用于蛋白质检测的数字化扩增的制作方法
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背景
数字化测定由于其稳健性、灵敏性和准确性而在生物学中变得越来越重要，在数字化测定中是基于对二进制是或否响应的计数而进行测量的。尽管模拟测量经常需要用运行的标准来校准，但是数字化测量不需要校准，并且具有比模拟方法更快、更容易实现、更准确和更稳健的潜力。
考虑到模拟测定中固有的限制和现有数字化测定的技术限制，显然需要提供用于进行数字化蛋白质测定的改进的方法和设备。本文所述的发明解决了这种需要和更多的需要。
概述
本公开提供了用于进行测定的方法、系统和组合物。在各个方面，本公开涉及数字化测定，并且在具体方面涉及蛋白质测定，其可以使用扩增反应和/或在单个步骤或单个容器中进行。在一些方面，扩增反应是等温扩增反应。在某些方面，等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，扩增反应是pcr扩增。在某些方面，pcr扩增是数字化pcr扩增。在许多方面，本文所公开的测定在无洗涤步骤的情况下进行。本公开还涉及可以作为均质测定进行的测定，即没有反应剂附接于固体支持物的测定。在许多实施方案中，均质测定使用均质溶液，其可以是其中接近触发的扩增反应的所有投入均小于约50nm的溶液。任选地，所述均质溶液可以包括大于50nm的分析物和/或光学探针。
在各个方面，本公开提供了用于分析物数字化检测的方法。将流体分隔成多个区室化流体体积以形成均质测定，使得一些体积含有分析物而一些不含分析物。光学信号由包含所述分析物和所述区室化体积的组分的含分析物的体积中的接近诱导的相互作用触发。基于来自这些体积的光学信号，在含有分析物的体积中检测分析物的存在。在检测期间，所述多个区室化流体体积中的每一个中的流体基本上由通过分隔步骤产生的各自的区室化流体体积和从其产生的反应产物组成。
也就是说，在将流体分隔成各自趋势化的体积之后，反应中的参与物被维持在各自体积的流体中，或被消耗以产生反应产物，但不被去除，也不添加另外的反应产物或参与物。另一方面，可以加入或去除反应中没有实质性参与的物质；例如，一些流体可能蒸发或被添加。
在许多方面，分析物是蛋白质。
在许多方面，所述多个区室化流体体积中的每个流体体积包含第一探针和第二探针。所述第一探针包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分，并且所述第一结合部分与第一核酸分子结合。第二探针包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分，并且所述第二结合部分与第二核酸分子结合。在许多方面，当与所述分析物结合时，在所述第一探针和所述第二探针之间发生所述接近诱导的相互作用，并触发扩增反应。光学信号可以是由在所述含分析物的体积中的所述扩增反应触发的荧光信号。
在许多方面，所述第一核酸和所述第二核酸是dna链。例如，每个可以是任选地与其它核酸分子缀合的单dna链。
在一些方面，所述方法可以包括对其中产生荧光的体积数进行计数，从而产生样品的分析物计数。例如，所述分析物计数可以基于泊松统计产生。
在一些方面，所述扩增反应是等温反应。在某些方面，所述等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，所述扩增反应是pcr扩增。在某些方面，所述扩增反应是数字化pcr扩增。在一些方面，所述方法在无连接酶的情况下进行。
在一些方面，其中当使用所述光学信号检测所述分析物的存在时，所述多个区室化体积中的每一个由通过所述分隔步骤产生的各自的区室化流体体积和从其产生的反应产物组成。也就是说，检测步骤在与所述分隔步骤中产生的相同的区室化体积的流体上执行。例如，在分隔所述流体时，每个流体体积可以被维持为封闭的系统。在一些方面，所述流体被分隔成多个封闭的容器，并且在所述方法的整个剩余部分中，每个流体体积被包含在单个容器内，直到使用所述光学信号检测到所述分析物。
在许多方面，所述方法在无洗涤步骤的情况下进行。在一些方面，光学信号是吸收信号或发光信号。
在一些方面，所述接近诱导的相互作用和所述扩增反应中的至少一个是等温反应。在某些方面，所述接近诱导的相互作用是等温反应。在某些方面，所述扩增反应是等温反应。在某些方面，所述等温反应是数字化等温扩增。在一些方面，所述扩增反应是pcr反应。在某些方面，所述扩增反应是数字化化pcr反应。在许多方面，所述接近诱导的相互作用和所述扩增反应都是等温反应。
在许多方面，所述接近诱导的相互作用是链置换相互作用。在一些方面，在所述接近诱导的相互作用之前，所述第二核酸分子与不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。所述接近诱导的相互作用包括所述第一核酸与所述第二核酸之间的相互作用，其将所述阻断剂寡核苷酸置换到溶液中，并且所述扩增反应包括在所述阻断剂寡核苷酸置换后诱导模板化聚合作用以延伸所述第一核酸分子。所述第二核酸可以是例如用于延伸所述第一核酸的模板。每个流体体积可以包含产生切口的核酸内切酶，其被配置为切割延伸的第一核酸，以允许带切口部分释放到溶液中。产生切口的核酸内切酶可以是酶或核酶或rna引导的核酸内切酶诸如cas9的形式。可以基于在所述含分析物的体积中的所述带切口部分的释放来触发光学信号。
在一些方面，所述扩增反应重复延伸所述第一核酸，并且所述产生切口的核酸内切酶重复切割所述延伸的第一核酸，从而导致带切口核酸链的积累。在一些方面，每个流体体积含有多个荧光部分，其被配置为与积累的带切口核酸链结合；以及通过所述荧光部分与所述积累的带切口核酸链的结合以及通过用与结合的荧光部分接近共振的光照射所述多个体积来触发所述荧光，从而从所述结合的荧光部分诱导荧光。
在一些方面，所述荧光部分是染料。在一些方面，所述荧光部分是蛋白质。在一些方面，所述荧光部分是聚合物点。
在一些方面，每个流体体积包含多个辅助底物。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且所述辅助底物中的至少一些与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且没有所述辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。辅助核酸链被配置为与所述延伸的第一核酸的所述带切口部分结合，从而置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸并在溶液中形成辅助核酸复合物。所述辅助核酸复合物包含所述带切口部分和所述辅助核酸链，并且它被配置为延伸所述带切口部分，并通过所述产生切口的核酸内切酶或聚合酶重复触发去除延伸的带切口部分的一部分。所述去除的延伸的带切口部分包括原始去除的带切口部分的拷贝。该过程可以产生用于积累核酸产物的指数扩增。
在许多方面，所述扩增反应选自：无酶发夹组装反应、无酶催化的发夹反应、无酶杂交链式反应和接近诱导的滚环扩增。
在一些方面，所述扩增反应是滚环扩增，并且所述第二探针包括与所述第二核酸分子结合的滚环扩增底物。滚环底物包含环状核酸链。所述环状核酸链包含结合所述第一核酸分子的第一结合位点和结合所述第二核酸分子的第二结合位点。这些位点可以任选地部分或全部重叠；例如，一个位点可以是另一个位点的子集。所述环状核酸链可以在所述第一结合位点和所述第一核酸分子之间的亲和力等于或高于所述第二结合位点与所述第二核酸分子之间的亲和力，从而促进所述环状核酸链向所述第一核酸分子的转移。在一些情况下，所述第二结合位点包含与所述第二核酸分子的相应核酸不互补的一个或多个错配核酸。
在各个方面，本公开提供了用于蛋白质分析物的数字化检测的方法。将流体分隔成多个区室化流体体积以形成均质测定，使得一些体积含有分析物而一些不含分析物。每个区室化流体体积还包含含有与第一核酸分子结合的第一结合部分的第一探针；和含有与第二核酸分子结合的第二结合部分的第二探针。每个结合部分被配置为与分析物结合；例如，在共同的蛋白质分子上的不同基因座。当与所述分析物结合时，在所述第一核酸分子和所述第二核酸分子之间发生接近诱导的相互作用，并且扩增反应产生区室化含分析物的体积。基于所述扩增反应检测所述含分析物的体积中分析物的存在。在一些方面，所述扩增反应是等温扩增反应。在某些方面，所述等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，所述扩增反应是pcr扩增。在某些方面，所述扩增反应是数字化pcr扩增。
在一些方面，通过用光照射所述多个区室化体积并检测来自所述区室化含分析物的体积的荧光来进行检测。
在一些方面，所述分隔步骤包括将每个区室化流体体积放入多个容器中的各自容器中。每个区室化流体体积保持在其各自的容器中，直到已经进行了检测步骤为止。
在许多方面，所述接近诱导的相互作用触发其中所述第二核酸分子被延伸的扩增反应。在一些方面，使用所述第一核酸作为模板来延伸所述第二核酸分子。在一些情况下，所述第一核酸分子在所述接近诱导的相互作用之前与滚环底物结合，并且所述接近诱导的相互作用触发使用所述滚环底物作为模板的所述第二核酸分子的延伸。
在许多方面，所述第一核酸在所述接近诱导的相互作用之前与可延伸底物结合，并且所述接近诱导的相互作用使所述可延伸底物释放到溶液中。在一些方面，所述可延伸底物的释放触发指数扩增反应。
在一些方面，所述接近诱导的相互作用触发发夹组装反应。在一些方面，所述接近诱导的相互作用产生由所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的部分组成的催化表面。在一些情况下，所述流体包含与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸偶联的辅助底物，并且所述催化表面置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，从而触发涉及所述辅助底物的扩增反应。在一些情况下，所述流体包含与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸连接的滚环底物，并且所述催化表面置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，从而触发涉及所述滚环底物的扩增反应。在一些情况下，所述流体包含多个折叠的发夹分子，并且所述催化表面催化所述多个折叠的发夹分子中的至少一个的展开。
在各个方面，提供了通过链置换扩增来检测流体中分析物存在的方法。在溶液中提供第一探针和第二探针。所述第一探针包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分，并且所述结合部分与第一核酸分子缀合。所述第二探针包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分，并且所述结合部分与第一核酸分子缀合。所述第二核酸分子与不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。所述不可延伸的阻断剂寡核苷酸通过所述第一探针和所述第二探针之间的接近诱导的相互作用而被置换到溶液中，所述接近诱导的相互作用可以在每个探针与单个分析物结合时发生。诱导模板化聚合作用以延伸所述第一核酸分子，并且该延伸被用于触发光学信号，所述光学信号被用于检测所述流体中的所述分析物。在一些方面，所述光学信号是荧光。
在许多方面，置换所述不可延伸的阻断剂寡核苷酸包括将所述第一核酸分子与所述第二核酸分子结合。此外，延伸所述第一核酸分子可以包括使用所述第二核酸分子作为模板。在一些方面，在所述流体中提供被配置为切割延伸的第一核酸的产生切口的核酸内切酶，以允许带切口部分释放到溶液中。
在一些方面，所述流体包含多个辅助底物。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且所述辅助底物中的至少一些与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且没有所述辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。所述辅助核酸链被配置为与所述延伸的第一核酸的带切口部分结合，从而置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，并在溶液中形成包含所述带切口部分和所述辅助核酸链的辅助核酸复合物。所述辅助核酸复合物被配置为延伸所述带切口部分并使用产生切口的核酸内切酶或聚合酶重复触发去除延伸的带切口部分的一部分，所述去除的延伸的带切口部分包含原始去除的带切口部分的拷贝。例如，所述产生的核酸内切酶可以切割所述延伸的带切口部分，其可以通过进行额外延伸的聚合酶被移入溶液中。
