385390395400

aspasntyrlysthrthrproalavalleuaspseraspglysertyr

405410415

pheleutyrasnlysleuservalprothrserglutrpglnarggly

420425430

aspvalphethrcysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

435440445

thrglnlysserileserargserproglylys

450455

<210>30

<211>236

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>30

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151015

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202530

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354045

glnservalsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglygln

505560

proprolysproleuiletyrglualasermetleualaalaglyval

65707580

serserargphelysglyserglyserglythraspphethrleuthr

859095

ileseraspleuglucysaspaspalaalathrtyrtyrcysglngln

100105110

glytyrserileseraspileaspasnalapheglyglyglythrglu

115120125

valvalvallysglyaspprovalalaprothrvalleuleuphepro

130135140

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145150155160

alaasnlystyrpheproaspvalthrvalthrtrpgluvalaspgly

165170175

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210215220

thrservalvalglnserpheserarglysasncys

225230235

<210>31

<211>455

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<220>

<223>合成构建体

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151015

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202530

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354045

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65707580

alalysglyargphethrileserargthrserthrthrvalaspleu

859095

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100105110

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115120125

thrvalserseralaserthrlysglyproservaltyrproleuala

130135140

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145150155160

vallysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasnsergly

165170175

serleuserserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserasp

180185190

leutyrthrleuserserservalthrvalproserserthrtrppro

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sergluthrvalthrcysasnvalalahisproalaserserthrlys

210215220

valasplyslysilevalproargaspcysglycyslysprocysile

225230235240

cysthrvalprogluvalserservalpheilepheproprolyspro

245250255

aspvalleuthrilethrleuthrprolysvalthrcysvalvalval

260265270

aspileserlysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalasp

275280285

aspvalgluvalhisthralaglnthrglnproargglugluglnphe

290295300

asnserthrpheargservalsergluleuproilemethisglnasp

305310315320

trpleuasnglylysgluphelyscysargvalasnseralaalaphe

325330335

proalaproileglulysthrileserlysthrlysglyargprolys

340345350

alaproglnvaltyrthrileproproprolysgluglnmetalalys

355360365

asplysvalserleuthrcysmetilethraspphepheprogluasp

370375380

ilethrvalglutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlys

385390395400

asnthrglnproilemetaspthraspglysertyrphevaltyrser

405410415

lysleuasnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethr

420425430

cysservalleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysser

435440445

leuserhisserproglylys

450455

<210>32

<211>240

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>32

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151015

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202530

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354045

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505560

glyglnproprolysleuleuiletyrtyralaserthrleualaser

65707580

glyvalproserargphelysglyserglyserglythrglnphethr

859095

leuthrileseraspleuglucysaspaspalaalathrtyrtyrcys

100105110

thrglythrtyrglyasnseralatrptyrgluaspalapheglygly

115120125

glythrgluvalvalvallysargthrprovalalaprothrvalleu

130135140

leupheproproserseralagluleualathrglythralathrile

145150155160

valcysvalalaasnlystyrpheproaspglythrvalthrtrplys

165170175

valaspglyilethrglnserserglyileasnasnserargthrpro

180185190

glnasnseralaaspcysthrtyrasnleuserserthrleuthrleu

195200205

serseraspglutyrasnserhisaspglutyrthrcysglnvalala

210215220

glnaspserglyserprovalvalglnserpheserarglyssercys

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<212>prt

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<220>

<223>合成构建体

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151015

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354045

serasnalametiletrpvalargglnalaproarggluglyleuglu

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65707580

alalysglyargphethrileserargthrserserilethrvalasp

859095

leulysilethrserprothrthrgluaspthralathrtyrphecys

100105110

alaargglyaspglyglyserserasptyrthrglumettrpglypro

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130135140

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165170175

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180185190

leuglnseraspleutyrthrleuserserservalthrvalproser

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210215220

serserthrlysvalasplyslysilevalproargaspcysglycys

225230235240

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245250255

proprolysprolysaspvalleuthrilethrleuthrprolysval

260265270

thrcysvalvalvalaspileserlysaspaspprogluvalglnphe

275280285

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305310315320

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325330335

asnseralaalapheproalaproileglulysthrileserlysthr

340345350

lysglyargprolysalaproglnvaltyrthrileproproprolys

355360365

gluglnmetalalysasplysvalserleuthrcysmetilethrasp

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alagluasntyrlysasnthrglnproilemetaspthraspglyser