在许多方面，所述分析物是蛋白质。在各个方面，所述核酸分子是dna。
在各个方面，本公开提供了用于检测分析物的组合物。所述组合物包含含有第一探针和第二探针的溶液，所述第一探针包含与第一核酸分子结合的第一结合部分，所述第二探针包含与第二核酸分子结合的第二结合部分。所述第一结合部分和所述第二结合部分中的每一个被配置为与所述分析物结合。所述第二核酸分子也与不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。所述第一核酸链和所述第二核酸链包含核酸的相应部分，使得当所述第一探针和所述第二探针通过与所述分析物结合而接近时，所述不可延伸的阻断剂寡核苷酸通过所述第一探针和所述第二探针之间的接近诱导的相互作用而被置换到溶液中。此外，在所述接近诱导的相互作用中没有参与物直接或间接地与固体支持物结合。
在许多方面，所述溶液还包含聚合酶，以在所述不可延伸的阻断剂寡核苷酸通过所述接近诱导的相互作用而被置换时延伸所述第一核酸。在一些方面，所述溶液还包含产生的核酸内切酶，其被配置为切割延伸的第一核酸的带切口部分，将所述带切口部分释放到溶液中。所述溶液还可以包含荧光部分，其被配置为在被照射时响应核酸的积累而发出荧光。在一些情况下，所述溶液还包含多个辅助底物。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且所述辅助底物中的至少一些与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些方面，所述辅助底物各自包含辅助核酸链，并且没有辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。所述辅助核酸链被配置为与所述延伸的第一核酸的所述带切口部分结合，从而置换所述辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸，并在溶液中形成包含所述带切口部分和所述辅助核酸链的辅助核酸复合物。所述辅助核酸复合物被配置为延伸所述带切口部分并通过所述产生切口的核酸内切酶或聚合酶反复触发去除所述延伸的带切口部分的一部分。所述去除的延伸的带切口部分可以包括原始去除的带切口部分的拷贝。
在各个方面，本公开提供了用于分析物的数字化检测的系统。所述系统包括分别设置在多个区室中的多个流体体积。所述多个流体体积中的一些流体体积为区室化不含分析物的体积，而另一些流体体积为区室化含分析物的体积。每个流体体积含有包含被配置为与所述分析物结合的第一结合部分的第一探针，所述第一结合部分与第一核酸分子缀合。每个流体体积还含有包含被配置为与所述分析物结合的第二结合部分的第二探针，所述第二结合部分与第二核酸分子缀合。所述系统还包含光源，其被配置为照射所述区室内的流体体积并且响应于由所述第一探针和所述第二探针之间的接近诱导的相互作用触发的扩增反应而诱导荧光。在一些方面，所述扩增反应是等温扩增反应。在某些方面，所述等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，所述扩增反应是pcr扩增。在某些方面，所述扩增反应是数字化pcr扩增。所述相互作用在所述第一探针和所述第二探针与所述区室内的溶液中的所述分析物的样本结合时发生。
在许多方面，所述系统还包括检测器，所述检测器被配置为检测来自所述区室化含分析物的体积的荧光，并基于所述荧光的检测产生分析物样本的计数。
在许多方面，所述扩增反应包括模板化聚合作用，或级联去淬灭反应。在一些方面，包括模板化聚合作用或级联去淬灭反应的扩增反应是等温扩增反应。在某些方面，包括模板化聚合作用或级联去淬灭反应的扩增反应是数字化等温扩增。在一些方面，包括模板化聚合作用或级联去淬灭反应的扩增反应是pcr扩增。在某些方面，包括模板化聚合作用或级联去淬灭反应的扩增反应是数字化pcr扩增。
在许多方面，所述接近诱导的相互作用是链置换相互作用。在许多方面，所述接近诱导的相互作用选自：无酶发夹组装反应、无酶催化的发夹反应、无酶杂交链式反应和接近诱导的滚环扩增。
在一些方面中，所述系统被配置为分隔流体以产生所述多个流体体积。所述系统还可以被配置为在分隔所述流体时将所述多个流体体积中的每一个维持为基本上封闭的流体系统，直到检测到诱导的荧光。所述基本上封闭的流体系统可以允许向相互作用或反应添加或去除非物质的物质，诸如例如通过添加或蒸发获得或损失流体。可替代地，所述基本封闭的流体系统可以是完全封闭的，在每个体积中保持原始流体组分，加上任何反应产物。
在一些方面，系统可以包括基本上封闭的流体区室，除了允许某些反应产物(如核苷酸三磷酸)流入和流出单独的区室之外。在此类实施方案中，当被用作分析物检测的数字化测定时，必须既不允许分析物也不允许反应产物(例如，通过扩增反应产生的核酸链)在区室之间行进。
在各个方面，提供了用于分析物检测的方法。提供包含分析物、第一探针和第二探针的流体。所述第一探针包含与第一dna分子缀合的第一结合部分。所述第二探针包含与第二dna分子缀合的第二结合部分。所述第一结合部分和所述第二结合部分中的每一个被配置为与所述分析物结合。所述第二dna分子包括rna聚合酶结合位点，并与阻断所述rna聚合酶结合位点的阻断剂寡核苷酸结合。允许所述第一结合部分和所述第二结合部分与所述分析物的共同分子结合，从而使所述第一探针和所述第二探针接近。在探针的dna分子之间产生接近诱导的相互作用，导致阻断剂寡核苷酸置换到溶液中。然后rna聚合酶诱导所述第二dna分子的rna的转录，并基于所述转录检测所述流体中所述分析物的存在。在许多方面，rna的转录触发用于检测的光学信号(如荧光)的产生。在一些方面，荧光由rna的积累触发。
在一些方面，使用基于核酸序列的扩增进一步扩增转录的rna。在一些方面，所述方法使用均质测定进行。例如，所述方法可以是数字化测定。
在各个方面，提供了用于检测分析物的组合物。所述组合物包含含有第一探针和第二探针的均质流体。所述第一探针包含被配置为与所述分析物结合并且与第一dna分子结合的第一结合部分。所述第二探针包含被配置为与所述分析物结合并且与第二dna分子结合的第二结合部分。所述第二dna分子包括rna聚合酶结合位点，并且所述第二dna分子与阻断所述rna聚合酶结合位点的阻断剂寡核苷酸结合。所述流体还包含rna聚合酶和荧光部分。当所述第一结合部分和所述第二结合部分与所述分析物的共同分子结合时，所述第一结合dna分子和所述第二结合dna分子被配置为在接近时产生基于接近的相互作用。基于接近的相互作用将所述阻断剂寡核苷酸置换到溶液中，并允许所述rna聚合酶使用所述第二dna分子作为模板转录rna。
在许多方面，所述组合物还包含选自以下的一个或多个部分：逆转录酶、rna酶h、核苷酸三磷酸、脱氧核苷酸三磷酸和dna引物，以用于使用基于核酸序列的扩增来扩增转录的rna。例如，所述组合物可以包括所有上述列出的部分。
在一些方面，所述荧光部分是荧光染料、荧光纳米颗粒或荧光蛋白。
在各个方面，本文所公开的扩增反应是在接近所述分析物时发生的附接反应。在其它方面，本文所公开的扩增反应是在溶液中且不一定在接近所述分析物时发生的分离反应。在某些方面，本文所公开的扩增反应是部分附接的反应，其中一些扩增在接近所述分析物时发生，并且一些发生在溶液中在不接近所述分析物时发生。
在各个方面，本文所公开的扩增反应是聚合反应。例如，所述扩增反应可以包括核酸聚合作用，如dna或rna聚合作用。在各个方面，本文所公开的扩增反应是非聚合反应，诸如取淬灭反应。例如，所述反应可以涉及自结合核酸链或一对结合链的解结合。在一些实施方案中，去淬灭可以包括dna发夹分子的解结合和组装。
在各个方面，检测可以是光学检测。在一些实施方案中，光学检测可以使用荧光。在一些实施方案中，光学检测可以使用发光。在一些实施方案中，光学检测可以包括吸收检测。在各个方面，分析物的检测可以包括非光学检测方法。
在各个方面，本文所公开的方法和系统可以使用数字化测定来检测分析物。在其它方面，可以使用非数字化(例如，模拟)检测。
在各个方面，本文所公开的扩增反应作为指数扩增反应进行。在其它方面，扩增反应作为线性反应进行。在一些方面，反应可以作为基本上线性的反应进行；即，反应速率的增长类似于或快于线性反应，但慢于指数反应；例如，多项式增长率。除非另有说明，否则基本上线性的反应包括线性反应。
在各个方面，本文所公开的扩增反应是等温反应。在某些方面，所述等温扩增是数字化等温扩增。在一些方面，本文所公开的扩增反应是聚合酶链式反应扩增反应。在某些方面，所述扩增反应是数字化pcr扩增。本文所公开的基于接近的相互作用优选也是等温反应。在一些实施方案中，本文所公开的基于接近的相互作用包括数字化pcr反应。在某些实施方案中，所述基于接近的相互作用和所述扩增反应是数字化等温反应。在一些情况下，所述方法和系统在等温条件下进行扩增和/或相互作用步骤；即处于基本上恒定的温度。加热步骤可以在等温反应之前进行，例如通过超过温度阈值来触发反应的开始。在一些情况下，进行所述扩增和/或相互作用步骤的方法和系统在包括pcr扩增的条件下进行；即使用热循环。
在各个方面，本文所公开的结合部分包括抗体或其部分。抗体可以包括结合抗原的抗原结合位点。所述分析物可以包含抗体结合的位点；例如，多个结合位点，每个结合对应于特定探针的特异性抗体。
在各个方面，本文所公开的方法和系统在不需要洗涤步骤的情况下检测分析物。在各个方面，所述基于接近的相互作用和扩增反应在单个容器中进行。在各个方面中，本文所公开的方法和系统仅涉及用于检测的单个步骤，所述步骤以流体组分(例如探针)之间的基于接近的相互作用开始，并且继续触发用于通过光学或其它方法检测所述分析物存在的扩增反应。
在各个方面，本文所公开的方法和系统包括包含阈值寡核苷酸的多个区室化体积。在一些方面，本文所公开的方法和系统包括多个区室化体积，其包含多个辅助底物。在某些方面，所述多个辅助底物包含阈值寡核苷酸。在一些方面，所述多个区室化流体体积包含多个辅助底物。在某些方面，所述多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合的辅助底物。在一些方面，所述与扩增产物寡核苷酸结合的辅助底物使所述扩增产物寡核苷酸失活。在某些方面，所述扩增产物寡核苷酸的失活包括与所述扩增产物寡核苷酸的结合。在一些方面，与所述扩增产物寡核苷酸的结合为指数增长创造了阈值。在某些方面，所述扩增产物寡核苷酸的失活包括非生产性地延伸所述扩增产物寡核苷酸。在一些方面，非生产性地延伸所述扩增产物寡核苷酸产生指数增长的阈值。在某些方面，所述多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合以产生指数增长阈值的辅助底物。在某些方面，所述多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合并通过非生产性地延伸所述扩增产物寡核苷酸来使扩增产物寡核苷酸失活，以产生指数增长阈值的辅助底物。
提供该概述是为了以简化形式介绍一些概念，这些概念将在下面的详述中进一步描述。该概述不旨在鉴定所要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定所要求保护的主题的范围。
通过引用并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入一样。
附图简述
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖性特征。通过参考阐明说明性实施方案的下面的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点，在这些说明性实施方案中利用了本发明的原理及其附图：
图1a显示了分析物检测的方法。
图1b示出了根据各种实施方案的用于检测分析物的组合物。
图1c和图1d显示了使用基于接近的相互作用来检测流体中的分析物的两个基本方案。图1c显示了用于分析物检测的“附接的”检测方案，以及图1d显示了“分离的”分析物检测方案。
图2示出了使用附接的链置换扩增的分析物检测方法。
图3示出了使用分离的指数扩增结合附接的链置换扩增进行分析物检测的方法。
图4示出了使用附接的发夹组装反应进行分析物检测的方法。
图5示出了使用三向接合催化发夹组装反应来进行分析物检测的方法。
图6示出了使用三向接合催化附接的链置换扩增来进行分析物检测的方法。
图7示出了使用附接的滚环扩增进行分析物检测的方法。
图8示出了使用三向接合激活分离的滚环扩增来进行分析物检测的方法。
图9示出了使用分离的链置换扩增进行分析物检测的方法。
图10示出了使用分离的滚环扩增进行分析物检测的方法。
图11示出了使用阻断寡核苷酸的链置换触发rna聚合来进行分析物检测的方法。
图12a示出了附接的链置换扩增反应的示意图，其中接近诱导链置换以产生用于聚合酶和产生切口核酸内切酶的活性底物。
图12b示出了在用链置换扩增检测分析物中随时间的荧光。
图12c示出了终点荧光数码照片，其描绘了来自链置换扩增的样品的相对荧光。