405410415

tyrphevaltyrserlysleuasnvalglnlysserasntrpgluala

420425430

glyasnthrphethrcysservalleuhisgluglyleuhisasnhis

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histhrglulysserleuserhisserproglylys

450455460

<210>34

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<212>prt

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<220>

<223>合成构建体

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151015

leuproglyalathrphealaglnalavalvalthrglnthrthrser

202530

provalseralaprovalglyglythrvalthrileasncysglnser

354045

serglnservaltyrglyasnasngluleusertrptyrglnglnlys

505560

proglyglnproprolysleuleuiletyrglnalaserserleuala

65707580

serglyvalproserargphelysglyserglyserglythrglnphe

859095

thrleuthrileseraspleuglucysaspaspalaalathrtyrtyr

100105110

cysleuglyglutyrserileseralaaspasnhispheglyglygly

115120125

thrgluvalvalvallysargthrprovalalaprothrvalleuleu

130135140

pheproproserseralagluleualathrglythralathrileval

145150155160

cysvalalaasnlystyrpheproaspglythrvalthrtrplysval

165170175

aspglyilethrglnserserglyileasnasnserargthrprogln

180185190

asnseralaaspcysthrtyrasnleuserserthrleuthrleuser

195200205

seraspglutyrasnserhisaspglutyrthrcysglnvalalagln

210215220

aspserglyserprovalvalglnserpheserarglyssercys

225230235

<210>35

<211>221

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>35

glnvalglnleuvalglnserglyglyalavalvalglnproglyarg

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserthrtyr

202530

glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

alaalavalsertyraspglyserasnlystyrtyralaasppheval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnprolysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalaaspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargargglyglyleuaspiletrpglyglnglythrthrvalthr