图12d示出了随时间的荧光，其在链置换扩增中在有和没有靶蛋白的情况下一式三份的实验中进行。
图12e示出了终点荧光数码照片，其显示了在有和没有靶蛋白的情况一式三份样品的相对荧光。
图13a示出了使用分离的指数扩增结合附接的链置换扩增(表示为“expar反应”)进行检测的示意图，其中接近诱导链置换以产生用于聚合酶和产生切口的核酸内切酶加随后反应的活性底物以产生指数增长。
图13b示出了在用expar扩增进行的分析物检测中随时间的荧光。
图13c示出了由数字化等温扩增测定产生的荧光液滴的终点图像。
详述
本公开总体上涉及使用涉及基于接近的相互作用的测定进行分析物(尤其是蛋白质分析物)检测的组合物、系统和方法。
用于样品中扩增的生物标志物检测的最常用的方法是聚合酶链式反应(pcr)，其中dna在由dna聚合酶催化的温度敏感反应中扩增。在pcr中，样品通常通过热循环装置在约60℃至约95℃范围内的两个或三个温度之间循环。从基本生物学到临床诊断学和法医学，使用pcr扩增dna已大大推动了许多学科的发展。还对pcr进行了改进，以检测液滴中的dna，用于“数字化”读出。这允许单独核酸分子的绝对定量或计数。然而，尽管在核酸的数字化检测方面已经取得了一些进展，但是仍然需要开发用于检测蛋白质的技术。
需要用于检测蛋白质的扩增方法，特别是不需要洗涤步骤的那些方法。具体地，需要用于检测蛋白质的等温扩增方法，尤其是不需要洗涤步骤的那些方法。等温蛋白检测具有广泛的应用，其包括在护理诊断学以及个性化和精准医学中的应用。用于蛋白质检测的等温扩增比pcr提供了至少两个显著的优点：它不需要精确的温度变化来实现扩增(即，该技术可以在等温条件下进行)，并且它适用于蛋白质分析物(而pcr主要用于检测dna)。本文所公开的用于蛋白质检测的等温技术提供了蛋白质的基于等温扩增的检测，并且可以作为数字化测定的一部分进行。
如本文所述的，数字化测定可以包括将样品(或其衍生物)分割、等分或以其它方式分离成多个区室化体积，将多个区室化体积单独评估可检测信号或代码的存在或不存在(例如，检测由荧光探针产生的可检测信号或代码)，以及将二进制值分配给每个评估的区室化体积。在一些情况下，可以基于区室化体积中可检测信号或代码(或其部分)的存在、不存在、波长、强度和/或寿命将值分配给区室化体积。分配给评估的区室化体积的值可以被用于确定每个区室化体积中的靶分子的特性。例如，检测或未能检测到区室化体积中的可检测信号(例如，可检测的代码或其方面)可以指示区室化体积中靶分子的存在或不存在，并且可以被用于确定样品中靶分子的浓度。在一些情况下，检测或未能检测到区室化体积中的可检测信号可以被用于确定样品中蛋白质分子的身份或量。
一个参考文献已经报道了基于酶(β-半乳糖苷酶)的珠捕获的等温数字化蛋白elisa。然而，对这种非均质技术(即，依赖于捕获而不是在溶液中继续进行的技术)存在相当大的限制。蛋白质检测器需要洗涤以去除将产生假阳性信号的背景分析物。这种需要的洗涤步骤是一个显著的缺点。此外，珠捕获的要求阻止了该技术在均质溶液中进行，进一步限制了该技术。本文所公开的检测技术可以以混合和读取的方式进行，而不需要洗涤步骤，并且它们可以在溶液中进行，而不使用支持物(如珠)。
用于在均相溶液中对蛋白质分析物进行数字化化分析的现有方法与本文所公开的技术相比也具有多个缺点。例如，已经报道了使用接近连接测定和pcr检测某些蛋白质毒素的技术。然而，这种技术由于需要涉及在相当大范围内的受控温度变化的步骤而受到阻碍，从而排除了分析物的等温检测。此外，该技术需要离心步骤，这需要在容器之间转移。这阻止了该技术以一锅法或单步法方式进行。相反，本文所公开的等温技术允许在等温过程中检测蛋白质分析物，并且可以在单个容器中进行，而不需要另外的步骤(如离心)。
最后，已经开发了某些技术用于模拟测定，诸如接近诱导的滚环扩增和发夹组装反应。然而，这些技术受限于依赖模拟溶液反应，其需要校准并且可能易受难以校正或量化的误差的影响。例如，当处理产生指数增长的反应时，扩增效率的不确定性可能导致非常大的误差。
在一些实施方案中，聚合酶链式反应扩增(本文也称为“pcr扩增”等)可以被用于检测蛋白质。在某些实施方案中，pcr扩增不需要洗涤步骤。可以使用便携式机器实现pcr扩增，这提供了本文所公开的聚合酶链式扩增反应(本文也称为“pcr扩增反应”、“pcr反应”等)的有利应用。本文所公开的用于蛋白质检测的pcr扩增技术提供了基于pcr扩增的蛋白质检测，并且可以作为数字化测定的一部分来进行。在一些实施方案中，pcr扩增技术包括数字化pcr扩增。
图1a示出了分析物检测的方法100。可以进行该方法以用于检测溶解或以其它方式分散在流体中的分析物。例如，该方法可以被用于检测流体中的蛋白质。优选地，所述方法在均质测定中进行；即该方法不依赖于颗粒附接于珠或其它形式的固体支持物而进行。该特征提供了增加的灵活性和效率；例如，与非均质测定不同，不需要使用洗涤步骤。
在步骤112中，提供含有分析物的流体。优选地，分析物是蛋白质，并且流体含有许多分析物蛋白质分子。可以提供另外的流体组分，其可以与分析物相互作用，并且以基于接近的相互作用彼此相互作用。例如，组分可以包括第一探针和第二探针，每个探针被配置为与分析物结合。在一些实施方案中，第一探针包含与第一核酸分子结合的第一结合部分。第一结合部分可以是对分析物具有亲和力的抗体。第二探针可以类似地包含与第二核酸结合的第二结合部分。第二结合部分也可以是对分析物具有亲和力的抗体。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分是被配置为与共同蛋白分子的不同相应部分结合的不同抗体。流体组分还可以包含另外的反应组分(诸如聚合酶和核酸内切酶分子以及用于核合成的合适的核碱基)以及非反应组分(如溶剂(例如水)、缓冲液等)。第一和第二核酸优选是dna分子。
在步骤114中，流体被分隔成区室化体积，以产生数字化测定。例如，区室化体积可以是各自含有单个液滴的液滴或孔。也可以采用分隔流体的其它方法；例如，可以通过在较大的流体体积内引入膜或其它流体屏障来原位产生区室化体积，从而将流体组分分隔成各自的区室化体积。优选地，区室化体积含有均质的流体，其在不依赖于支持结构(如珠)存在的情况下进行反应。流体可以被适当地稀释，使得一些区室化体积不含有分析物，而一些区室化体积含有一些分析物。在流体是均质的并且分析物已经完全扩散到流体中的情况下，分隔步骤倾向于随机地将分析物分子分配到各自的区室化体积。如果每一个区室化体积与其它的类似，那么分隔步骤通常将根据泊松分布在区室化体积中填充分析物。因为数字化测定通常依赖于区分含分析物的体积和不含分析物的体积，所以对于其中预期区室化体积的显著部分不含分析物的测定，可以获得最佳的信噪比。尽管优选使用分隔步骤114用于形成数字化测定，但是在一些实施方案中，可以省略分隔步骤。例如，在一些实施方案中，可以执行方法100以产生对单个流体体积的模拟(即，非数字化)测量。
可以在将分析物添加到流体的步骤之前，将各种流体组分引入流体中，或者可以在例如分隔步骤114的过程中同时或之后引入。在一些情况下，可以在不同的时间添加不同的组分；例如，可以保留一种或多种试剂，直到将流体分隔到区室中，以确保反应仅在区室化体积内进行，从而防止交叉污染。
在步骤116中，允许在流体组分之间发生基于接近的相互作用。相互作用可以自发发生(例如，由于溶液中分析物和其它流体组分的存在)，或者可以触发相互作用。例如，可以通过将流体的温度升高到临界温度以上来触发相互作用和/或随后的扩增反应(例如，去淬灭或酶促扩增)。优选地，扩增反应是等温反应；任选地，基于接近度的相互作用也是等温反应。更优选地，所有等温扩增都是数字化等温扩增。尽管等温反应可以通过使温度达到某一水平来触发，但是反应不需要改变温度以运行至完成。如本文所用的，等温反应是在恒定温度下进行至完成的反应。术语“等温”表征反应，而不是反应发生的条件；因此，等温反应保持等温反应，即使系统的温度随着反应的发生而变化，只要温度保持恒定，反应仍将发生。相反，聚合酶链式反应(pcr)不是等温的，因为它需要在变化的温度下进行许多循环以运行至完成。另一方面，本文所讨论的扩增反应和其它相互作用通常是等温的，因为尽管它们可能需要一定范围内的温度，并且它们可能作为温度的函数以稍微不同的速率进行，但是它们不需要在反应运行至完成的过程中改变温度。在一些实施方案中，扩增反应是pcr反应，并且在一些实施方案中，扩增反应是数字化pcr反应。在某些实施方案中，扩增是pcr反应(例如，数字化pcr反应)并且基于接近的相互作用是等温反应(例如，数字化等温反应)。如本文所用的，pcr反应是使用热循环进行至完成以允许不同的温度依赖性反应的反应。在一些实施方案中，扩增反应选自：无酶发夹组装反应、无酶催化的发夹反应、无酶杂交链式反应和接近诱导的滚环扩增。在一些实施方案中，扩增反应包括无酶发夹组装反应、无酶催化的发夹反应、无酶杂交链式反应、接近诱导的滚环扩增或它们的任意组合。在一些实施方案中，扩增反应选自：发夹组装反应、催化的发夹反应、杂交链式反应和接近诱导的滚环扩增。在一些实施方案中，扩增反应包括发夹组装反应、催化的发夹反应、杂交链式反应、接近诱导的滚环扩增或它们的任意组合。
在某些实施方案中，扩增反应使用数字化等温扩增，诸如nasba(基于核酸序列的扩增)、lamp(环介导的扩增)、sda(链置换扩增)、expar(exponential扩增反应)和滚环扩增(rca)，其中使用数字化化体积的阵列(与数字化pcr类似)，用于进行数字化nasba、数字化lamp、数字化sda、数字化expar和数字化滚环扩增。
在一些实施方案中，基于接近的相互作用涉及与第一结合部分和第二结合部分(例如抗原)结合的第一核酸分子和第二核酸分子之间的相互作用，形成分别与蛋白质分析物结合的第一探针和第二探针。两个探针与共同分析物的结合使两个探针接近，允许核酸链相互作用。在一些实施方案中，基于接近的相互作用涉及第一核酸分子和第二核酸分子之间的配对相互作用。例如，核酸分子可以配对以允许rna的转录，通过聚合酶延伸两个核酸分子之一，或通过两个核酸分子的一部分的部分配对形成催化剂。参考其余的附图更详细地讨论了可以进行基于接近的相互作用的各种方式。在一些情况下，基于接近的相互作用可以在流体中的溶液中产生反应产物，诸如核酸链的积累。在一些情况下，这些副产物可以与其它流体组分相互作用，以例如在指数扩增反应中产生其它反应产物。
在步骤118中，基于基于接近的相互作用来检测分析物。通过荧光、吸收、发光或产生光学信号的类似方法的光学检测是优选的检测方法。在一些实施方案中，在流体中提供荧光部分(例如，荧光探针，如染料、纳米颗粒、蛋白质或聚合物点(pdot))，并且荧光部分与基于接近的相互作用的积累产物相互作用。与积累的产物相互作用的荧光部分可以响应于适当波长的光的照射而发出荧光。例如，sybrgreeni(或sybrgreenii或sybrgold，用于单链dna)可以被用于使用标准荧光检测来检测溶液中积累的dna分子。可替代地或另外地，可以使用其它检测机制来检测分析物。在一些实施方案中，通过基于接近的相互作用产生或改变的核酸链的检测可以使用吸收检测、比色检测或各种形式的化学、电或磁检测来进行。例如，在一些实施方案中，可以使用嵌入染料来检测核酸分子(如通过聚合酶产生的双链dna)的积累。在一些实施方案中，dna或其它核酸产物的积累通过染料检测，所述染料通过主链相互作用或发光适配体与其靶标之间的相互作用与单链产物相互作用。在一些实施方案中，通过分子信标检测其它核酸产物的dna积累。在一些实施方案中，通过在产物核酸(例如dna)中形成g-四链体结构来检测核酸产物的积累，所述g-四链体结构然后可以催化其它荧光或有色产物。在一些实施方案中，通过与产物或产物聚合相关的化学发光或生物发光来检测核酸产物的积累。在一些实施方案中，通过溶液中的电化学变化(如电容、电导率或电子转移速率的变化)来检测产物。
在模拟测定实施方案中，检测可以包括确定与流体中分析物的数量或浓度相关的信号强度。在数字化实施方案中，检测可以包括确定含有分析物的多个区室化体积和不含分析物的多个区室化体积。例如，在基于荧光的实施方案中，可以从一种类型的体积(例如，含有分析物的那些体积)而不是从另一种类型的体积(例如，不含分析物的那些体积)检测荧光。可替代地，如果含有分析物的体积中的反应用于淬灭荧光而不是使荧光起效，则可以颠倒读出。基于对哪些体积含有分析物的确定，可以测量分析物性质(如分析物的总计数)。这种测量可以通过将含有零分析物的体积和非零分析物的体积的数目与泊松分布进行比较来进行。例如，泊松统计可以被用于产生每个容器的分析物的平均量。通过将体积数乘以该平均值可以产生分析物的总计数或总量。
方法100可以由被配置为进行数字化测定的系统来进行。该系统可以将流体分隔成分别设置在多个区室中的多个流体体积。例如，在一些实施方案中，系统可以包括孔、液滴或其它区室化体积的阵列，含分析物的流体的一部分可以沉积在每个孔、液滴或其它区室化体积中。区室化体积中的流体可以含有第一探针和第二探针中的每一个的一个或多个，以及适当的另外的组分(如聚合酶、核酸内切酶、碱基对等)，以支持扩增反应和随后的检测。优选地，该系统通过光学方法检测孔中分析物的存在，诸如通过诱导和测量荧光，或通过测量吸收的变化。可替代地或另外地，该系统可以采用诸如化学或电学检测的方法来确定哪些孔含有分析物。该系统还可以基于孔中分析物的检测来产生分析物的测量值(如分析物的计数或分析物的浓度)。
例如，该系统可以包括计算机控制的数字化测定系统，其自动地将含分析物的流体分隔成多个区室化流体体积，控制反应条件(例如，温度)以促进含分析物体积中的基于接近的相互作用。然后，该系统可以检测哪些体积含有分析物并且哪些体积不含分析物(例如，使用荧光或其它检测)，并且基于这种测量，该系统可以产生存在于流体中的分析物分子的数量的计数。例如，使用泊松统计，不含分析物的体积的分数x和含分析物的体积的分数(1-x)的测量可以对应于-ln(x)的总分析物分数(其中ln是自然对数)，或-ln(x)*n的总分析物数(其中n是体积数)。该系统可以包括处理器，其执行指令以控制由数字化测定系统进行的每个步骤，包括产生分析物计数所需的计算。可以选择体积的数目(例如，孔的数目)以在所有测量中提供期望水平的精度。例如，流体可以被分隔为10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、或100,000个或更多个体积，其中更多个体积提供逐渐增大的精度。优选地，流体被均匀分隔，尽管不均匀的分隔是可能的，并且可以统计地考虑。
图1b示出了根据各种实施方案的用于检测分析物的组合物120。组合物120可以包含具有各种流体组分的流体。例如，该组合物可以是水性溶液。优选地，该组合物是均质流体；即参与流体中的反应的各种流体组分不附接于宏观结构(如珠)，所述宏观结构在检测过程之前或过程中可能需要洗涤步骤。流体的组分可以包括适合于所使用的具体检测方法的各种生物分子和结构。例如，在图2-图11中所讨论的检测方法采用各种基于接近的分析物检测方法，并且可以适当地选择流体组分以进行所示方法中的任意一种或多种。
说明性的组合物120包括多种组分，为了便于说明，在其余附图中以类似的形式示出这些组分。例如，组合物120包括分析物122，其可以是蛋白质分子，或其它生物分子可以结合的各种生物结构中的任一种，如蛋白质复合物、代谢物、碳水化合物、脂质结构、药物、病毒、核酸结构或甚至更大的结构(如细菌或其它细胞)。该组合物还包含结合部分124，其包括结合位点以结合分析物122上的给定位置(例如表位)。例如，结合部分124可以是抗体或其部分，并且分析物122可以构成与抗体匹配的抗原，使得结合部分124靶向并结合分析物122。此外，分析物122可以包含不同抗体可以结合的多个位点，并且通过同时结合共同分析物的适当位点(例如，不同表位)，抗体可以使其自身(和它们所附接的其它分子)接近以触发基于接近的相互作用。该组合物还包含核酸分子126；例如，dna或rna的链。示出了核酸分子126，在其5'端有一个点并且在其3'端有一个箭头，指示了使用聚合酶可能进行的分子聚合的方向。结合部分和核酸分子可以结合在一起以形成探针128，其可以被用于在与分析物结合时触发与另一探针的基于接近的相互作用。当两个核酸分子进行基于接近的相互作用时，它们可以形成双链核酸复合物(如双链dna复合物130)。在双链dna复合物130中，仅两个dna分子的一部分被示为结合在一起(例如，通过碱基配对)。dna分子的剩余部分可以被分离，因为它们附接到例如附接到分析物上不同位点的各自的结合部分。在一些实施方案中，包括可以与核酸分子结合以抑制聚合作用、转录或结合的“阻断剂”132。阻断剂可以是不可延伸的寡核苷酸，其可以通过包括对其3'端的修饰而形成。例如，阻断剂132可以具有反向的3'端，或另一个类似的修饰，使得聚合酶的模板化延伸在该端被抑制。阻断剂132可以具有反向的3'端，或单独或组合的其它类似修饰，使得在该端上抑制通过核酸内切酶产生切口或通过聚合酶的模板化延伸。可以防止延长的其它修饰包括双脱氧碱基、磷酸修饰、延伸的错配、或抑制扩增所必需的一种或多种酶的任何其它修饰。阻断剂可以包含与另一核酸分子互补的多个碱基，使得阻断剂与核酸分子结合，从而导致失活的复合物。如下，在图2-图11中示出了可以任选地包括在组合物中的其它流体组分。
图1c和图1d示出了使用基于接近的相互作用来检测流体中的分析物的两个基本方案。
图1c显示了用于分析物检测的“附接”检测方案140。在附接检测方案140中，第一探针142和第二探针144各自与共同的分析物141结合。由此使两个探针接近，并且可以彼此进行基于接近的相互作用。这两个探针包括相互作用形成核酸复合物146的核酸分子。然后该复合物参与进一步的反应；例如，形成该复合物的核酸分子之一可以通过聚合酶延伸，导致最终产生分析物存在于流体中的可检测信号的进一步反应。
图1d显示了可替代的“分离的”分析物检测方案150。与在检测方案140中一样，在检测方案150中，第一探针152和第二探针154各自与共同的分析物151结合，然后进行基于接近的相互作用以形成复合物156。然而，尽管附接方案140中的复合物146参与进一步的扩增反应，但是复合物156的形成反而触发远离分析物的反应。例如，复合物156的形成可以从第一探针和第二探针之一上移走活性核酸链158，其然后可以与其它流体组分形成活性复合物，导致溶液中的扩增反应远离分析物。在许多实施方案中，分离的反应被用作指数扩增反应的一部分。
除了上面讨论的严格的“附接的”和“分离的”方案之外，一些方案采用“部分附接的”反应，其中一些扩增涉及附接的复合物，但是反应的其它部分远离溶液中的分析物发生。例如，本文所述的许多附接反应可以被用于产生游离核酸链，其可以与溶液中的其它底物相互作用以触发指数扩增反应。
图2-图11更详细地说明了如何根据本文所公开的方法使用各种基于接近的相互作用来产生分析物的测量。图2-图11中示出的每个过程可以在等温条件下进行(例如，使用等温组装和扩增反应)，并且可以在单一流体溶液中(例如，作为模拟测定)或在多个区室化流体体积中(例如，作为数字化测定)进行。可替代地，图2-图11中示出的每个过程可以在包括pcr扩增的条件(例如，使用热循环组装和诸如数字化pcr的pcr扩增反应)下进行，并且可以在单个流体溶液(例如，作为模拟测定)中或在多个区室化流体体积(例如，作为数字化测定)中进行。
图2说明了使用附接的链置换扩增进行分析物检测的方法200。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行分。在流体中提供分析物201。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法200可以被表征为“附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(扩增反应)。
流体还可以包括第一探针210和第二探针220。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分212，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子214。第一结合部分212可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物201结合的结合位点。第一核酸分子214与不可延伸的阻断剂寡核苷酸216结合。例如，第一核酸分子214和不可延伸的阻断剂寡核苷酸216可以是通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子。不可延伸的阻断剂寡核苷酸216可以包含对其3'端的修饰(例如，反向的3'端)，使得dna聚合酶的模板化延伸在该端(以及天然不被dna聚合酶延伸的5'端)被抑制。如果第一核酸分子214在3'端与第一结合部分212结合，则可以抑制第一核酸分子214和不可延伸的阻断剂寡核苷酸216的聚合。
第二探针220可以包含第二结合部分222和包含第二核酸分子224的第二相互作用部分。第二结合部分222可以是抗体或其部分，例如具有与析物201结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子224可以是例如dna分子，并且可以在5'端与结合部分222结合。因此，如果提供合适的模板，第二核酸分子224可以由聚合酶(例如dna聚合酶)延伸。
在第一步202中，第一探针210、第二探针220和分析物201各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子201结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步204，其中第一核酸分子214和第二核酸分子224相互作用形成复合物230。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有多个互补的碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物230。相互作用可以置换不可延伸的阻断剂寡核苷酸216，然后可以作为废弃物释放到溶液中。剩余复合物230可以包括两个核酸分子的长度差异；即第一核酸分子214可以延伸超过与其互补的第二核酸分子224的相应部分，使得第一核酸分子214呈现允许碱基对聚合延伸第二核酸分子224的模板。
在第一和第二核酸分子214和224之间形成核酸复合物可以建立可重复的核酸扩增循环。在步骤206中示出了此类循环的起始点。第一和第二核酸分子214和224分别保持与结合部分212和222结合，而结合部分212和222又保持与分析物201结合。在步骤206中用虚线示出了结合部分212和222的端部，但是从附图中省略了扩增过程步骤的示意图的其余部分。
通过聚合酶(如dna聚合酶)与复合物230的结合，扩增过程从步骤206进行到步骤207。使用第一核酸分子212作为模板，聚合酶延伸第二核酸分子224。延伸可以持续直到例如到达第一核酸分子212的5'端。
在步骤207中第二核酸分子224的延伸之后可以是步骤208中通过产生切口的核酸内切酶与第二核酸分子的延伸部分的结合。例如，第二核酸分子的延伸部分可以包括形成用于核酸内切酶的结合位点的多个碱基对，所述核酸内切酶被配置为在点252处切断第二核酸分子。在一些实施方案中，点252位于或接近第二核酸分子224的原始3'端。核酸内切酶的作用产生带切口核酸分子254。
在步骤209中，带切口核酸分子254被释放到溶液中，产生能够通过聚合酶的作用进行另一模板化延伸的核酸复合物。该延伸将该过程带回到步骤207，然后可以重复循环。在一些实施方案中，带切口核酸分子254的释放由聚合酶的延伸介导。该核酸扩增循环的重复作用可导致带切口核酸分子254在溶液中的积累，其可以被用于检测。例如，荧光成像可以被用于通过在流体中提供荧光部分来检测带切口的核酸分子的积累，当在带切口的核酸分子存在时(例如，当与之结合时)，所述荧光部分在用适当波长的光照射时发出荧光。
因为扩增过程200取决于分析物201的存在来运行至完成(经由第一探针和第二探针与共同分析物的结合来实现它们的接近，从而引发基于接近的相互作用)，所以在溶液中带切口核酸分子254的产生是分析物存在的指示。基于带切口核酸分子在溶液中积累或不积累而存在或不存在荧光(或其它性质)，因此允许检测哪些流体体积含有或不含分析物。因此，通过使用方法200作为数字化测定的一部分，可以产生流体中核酸分子的数量的测量，以及相应的其它性质(如分析物浓度)。可替代地，方法200可以被用于进行分析物的模拟测量。溶液中带切口核酸分子254的产生速率随着溶液中存在的分析物颗粒的数量而增加；因此，所产生的带切口核酸的量的测量(例如，通过荧光强度的测量，通过达到给定强度的时间的测量等)可以被用于产生流体中分析物的量的模拟测量。测量可以包括将测量的信号与校准的标尺进行比较，例如，以确定分析物的测量量。
图3示出了使用附接的链置换扩增进行分析物检测的方法300。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物301。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法300可以被表征为“部分附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(扩增反应)，但是附接的反应触发在溶液中发生的其它反应步骤。