100105110

valserseralaserthrlysglyproservalpheproleualapro

115120125

serserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuval

130135140

lysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyala

145150155160

leuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnsersergly

165170175

leutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleugly

180185190

thrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlys

195200205

valasplyslysvalgluprolyssercysalaalaala

210215220

<210>36

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>36

leuthrglnproproproalaserglythrproglyglnglnargval

151015

thrilesercysserglyserserserasnileglyserasnthrval

202530

asntrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuiletyr

354045

tyrglyasnaspglnargproserglyvalproaspargpheserala

505560

serlysserglythrseralaserleualaileserglyleuglnser

65707580

gluaspglualahistyrtyrcysalaalatrpaspglyserleuasn

859095

glyglyvalilepheglyglyglythrlysvalthrleugly

100105110

<210>37

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>37

valthrglnproproseralaserglythrproglyglnargvalthr

151015

ilesercysserglyserserserasnileglythrasnprovalasn

202530

trptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuiletyrthr

354045

thraspglnargproserglyvalproaspargpheserglyserlys

505560

serglythrseralaserleualaileserglyleuglnsergluasp

65707580

glualaasptyrtyrcysalaalatrpaspaspserleuserglyleu

859095

tyrvalpheglythrglythrlysvalthrvalleugly

100105

<210>38

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>38

metthrhisthrproleuserleuservalthrproglyglnproala

151015

serilesercyslysserserglnserleuleuhisseraspglylys

202530

thrtyrleutyrtrptyrleuglnargproglyglnserproglnpro

354045

leuiletyrgluvalserasnargpheserglyvalproaspargphe

505560

serglyserglyserglythraspphethrleulysileserargval

65707580

glnalagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnserleuglnleu

859095

trpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105

<210>39

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>39

metthrglnserproleuserleuprovalthrleuglyglnproala

151015

serilesercysargserserglnserleuilehisseraspglyasn

202530

thrtyrleuasptrppheglnglnargproglyglnserproargarg

354045

leuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproaspargphe

505560

serglyserglyserglythraspphethrleuargileserargval

65707580

glualagluaspileglyvaltyrtyrcysmetglnalathrhistrp

859095

proargthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105110

<210>40

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>40

metthrglnserproleuserleuprovalthrleuglyglnproala

151015

serilesercysargserserglnserleuvalaspseralaglyasn

202530

thrpheleuhistrpphehisglnargproglyglnserproargarg

354045

leuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproaspargphe

505560

serglyserglyserglythraspphethrleulysileserargval

65707580

glualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnglythrhistrp

859095

proargthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105110

<210>41

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>41

leuthrglnserproleuserleuprovalthrleuglyglnproala

151015

serilesercyslysserserglnserleuvalaspseraspglyasn

202530

thrtyrleuasntrppheglnglnargproglyglnserproargarg

354045

leuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproaspargphe

505560

serglyserglyserglythraspphethrleulysileserargval

65707580

glualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnglythrhistrp

859095

proargthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105110

<210>42

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>42

metthrglnserproleuserleuprovalthrleuglyglnproala

151015

serilesercysargserserglnserleuvalhisseraspglyasn

202530

mettyrleuasntrppheglnglnargproglyglnserproargarg

354045

leuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproaspargphe

505560

serglyserglyserglythraspphethrleulysileserargval

65707580

glualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnalathrglnpro

859095

thrtrpthrpheglyglnglythrlysleugluilelysarg

100105110

<210>43

<211>92

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>43

metthrglnserproserserleuseralaservalglyaspargval

151015

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202530

tyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyraspala

354045

serasnleugluthrglyvalproserargpheserglyserglyser

505560

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65707580

glnthrtyrglnglythrlysleugluilelysarg

8590

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<211>105

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>44

metthrglnserproserserleuseralaservalglyhisproval

151015

thrilethrcysargalaserglnserleuilesertyrleuasntrp

202530

tyrhisglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyralaala

354045

serileleuglnserglyvalproserargpheserglyserglyser

505560

glythraspphethrleuthrileserserleuglnprogluasnphe

65707580

alasertyrtyrcysglnhisthraspserpheproargthrphegly

859095

hisglythrlysvalgluilelysarg

100105

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>45

leuthrglnproproseralaserglythrproglyglnglyvalthr

151015

ilesercysargglyserthrserasnileglyasnasnvalvalasn

202530

trptyrglnhisvalproglyseralaprolysleuleuiletrpser

354045

asnileglnargproserglyileproaspargpheserglyserlys

505560

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65707580

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859095

valpheglyglyglythrthrvalthrvalleuser

100105

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<211>105

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>46

metthrglnalaprovalvalservalalaleugluglnthrvalarg

151015

ilethrcysglnglyaspserleualailetyrtyraspphetrptyr

202530

glnhislysproglyglnalaprovalleuvaliletyrglylysasn

354045

asnargproserglyileprohisargpheserglyserserserasn

505560

thraspserleuthrilethrglyalaglnalagluaspglualaasp

65707580

tyrtyrcysasnserargaspserserglyasnhistrpvalphegly

859095

glyglythrasnleuthrvalleugly

100105

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<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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leuthrglnserproleuserleuprovalthrleuglyglnproala

151015

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202530

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leuiletyrlysvalserasnargaspserglyvalproaspargphe

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serglyserglyserglythraspphethrleulysileasnargval

65707580

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proargthrpheglyglyglnglythrlysleuaspilelysarg

100105110

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<212>prt

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<220>

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glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

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65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

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100105110

thrleuvalthrvalserser

115

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<211>119

<212>prt

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<220>

<223>合成构建体

<400>49

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnhisproglylysglyleuglu

354045

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505560

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65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>50

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnphe

65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>51

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>51

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserargvalthrileserargaspthrserlysasnglnphe

65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

<210>52

<211>119

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>52

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

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65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralaargtyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserser

115

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>53

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphe

65707580

pheleuglnleuasnservalthrthrgluglyaspthralaargtyr

859095

tyrcysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserser

115120

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<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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glnleuvalleuthrglnserproseralaseralaserleuglyala