流体还可以包括第一探针310和第二探针320。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分312，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子314。第一结合部分312可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物301结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子314可以包含顺序为3*、2*、1*的连续核酸序列，其中序列x*表示与序列x互补的序列。第一核酸分子314与不可延伸的阻断剂寡核苷酸316结合。第一核酸分子314和不可延伸的阻断剂寡核苷酸316可以是通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子，例如通过将阻断剂上的碱基配对序列3结合到第一核酸分子上的碱基配对序列3*。不可延伸的阻断剂寡核苷酸316可以包含对其3'端的修饰(例如，反向的3')，使得dna聚合酶的模板化延伸在该端(以及天然不被dna聚合酶延伸的5'端)被抑制。如果第一核酸分子314在3'端与第一结合部分312结合，则可以抑制第一核酸分子314和不可延伸的阻断剂寡核苷酸316的聚合。
第二探针320可以包含第二结合部分322和包含第二核酸分子324的第二相互作用部分。第二结合部分322可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物301结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子324可以是例如dna分子，并且可以在5'端与结合部分322结合。因此，如果提供了适当的模板，第二核酸分子324可以由聚合酶(例如dna聚合酶)延伸。此外，第二核酸分子324可以包含与第一核酸分子的碱基对序列3*互补的碱基对序列3。
在第一步302中，将第一探针310、第二探针320和分析物301各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子301结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步304中，其中第一核酸分子314和第二核酸分子324相互作用形成复合物330。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有形成各自互补序列3*和3的多个互补碱基对，使得它们在接近时可以相互作用形成双链核酸复合物330，同时将不可延伸的阻断剂寡核苷酸316从其与第一核酸分子的相同3*序列的结合中置换出来。然后可以将不可延伸的阻断剂寡核苷酸316作为废弃物释放到溶液中。剩余复合物330可以包括两个核酸分子的长度差异；即虽然第一核酸分子314具有与其互补的与第二核酸分子324的碱基对序列3结合的碱基对序列3*，但是第一核酸分子还包含其2*序列随后是1*序列形式的链的延续。因此，第一核酸分子314呈现允许碱基对聚合将第二核酸分子324延伸到区域2和1中的模板。任选地，3的长度和序列可以基本上或完全与1结构域相同。任选地，第二核酸分子上的结构域3最初可以包括比第一核酸分子上的3序列更少或更多的碱基对；例如，第二核酸分子最初可以包括区域3，其后是区域2的一部分，或区域1的一些但不是全部。不可延伸的阻断剂寡核苷酸316的长度也可以变化以包括大于或小于区域3。这种可变性允许第一核酸分子和第二核酸分子之间的基于接近的相互作用的强度相对于不可延伸的阻断剂寡核苷酸发生变化，这可以被用于增加反应速率或可替代地降低反应速率(例如，用于降低第一探针和第二探针在溶液中偶然碰撞所产生的反应速率)。此外，第一核酸链和第二核酸链两者都可以包括在鉴定区域和结合部分之间的多个核酸。因为这些额外的核酸不需要经历配对相互作用，所以它们可以自由地变化，并且可以包括互补的或非互补的碱基对序列。
流体还包含辅助复合物332，其包含任选地与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸336结合的辅助底物334。在一些方面，辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸336结合。在一些方面，辅助底物各自包含辅助核酸链，并且没有辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸336结合。辅助底物334可以包括从5'端读取的连续核酸序列1*、2*、1*、2*，使得辅助底物334至少部分类似于第一核酸314。在一些实施方案中，这两个是相同的；在这种情况下，第一核酸分子的另外的2*部分可以避免在基于接近的相互作用过程中参与与第二核酸分子的碱基配对，因为它桥接结合分析物的两个探针之间的间隙。辅助底物的一条或两条链可以被修饰(例如，具有反向的3')以避免辅助底物的聚合酶延伸。
复合物330以及辅助底物334可以参与重复扩增的循环，其产物可以触发更多的辅助底物加入扩增反应循环，这导致溶液中产生核酸链的指数增长。该过程可以从步骤304中所描绘的复合物330的构型开始。使用第一核酸作为模板，通过聚合酶延伸第二核酸分子324以达到步骤306中所示的构型。该复合物用虚线部分地示出，因为发生了涉及辅助底物334的类似过程，这将在后面的讨论中进行说明。第二核酸的延伸产生用于产生切口的核酸内切酶的结合位点，例如，类似于关于图2所讨论的位点。产生切口的核酸内切酶与延伸的复合物结合，并在点354处使第二核酸的延伸部分产生切口，以允许该点之后的核酸链释放到溶液中。因为第二核酸的延伸使用第一核酸作为模板，所以带切口延伸部分338分别具有从5'读取到3'的核酸序列2和1，这是在其初始3*序列与第二核酸分子的3序列配对后与第一核酸分子的2*和1*序列互补的那些序列。(尽管第二核酸分子将可能与第一核酸分子的1*序列相互作用，但是这种排列将导致第一核酸分子和第二核酸分子各自的5'端和3'端的对齐，从而防止进一步的聚合。最后，随机的热分离和移动将使第一核酸分子和第二核酸分子的适当部分以适当的构型接触，并且该过程将在分子接近的情况下相对快速地进行。)在带切口部分338进入溶液中后，可以再次延伸复合物330，重复步骤306的循环。
此外，已经被释放到溶液中的带切口部分338可能最终与辅助复合物332碰撞。带切口部分338具有从其5'端读取的序列2和1，与从3'端读取的辅助底物334的2和1互补。因此，带切口部分338可以在一端(以及在中间，尽管出于与上述所讨论的第一核酸分子和第二核酸分子相同的原因，此类配对是临时终端，需要热再平衡)与辅助底物334配对。当带切口部分338与辅助底物334结合时，它将辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸336置换到溶液中。这在步骤309中形成活性复合物。在步骤305中，使用辅助底物334作为模板，通过聚合酶延伸包含带切口部分338和辅助底物334的活性复合物。如步骤206示出的，这产生了类似于延伸的第二核酸链的延伸的带切口部分。两种复合物在虚线区域不同；延伸的带切口底物具有与辅助底物中从5'到3'读取的互补序列配对的序列2、1、2、1，而第二核酸具有不与第一核酸配对的部分，随后是3、2、1序列。在步骤307中，产生切口的核酸内切酶与活性复合物结合并使延伸的带切口部分产生切口以产生相同拷贝的带切口部分，其在步骤308中或在随后的聚合酶活性过程中被释放到溶液中。然后，在步骤306中，活性复合物可以继续循环，而新释放的带切口部分可以带来另一辅助复合物以形成另一活性复合物，其依次进入循环。该过程可以指数地增长，将越来越多的复合物添加到循环中，并且指数地产生更多的带切口部分。
由于重复的循环导致越来越多的核酸分子338在溶液中积累，该积累可以被用于检测。例如，可以基于积累产生光学信号。在许多实施方案中，荧光成像可以被用于通过在流体中提供荧光探针(例如，染料或蛋白质)来检测核酸分子(例如，带切口双链或单链核酸分子)的积累，所述荧光探针在核酸分子存在时(例如，在与其结合时)在用适当波长的光照射时发出荧光。因为扩增过程300取决于分析物301的存在来运行至完成(经由第一探针和第二探针与共同分析物的结合来实现它们的接近，从而引发基于接近的相互作用并进一步触发辅助复合物的活化)，所以核酸分子338在溶液中的产生是分析物存在的指示。基于核酸分子在溶液中积累或不积累而存在或不存在荧光(或其它性质)，因此允许检测哪些流体体积含有或不含分析物。因此，通过使用方法300作为数字化测定的一部分，可以产生流体中核酸分子的数量的测量，以及相应的其它性质(如分析物浓度)。可替代地，方法300可以被用于进行分析物的模拟测量。核酸分子338在溶液中的产生速率随着溶液中存在的分析物颗粒的数量而增加；因此，所产生的核酸的量的测量(例如，通过荧光强度的测量，通过达到给定强度的时间的测量等)可以被用于产生流体中分析物的量的模拟测量。测量可以包括将测量的信号与校准的标尺进行比较，例如，以确定分析物的测量量。
图4示出了使用附接的发夹组装反应进行分析物检测的方法400。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物401。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法200可以被表征为“附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(组装反应)。
流体还可以包括第一探针410和第二探针420。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分412，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子414。第一结合部分412可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物401结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子414可以包含被配置为结合成发夹构型的碱基对的序列；例如，第一部分411可以包含与第二部分413互补的多个碱基对，在两者之间具有非互补区，使得第一部分和第二部分以发夹形状结合在一起。因为第一核酸分子与其自身结合，所以它被抑制与溶液中的互补发夹分子432配对。在一些实施方案中，第一核酸分子的3'端与结合部分结合，从而抑制聚合；然而，由于方法400不需要聚合，因此可以在不存在聚合酶的情况下进行，图4中示出的5'端和3'端可以任选地变化。然而，为了与附图一致，第一核酸分子的第一部分将被称为3'部分411，而第二部分将被称为5'部分413。
第二探针420可以包含第二结合部分422和包含第二核酸分子424的第二相互作用部分。第二结合部分422可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物401结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子424可以是例如dna分子，并且可以在5'端与结合部分422结合。第二核酸分子424可以包含与第一核酸分子的碱基对序列互补的碱基对序列，用于第二核酸分子的至少一部分；例如，3'部分411对应于第一核酸分子的自结合部分。然而，第二核酸分子也可以包括不向3'端互补第一核酸分子的部分，使得这两个分子当配对在一起时仅在每条链的中间部分彼此结合，其中每条链的一端与其各自的结合部分结合并且每条链的一端自由热移动。
在第一步402中，将第一探针410、第二探针420和分析物401各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子401结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步404，其中第一核酸分子414的3'部分411和第二核酸分子424相互作用形成复合物430。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有形成各自互补序列的多个互补碱基对，使得它们在接近时可以相互作用以在两个分子的一部分上形成双链核酸复合物，同时将第一核酸从其闭合的发夹构型展开。然后，第一核酸分子414的5'部分413在溶液中自由移动(任选地，如同第二核酸分子424末端处的剩余序列)。因为第一核酸分子的5'部分413与3'部分411互补，所以它具有与第二核酸分子412的那些碱基对匹配的碱基对(尽管匹配不需要完美，但是这两个序列应该基本上相同，使得每个充分结合3'部分411)。
流体还包含多个自由发夹分子，其包括发夹分子432。发夹分子432包括在每一端彼此互补以及与第一核酸分子414的相应端互补的碱基对序列，但顺序相反，使得发夹分子432的3'端与发夹转弯附近的第一核酸分子的一部分互补。因为游离发夹432含有与第一核酸分子的5'端411反向互补的3'端，所以两者可以结合，解折叠游离发夹432并形成双分子发夹复合物440。
在步骤408中，从溶液中抽出第二游离发夹分子434，其包含与双分子发夹复合物440的5'端反向互补的末端，通过碱基-空气相互作用展开并与复合物结合形成三分子发夹复合物450。然后，该新复合物的末端将与第二分子第一自由发夹432反向互补，以允许复合物的另一次展开和进一步延伸。即使最初与分析物的结合断裂，作为失控的发夹组装反应，该过程也可以无限地继续。然后，荧光或其它成像可以被用于以类似于以上针对图2和图3所述的方式在含分析物的体积中检测组装反应，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。例如，在存在未折叠的发夹的情况下，荧光部分可以包括在溶液中发荧光，但在存在折叠的发夹的情况下不发荧光。当发夹保持折叠时，荧光因此被淬灭，但是发夹组装反应引起荧光的级联去淬灭，因为许多发夹是未折叠的。
图5示出了使用三向接合催化发夹组装反应来进行分析物检测的方法500。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物501。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法500可以被表征为“分离的”方法，在这种意义上，尽管在流体组分附接到分析物时发生基于接近的相互作用，但是该相互作用被用于产生用于在溶液中发生的反应的催化剂，该催化剂从接合处分离。此外，方法500不需要酶；因此，不需要例如核酸聚合。
流体还可以包含第一探针510和第二探针520。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分512，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子514。第一结合部分512可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物501结合的结合位点的抗体或其部分。第二探针包含与第二核酸分子524结合的第二结合部分522。第二结合部分522可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物501结合的结合位点的抗体或其部分。
在第一步502中，将第一探针510、第二探针520和分析物501各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子501结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步504中，其中第一核酸分子514和第二核酸分子524相互作用形成复合物530。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有用于每个分子的一部分的多个互补碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物530。然后，第一核酸和第二核酸的剩余的非互补部分可以形成催化表面532，其它核酸分子可以与催化表面532相互作用。
作为此类催化相互作用的实例，在步骤506中，复合物530的催化表面532可以催化溶液中提供的第一发夹分子534和第二发夹分子536的展开。催化可以经由形成催化表面532的第一核酸分子和第二核酸分子的部分与一个或两个发夹分子的部分之间的碱基配对而发生。这些未折叠的发夹分子可以具有互补的碱基对序列，使得它们在步骤508中形成双链核酸复合物。此外，可以重复步骤506和步骤508，因为催化表面532催化另外的发夹分子对的展开，这导致发夹分子从溶液中耗尽和核酸双链的积累。然后可以用荧光或其它成像方法以类似于以上针对图2和图3所述的方式检测这些双链在含有分析物的体积中的积累，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。因此，发夹的展开可以通过类似于以上关于图4所讨论的荧光的级联去淬灭来检测。
图6示出了使用三向接合催化附接的链置换扩增来进行分析物检测的方法600。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物601。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法600可以被表征为至少部分附接的方法，在这种意义上，尽管在流体组分附接到分析物时发生基于接近的相互作用，但是该相互作用在附接到分析物时在扩增反应中继续聚合。如下所讨论的，扩增反应也可以任选地包括与分析物分离的指数扩增反应。
流体还可以包含第一探针610和第二探针620。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分612，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子614。第一结合部分612可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物601结合的结合位点的抗体或其部分。第二探针包含与第二核酸分子624结合的第二结合部分622。第二结合部分622可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物601结合的结合位点的抗体或其部分。
在第一步602中，将第一探针610、第二探针620和分析物601各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子601结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。同样在溶液中的是与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸636偶联的辅助底物634。辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸636与辅助底物634结合并抑制聚合作用。辅助底物634包含与第一核酸分子末端处或其附近的序列互补的第一部分，并且辅助底物包含与第二核酸分子末端处的序列互补的第二部分。不可延伸的阻断剂寡核苷酸636可以与辅助底物634的第一部分和第二部分的至少一部分互补并结合。因此，尽管第一核酸分子或第二核酸分子可以包含与阻断剂竞争结合辅助底物的一部分的序列，但是阻断剂可以比第一核酸分子或第二核酸分子更强地结合(例如，结合更多互补的核酸)。因此，尽管所有分子都在溶液中，但在没有与分析物结合的情况下，阻断剂不太可能被移除。
然而，当第一探针和第二探针与分析物结合时，由于第一核酸分子和第二核酸分子之间基于接近的相互作用，这种关系可能改变。这种相互作用发生在第二步604中，其中第一核酸分子614和第二核酸分子624相互作用形成复合物630。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有用于每个分子的一部分的多个互补碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物630。然后，第一核酸和第二核酸的剩余的非互补部分可以形成催化表面632，其中其它核酸分子可以与催化表面632相互作用。形成催化表面632的第一核酸分子和第二核酸分子的部分可以包含与辅助底物的第一部分和第二部分互补的部分。尽管两个部分都不足以单独可靠地克服阻断剂636与辅助底物634的结合，但是两个核酸分子一起可以形成催化表面，所述催化表面足够强地结合辅助底物以可靠地置换阻断剂。该置换发生在步骤606中，将阻断剂636释放到溶液中。
这形成了活性复合物640，其中第二核酸分子的3'端可以使用辅助底物作为模板来延伸。使用类似于图2中示出的过程，产生切口的核酸内切酶可以使延伸部分产生切口，将带切口部分释放到溶液中。在一些实施方案中，产生切口核酸内切酶包含sgrna引导的crispr-cas9。在一些实施方案中，该过程简单地重复，以大致线性的速率将带切口部分积累到溶液中。可替代地，可以将辅助底物配置为参与指数扩增反应。例如，辅助底物可以具有类似于图3中示出的的碱基对模式的碱基对模式，例如，具有从5'到3'读取的区域1*、2*、1*、2*。然后，第一核酸和第二核酸的部分可以分别呈现互补序列1和2，它们形成催化表面632。然后，溶液中带切口的延伸部分可以是该表面的拷贝，具有从5'到3'的序列1、2。然后，带切口部分可以用作自由移动的催化表面，从溶液中的附加辅助底物中置换出阻断剂，然后反过来被延伸和产生切口，以产生具有相同1、2序列的更多带切口部分。然后，该过程可以类似于图3中示出的过程，导致溶液中切口部分的指数增长积累。
无论选择哪种扩增方法，荧光或其它成像方法可以随后被用于以类似于以上针对图2和图3所述的方式检测含分析物的体积中的扩增反应，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。
在本公开的一些实施方案中，流体体积包含多个辅助底物。在某些实施方案中，至少一些辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些实施方案中，没有辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些实施方案中，流体体积包含被配置为切割延伸核酸的产生切口的核酸内切酶，并且辅助核酸链被配置为与延伸核酸的带切口部分结合。在一些实施方案中，多个辅助底物包括被设计为与核酸的延伸的带切口部分结合并使其失活的辅助底物。在某些实施方案中，设计辅助底物，其用于与核酸的延伸的带切口部分结合并通过非生产性地延伸它使其失活，以产生指数增长的阈值。设计用于与核酸的延伸的带切口部分结合以使其失活的辅助底物(本文中称为“阈值寡核苷酸”和“泄漏阈值寡核苷酸(leakagethresholdoligonucleotide)”)可以被添加到本文所公开的任何流体体积中。泄漏阈值寡核苷酸可以与产物反应并使其失活，以便在不存在靶蛋白的情况下抑制自发的指数引发。
在本公开的一些实施方案中，流体体积包含多个辅助底物。在某些实施方案中，至少一些辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些实施方案中，没有辅助底物与辅助不可延伸的阻断剂寡核苷酸结合。在一些实施方案中，流体体积包括产生扩增产物寡核苷酸(例如来自数字化等温扩增或数字化expar或数字化pcr)的扩增反应。在一些实施方案中，多个辅助底物包括被设计成与扩增产物寡核苷酸(或产物寡核苷酸)结合并使其失活的辅助底物。在某些实施方案中，辅助底物被设计成通过与扩增产物寡核苷酸结合并失活它来产生增长阈值。在某些实施方案中，辅助底物被设计成通过与扩增产物寡核苷酸结合并失活它来产生指数增长的阈值。在某些实施方案中，辅助底物被设计成与扩增产物寡核苷酸结合，并通过非生产性地延伸而使其失活，以产生增长阈值。在某些实施方案中，辅助底物被设计成与扩增产物寡核苷酸结合，并通过非生产性地延伸而使其失活，以产生指数增长的阈值。设计用于与扩增产物寡核苷酸结合的辅助底物(本文中称为“阈值寡核苷酸”和“泄漏阈值寡核苷酸”)可以被加入到本文所公开的任何流体体积中。泄漏阈值寡核苷酸可以与产物寡核苷酸反应，并使其失活，以便在没有靶标的情况下抑制自发的引发。泄漏阈值寡核苷酸可以与产物寡核苷酸反应并使其失活，以便在不存在靶标的情况下抑制自发引发和指数增长。
在一些实施方案中，多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合并使其失活的辅助底物。在一些实施方案中，多个辅助底物包含与产物寡核苷酸结合并使其失活的辅助底物。在某些实施方案中，多个辅助底物包含通过与扩增产物寡核苷酸结合而产生增长阈值的辅助底物。在某些实施方案中，多个辅助底物包含通过与扩增产物寡核苷酸结合而产生指数增长阈值的辅助底物。在某些实施方案中，多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合并通过非生产性地延伸使其失活以产生增长阈值的辅助底物。在某些实施方案中，多个辅助底物包含与扩增产物寡核苷酸结合并通过非生产性地延伸使其失活以产生指数增长的阈值的辅助底物。可以将与扩增产物寡核苷酸结合的辅助底物(本文中称为“阈值寡核苷酸”和“泄漏阈值寡核苷酸”)添加到本文所公开的任何流体体积中。
图7示出了使用附接的滚环扩增进行分析物检测的方法700。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物701。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法700可以被表征为“附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(扩增反应)。