151015

servallysleuthrcysthrleuserserglnhisserthrtyrthr

202530

ileglytrphisglnglnglnproglulysglyproargtyrleumet

354045

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65707580

serleuglnsergluaspglualaasptyrtyrcysglyserserasp

859095

serserglytyrvalpheglyserglythrlysvalthrvalleu

100105110

<210>55

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>55

leuprovalleuthrglnproproseralaseralaleuleuglyala

151015

serilelysleuthrcysthrleuserserglnhisserthrtyrthr

202530

ileglytrptyrglnglnargproglyargserproglntyrilemet

354045

lysvalasnseraspglyserhisserlysglyaspglyileproasp

505560

argphemetglyserserserglyalaaspargtyrleuthrpheser

65707580

asnleuglnseraspaspglualaglutyrhiscysglyserserasp

859095

serserglytyrvalpheglyserglythrlysvalthrvalleu

100105110

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>57

glnprovalleuthrglnserproseralaseralaserleuglyasn

151015

servallysilethrcysthrleuserserglnhisserthrtyrthr

202530

ileglytrptyrglnglnhisproasplysalaprolystyrvalmet

354045

tyrvalasnseraspglyserhisserlysglyaspglyileproasp

505560

argpheserglyserserserglyalahisargtyrleuserileser

65707580

asnileglnprogluaspglualaasptyrphecysglyserserasp

859095

serserglytyrvalpheglyserglythrglnleuthrvalleuarg

100105110

alaalaalaserserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

115120125

glyglyglyserglnprovalleuthrglnserproseralaserala

130135140

serleuglyasnservallysilethrcysthrleuserserglnhis

145150155160

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glyileproaspargpheserglyserserserglyalahisargtyr

195200205

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225230235240

thrvalleuargalaalaala

245

<210>58

<211>253

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>58

glnvalglnleulysgluserglyproglyleuvallysprosergln

151015

serleuserleuthrcysservalthrglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnpheproglyglnlysleuglu

354045

trpmetglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserargileserilethrargaspthrserlysasnglnphe

65707580

pheleuglnleuasnservalthrthrgluglyaspthralaargtyr

859095

tyrcysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglygly

115120125

glyserglyglyglyglyserglnvalglnleulysgluserglypro

130135140

glyleuvallysproserglnserleuserleuthrcysservalthr

145150155160

glypheserilethrthrglyglytyrtrptrpthrtrpilearggln

165170175

pheproglyglnlysleuglutrpmetglytyrilephesersergly

180185190

asnthrasntyrasnproserilelysserargileserilethrarg

195200205

aspthrserlysasnglnphepheleuglnleuasnservalthrthr

210215220

gluglyaspthralaargtyrtyrcysalaargalatyrglylysleu

225230235240

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245250

<210>59

<211>245

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>59

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserilethrthrgly

202530

glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnphe

65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serglyglyglyglyserglnleuvalleuthrglnserproserala

130135140

seralaserleuglyalaservallysleuthrcysthrleuserser

145150155160

glnhisserthrtyrthrileglytrphisglnglnglnproglulys

165170175

glyproargtyrleumetlysvalasnseraspglyserhisserlys

180185190

glyaspglyileproaspargpheserglyserserserglyalaglu

195200205

argtyrleuthrileserserleuglnsergluaspglualaasptyr

210215220

tyrcysglyserseraspserserglytyrvalpheglyserglythr

225230235240

lysvalthrvalleu

245

<210>60

<211>245

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln

151015

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202530

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thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

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lysvalthrvalleu

245

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<211>245

<212>prt

<213>人工序列

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<223>合成构建体

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<211>245

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<220>

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210215220

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225230235240

lysvalthrvalleu

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100105110

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130135140

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505560

ilelysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnphe

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serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

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100105110

thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

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serglyglyglyglyserleuprovalleuthrglnproproserala

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seralaleuleuglyalaserilelysleuthrcysthrleuserser

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202530

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354045

trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

ilelysserleuvalthrileservalaspthrserlysasnglnphe

65707580

serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serglyglyglyglyserleuprovalleuthrglnproproserala

130135140

seralaleuleuglyalaserilelysleuthrcysthrleuserser

145150155160

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202530

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trpileglytyrilepheserserglyasnthrasntyrasnproser

505560

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100105110

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serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr

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100105110

thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serglyglyglyglyserleuprovalleuthrglnproproserala

130135140

seralaleuleuglyalaserilelysleuthrcysthrleuserser

145150155160

glnhisserthrtyrthrileglytrptyrglnglnargproglyarg

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<211>245

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859095

cysalaargalatyrglylysleuglypheasptyrtrpglyglngly

100105110

thrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglygly

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serglyglyglyglyserleuprovalleuthrglnproproserala

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seralaleuleuglyalaserilelysleuthrcysthrleuserser

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serproglntyrilemetlysvalasnseraspglyserhisserlys

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210215220

hiscysglyserseraspserserglytyrvalpheglyserglythr

225230235240

lysvalthrvalleu

245

<210>70

<211>246

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

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151015

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glytyrtrptrpthrtrpileargglnproproglylysglyleuglu

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100105110

glythrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglygly

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210215220

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225230235240

thrlysvalthrvalleu

245

<210>71

<211>246

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>71

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tyrphecysglyserseraspserserglytyrvalpheglysergly

225230235240

thrglnleuthrvalleu

245