流体还可以包含第一探针710和第二探针720。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分712，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子714。第一结合部分712可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物701结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子714与滚环底物738(例如，环状核酸分子)结合。例如，第一核酸分子714和滚环底物738可以是通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子。滚环底物738可以包含链接在一起形成环的多个核酸。由于环缺少末端，dna聚合酶的延伸被抑制。滚环底物738包含与第一核酸分子上的第一结合序列716互补的第一结合位点734。如果第一核酸分子714在3'端上与第一结合部分712结合，或者如果第一核酸分子被修饰以防止延伸(例如，用反向核苷酸)，则第一核酸分子714的聚合也可以被抑制。
第二探针720可以包含第二结合部分722和包含第二核酸分子724的第二相互作用部分。第二结合部分722可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物701结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子724可以是例如dna分子，并且可以在5'端与结合部分722结合。因此，如果提供了适当的模板，第二核酸分子724可以由聚合酶(例如dna聚合酶)延伸。
在第一步702中，将第一探针710、第二探针720和分析物701各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子701结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步704中，其中第一核酸分子714将滚环底物738转移到第二核酸分子724上。第二核酸分子具有与滚环底物738的第二结合部分736互补的碱基对序列，其可以全部或部分地与结合部分734重叠。在一些实施方案中，第二核酸分子724对第二结合位点736的亲和力可以高于第一核酸分子714对第一结合位点734的亲和力。在可替代的实施方案中，第二核酸具有与第一核酸相当或甚至更弱的亲和力，并且依赖于热平衡以最终转移滚环底物。例如，通过具有不同长度的互补碱基对序列，或者通过在一个或两个核酸分子中包括一些错配的碱基对，可以改变亲和力。当与滚环底物结合时，第二核酸分子724可以使用滚环底物作为模板从其3'端延伸。
聚合在步骤706中继续，最终延伸第二核酸分子724以形成与滚环底物738互补的环。该反应可以继续延伸第二核酸分子的3'端，根据需要解开第二核酸分子以清除聚合位点728用于进一步延伸。随着该过程在失控扩增反应中继续进行，第二核酸分子增长的越来越大。可以使用荧光或其它成像方法来检测该大链的产生。因为反应倾向于仅在含有分析物的体积中运行至完成，因此可以以类似于以上针对图2和图3所述的方式来检测此类体积，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。
图8示出了使用三向接合激活分离的滚环扩增来进行分析物检测的方法800。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物801。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法800可以被表征为“附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(扩增反应)。
流体还可以包含第一探针810和第二探针820。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分812，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子814。第一结合部分812可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物801结合的结合位点的抗体或其部分。第二探针包含与第二核酸分子824结合的第二结合部分822。第二结合部分822可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物801结合的结合位点的抗体或其部分。
在第一步802中，将第一探针810、第二探针820和分析物801各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子801结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。同样在溶液的是与不可延伸的阻断剂寡核苷酸816偶联的滚环底物838。不可延伸的阻断剂寡核苷酸816与滚环底物838结合并抑制聚合作用。滚环底物838包含与第一核酸分子末端处或其附近的序列互补的第一部分，并且滚环底物838包含与第二核酸分子末端处的序列互补的第二部分。不可延伸的阻断剂寡核苷酸816可以与滚环底物838的第一部分和第二部分的至少一部分互补并结合。因此，尽管第一核酸分子或第二核酸分子可以包含与阻断剂竞争结合滚环底物838的一部分的序列，但是阻断剂可以比第一核酸分子或第二核酸分子更强地结合(例如，结合更多互补的核酸)。因此，尽管所有分子都在溶液中，但在没有与分析物结合的情况下，阻断剂不太可能被移除。
然而，当第一探针和第二探针与分析物结合时，由于第一核酸分子和第二核酸分子之间基于接近的相互作用，这种关系可能改变。这种相互作用发生在第二步804中，其中第一核酸分子814和第二核酸分子824相互作用形成复合物830。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有用于每个分子的一部分的多个互补碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物830。然后，第一核酸和第二核酸的剩余的非互补部分可以形成催化表面832，其中其它核酸分子可以与催化表面832相互作用。形成催化表面832的第一核酸分子和第二核酸分子的部分可以包含与滚环底物838的第一部分和第二部分互补的部分。尽管两个部分都不足以单独可靠地克服阻断剂816与滚环底物838的结合，但是两个核酸分子一起可以形成催化表面，所述催化表面足够强地与滚环底物838结合以可靠地置换阻断剂。
该置换发生在步骤806中，将阻断剂816释放到溶液中。这形成了活性复合物830，其中第二核酸分子的3'端可以使用滚环底物838作为模板延伸。当聚合作用继续时，它最终延伸第二核酸分子824以形成与滚环底物838互补的环(例如参见图7，步骤706)。该反应可以继续延伸第二核酸分子的3'端，根据需要解开第二核酸分子以清除聚合位点用于进一步延伸。一旦聚合过程开始，第一核酸分子不再需要保持与滚环底物结合；实际上，一旦聚合反应循环一次，第一核酸分子必须被分离以继续使用滚环底物作为模板。复合物830可以根据需要分裂开，尽管一旦过程移动足够远，分析物附近的第一分子和第二分子的构型是无关的。事实上，当该过程继续时，两个探针可以自由地与分析物分离。随着该过程在失控扩增反应中继续进行，第二核酸分子增长的越来越大。可以使用荧光或其它检测方法(例如，其它光学或非光学检测方法)来检测该大链的产生。因为反应倾向于仅在含分析物的体积中运行至完成，因此可以以类似于以上针对图2和图3所述的方式来检测此类体积，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。
图9示出了使用分离的链置换扩增进行分析物检测的方法900。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物901。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法900可以被表征为“分离的”方法，因为尽管发生了涉及附接于分析物的流体组分的基于接近的相互作用，但是这种相互作用仅用于触发涉及从分析物分离的组分的扩增反应的引发。
流体还可以包含第一探针910和第二探针920。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分912，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子914。第一结合部分912可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物901结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子914与可延伸底物916结合。第一核酸分子914和可延伸底物916可以是例如通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子。可延伸底物916可以通过其3'端附接到第一核酸分子914的5'端而结合，因此不提供dna聚合酶作用于该末端的模板。如果第一核酸分子914在3'端处与第一结合部分912结合，则可以抑制第一核酸分子914和可延伸底物916的聚合作用。
第二探针920可以包含第二结合部分922和包含第二核酸分子924的第二相互作用部分。第二结合部分922可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物901结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子924可以是例如dna分子，并且可以与结合部分922结合。可以抑制第二核酸分子924在两端延伸。结合到结合部分的端部自然地被结合抑制延伸，并且可以是3'端或5'端。当在溶液中自由移动时，可以通过作为第二核酸分子的5'端，或者通过作为3'端但包括防止聚合作用的修饰(例如，反向3'端)来防止另一端延伸。
流体还可以包含辅助底物926，其含有与可延伸底物916互补的碱基对序列，以及位于互补碱基对序列附近的多个另外的碱基，使得如果可延伸底物916与辅助底物926的相应序列配对，则可延伸底物916可以通过聚合酶使用辅助底物926作为模板而延伸。在一些实施方案中，选择辅助底物926、可延伸底物916、第一核酸分子914和第二核酸分子924的相对亲和性，以抑制可延伸底物916从第一核酸分子914的去除，直到与第二核酸分子924接近。例如，可延伸底物916底物对第一核酸分子914的亲和力可以比对辅助底物926的亲和力更大(或类似)，但第一核酸分子914对第二核酸分子924的亲和力可以比对可延伸底物916的亲和力更大(或类似)。例如可以通过改变每个分子的匹配碱基对的各自长度来改变亲和力，以及(任选地)包括一个或多个错配碱基对以降低结合亲和力。
在第一步902中，将第一探针910、第二探针920和分析物901各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子901结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步904中，其中第一核酸分子914和第二核酸分子924相互作用形成复合物930。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有多个互补的碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物930。该相互作用可以置换可延伸底物916，然后可以将其释放到溶液中。可延伸底物916被释放到溶液中，并且可以与溶液中的辅助底物926缀合。在步骤906中，可延伸底物916通过互补碱基配对与辅助底物926结合，并且随后使用辅助底物926作为模板通过聚合酶(例如dna聚合酶)延伸。然后可以通过产生切口的核酸内切酶使延伸部分产生切口，从而可以重复该过程，导致带切口核酸部分的积累，类似于图2中所述的过程。此外，如果溶液中存在多个辅助底物926，并且如果辅助底物926的碱基对序列含有与可延伸底物916互补的重复序列(例如，针对图3所述的1*、2*、1*、2*序列，其中可延伸底物916具有1、2序列；或者更简单地说是1*、1*序列，其中可延伸底物916具有1序列)，然后扩增反应可以扩展以包括指数扩增反应中的另外的辅助底物，类似于图3所述的过程。
无论选择哪种扩增方法，荧光或其它成像方法可以随后被用于以类似于以上针对图2和图3所述的方式来检测含分析物体积中的扩增反应，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。
图10示出了使用分离的滚环扩增进行分析物检测的方法1000。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物1001。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法1000可以被表征为“分离的”方法，因为尽管发生了涉及附接于分析物的流体组分的基于接近的相互作用，但是这种相互作用仅用于触发涉及从分析物分离的组分的扩增反应的引发。
流体还可以包含第一探针1010和第二探针1020。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分1012，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子1014。第一结合部分1012可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物1001结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子1014与可延伸底物1016结合。第一核酸分子1014和可延伸底物1016可以是例如通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子。可延伸底物1016可以其3'端附接到第一核酸分子1014的5'端而结合，因此不提供dna聚合酶作用于该末端的模板。如果第一核酸分子1014在3'端处与第一结合部分1012结合，则可以抑制第一核酸分子1014和可延伸底物1016的聚合作用。
第二探针1020可以包含第二结合部分1022和包含第二核酸分子1024的第二相互作用部分。第二结合部分1022可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物1001结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子1024可以是例如dna分子，并且可以与结合部分1022结合。可以抑制第二核酸分子1024在两端延伸。结合到结合部分的端部自然地被结合抑制延伸，并且可以是3'端或5'端。当在溶液中自由移动时，可以通过作为第二核酸分子的5'端，或者通过作为3'端但包括防止聚合作用的修饰(例如，反向3'端)来防止另一端延伸。
流体还可以包含滚环底物1038，其含有与可延伸底物1016互补的碱基对序列，以及位于互补碱基对序列附近的多个另外的碱基，使得如果可延伸底物1016与滚环底物1038的相应序列配对，则可延伸底物1016可以通过聚合酶使用滚环底物1038作为模板而延伸。在一些实施方案中，选择滚环底物1038、可延伸底物1016、第一核酸分子1014和第二核酸分子924的相对亲和性，以抑制可延伸底物1016从第一核酸分子1014去除，直到与第二核酸分子1024接近。例如，可延伸底物1016底物对第一核酸分子1014的亲和力可以比对滚环底物1038的亲和力更大(或类似)，但第一核酸分子1014对第二核酸分子1024的亲和力可以比对可延伸底物1016的亲和力更大(或类似)。例如可以通过改变每个分子的匹配碱基对的各自长度来改变亲和力，以及(任选地)包括一个或多个错配碱基对以降低结合亲和力。
在第一步1002中，将第一探针1010、第二探针1020和分析物1001各自一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子1001结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步1004中，其中第一核酸分子1014和第二核酸分子1024相互作用形成复合物1030。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有多个互补碱基对1032，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物1030。该相互作用可以置换可延伸底物1016，然后可以将其释放到溶液中。可延伸底物1016被释放到溶液中，并且可以与溶液中的滚环底物1038缀合。在从第一核酸分子释放后，可延伸底物1016可以与溶液中的滚环底物1038缀合。可延伸底物1016通过互补碱基配对与滚环底物1038结合，并且随后使用滚环底物1038作为模板通过聚合酶(例如dna聚合酶)延伸。
聚合作用在步骤1006中继续，最终延伸可延伸底物1016以形成与滚环底物1038互补的环。该反应可以继续延伸第二核酸分子的3'端，根据需要解开可延伸底物1016以清除聚合位点1028用于进一步延伸。随着该过程在失控扩增反应中继续进行，可延伸底物1016增长的越来越大。可以使用荧光或其它成像方法来检测该大链的产生。因为反应倾向于仅在含有分析物的体积中运行至完成，因此可以以类似于以上针对图2和图3所述的方式来检测此类体积，并且例如可以使用类似的分析技术来确定诸如分析物数量或浓度的特性。
图11示出了使用阻断寡核苷酸的链置换触发rna聚合来进行分析物检测的方法1100。该方法可以在流体中进行；例如，在多个区室化含流体体积中的每一个中进行。在流体中提供分析物1101。例如，分析物可以是蛋白质分子。方法1100可以被表征为“附接的”方法，因为它涉及在附接于分析物的复合物中发生的反应(rna聚合)。
流体还可以包含第一探针1110和第二探针1120。第一探针包含与第一相互作用部分结合的第一结合部分1112，所述第一相互作用部分包含第一核酸分子1114。第一结合部分1112可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物1101结合的结合位点的抗体或其部分。第一核酸分子1114与阻断剂寡核苷酸1116结合。例如，第一核酸分子1114和阻断剂寡核苷酸1116可以是通过碱基配对相互作用结合在一起的dna分子。阻断剂寡核苷酸1116可以包含对其3'端(例如，反向的3'端)的修饰，使得通过dna聚合酶的模板化延伸在该端(以及天然不被dna聚合酶延伸的5'端)被抑制。如果第一核酸分子1114在3'端与第一结合部分1112结合，则第一核酸分子1114和阻断剂寡核苷酸1116都可以抑制聚合作用。阻断剂寡核苷酸1116和第一核酸分子1114可以共同构成无活性的rna聚合酶底物；例如，该分子对可以与修饰的碱基或错配形成双链dna复合物以破坏聚合酶识别位点。因此，尽管流体还可以包含rna聚合酶，但由于聚合酶识别位点的失活，rna的产生被抑制。
第二探针1120可以包含第二结合部分1122和包含第二核酸分子1124的第二相互作用部分。第二结合部分1112可以是抗体或其部分，例如，具有与分析物1101结合的结合位点的抗体或其部分。第二核酸分子1124可以是例如dna分子，并且可以在5'端与结合部分1122结合。
在第一步202中，将第一探针1110、第二探针1120和分析物1101连同rna聚合酶一起提供在流体中。第一探针和第二探针各自与共同的分析物分子1101结合，并且这种结合使两个探针接近，以允许探针的相互作用部分相互作用。
这种相互作用发生在第二步1104中，其中第一核酸分子1114和第二核酸分子1124相互作用形成复合物1130。第一核酸分子和第二核酸分子可以含有多个互补的碱基对，例如，使得它们在接近时可以相互作用以形成双链核酸复合物1130。相互作用可以置换阻断剂寡核苷酸1116，然后可以将其作为废弃物释放到溶液中。尽管包含阻断剂1116和第一核酸分子1114的复合物包含无活性rna聚合酶底物，但是包含第一核酸分子和第二核酸分子的新复合物1130包含有活性的rna聚合酶底物。
在步骤1106中，rna聚合酶与流体中的溶液中的复合物1130相互作用，转录多个rna分子1136。rna分子的积累可以使用诸如荧光成像的技术来检测，其可以被用于通过在流体中提供荧光部分来检测rna链的积累，当存在rna链时(例如，在与其结合时)，所述荧光部分在用适当波长的光照射时发荧光。
因为扩增过程1100取决于分析物1101的存在以运行至完成(经由第一探针和第二探针与共同分析物的结合来实现它们的接近，从而引发基于接近的相互作用)，所以rna链1136在溶液中的产生是分析物存在的指示。基于rna在溶液中积累或不积累而存在或不存在荧光(或其它性质)，因此允许检测哪些流体体积含有或不含分析物。因此，通过使用方法1100作为数字化测定的一部分，可以产生流体中核酸分子的数量的测量，以及相应的其它性质(如分析物浓度)。可替代地，方法1100可以被用于进行分析物的模拟测量。rna在溶液中的产生速率随着溶液中存在的分析物颗粒的数量而增加；因此，所产生的rna的量的测量(例如，通过荧光强度的测量，通过达到给定强度的时间的测量等)可以被用于产生流体中分析物的量的模拟测量。测量可以包括将测量的信号与校准的标尺进行比较，例如，以确定分析物的测量量。
任选地，由双链dna复合物1130聚合产生的rna可以被用于触发指数扩增过程，从而增强指示分析物存在的信号强度(类似于可应用于本文所公开的其它指数扩增反应的增强类型)。例如，可以采用指数扩增反应(如基于核酸序列的扩增(nasba))。然后，可以采用用于指数反应的数字化或模拟测量的检测机构(如针对图3所讨论的那些机制)来产生流体中分析物的量的测量。
在一些方面中，本文所述的系统包括计算机，所述计算机包括一个或多个处理器和其上存储有可执行指令的存储器装置。在一些方面中，计算机被用于执行本文所述的方法。在各个方面中，计算机可以被用于实现以上示出和描述的系统或方法中的任一个。在一些方面，计算机包括经由总线子系统与多个外围子系统通信的处理器。这些外围子系统可以包括存储子系统，其包括存储器子系统和文件存储子系统、用户接口输入装置、用户接口输出装置和网络接口子系统。
在一些方面中，总线子系统提供用于使计算机的各种组件和子系统能够按预期彼此通信的机制。总线子系统可以包括单个总线或多个总线。
在一些方面，网络接口子系统提供到其它计算机和网络的接口。网络接口子系统可以用作从计算机接收数据和向其它系统传输数据的接口。例如，网络接口子系统可以使计算机能够连接到因特网并便于使用因特网进行通信。
在一些方面，计算机包括用户接口输入装置(如键盘)、定点装置(如鼠标、跟踪球、触摸板或图形输入板)、扫描仪、条形码扫描仪、并入显示器中的触摸屏、音频输入装置(如语音识别系统、麦克风和其它类型的输入装置)。通常，术语“输入装置”的使用旨在包括用于向计算机输入信息的所有可能类型的装置和机制。
在一些方面，计算机包括用户接口输出装置(如显示子系统、打印机、传真机)或者非视觉显示器(如音频输出装置等)。显示子系统可以是阴极射线管(crt)、平板装置(如液晶显示器(lcd))或投影装置。通常，术语“输出装置”的使用旨在包括用于从计算机输出信息的所有可能类型的装置和机制。
在一些方面，计算机包括存储子系统，其提供用于存储基本编程和数据构造的计算机可读存储介质。在一些方面中，存储子系统存储软件(程序、代码模块、指令)，所述软件在由处理器执行时提供本文所述的方法和系统的功能性。这些软件模块或指令可以由一个或多个处理器执行。存储子系统还可以提供用于存储根据本公开使用的数据的储存库。存储子系统可以包括存储器子系统和文件/磁盘存储子系统。
在一些方面中，计算机包括存储器子系统，其可以包括多个存储器，所述存储器包括用于在程序执行过程中存储指令和数据的主随机存取存储器(ram)和其中存储有固定指令的只读存储器(rom)。文件存储子系统为程序和数据文件提供非暂时性持久(非易失性)存储，并且可以包括硬盘驱动器、软盘驱动器以及相关联的可移动介质、光盘只读存储器(cd-rom)驱动器、光学驱动器、可移动介质盒和其它类似的存储介质。
计算机可以是各种类型的，其包括个人计算机、便携式计算机、工作站、网络计算机、大型机、信息亭、服务器或任何其它数据处理系统。由于计算机和网络的不断变化的特性，在此含有的计算机的描述仅旨在作为用于说明计算机的方面的特定实例。具有比本文所述的系统更多或更少的组件的许多其它配置是可能的。
本公开的任何设备、装置、系统及其组件的具体尺寸都可以根据预期应用而容易地改变，在阅读了本公开之后，这对于本领域技术人员将是显而易见的。此外，应当理解，本文所述的实施例和方面仅用于说明性目的，并且可以向本领域技术人员建议根据其各种修改或改变，并且这些修改或改变包括在本申请的精神和范围以及所附根据权利要求的范围内。本文所述的方面的多种不同组合是可能的，并且此类组合被认为是本公开的一部分。
如本文所用的，a和/或b包括a或b中的一种或多种，以及它们的组合(如a和b)。
结合本文的任何方面或方面所讨论的所有特征可以容易地适用于本文的其它方面和方面。对于不同方面中的类似特征使用不同的术语或参考数字并不必然暗示除明确阐述的那些之外的不同。因此，本公开旨在仅通过参考所附权利要求来描述，并且不限于本文所公开的方面。
除非另有说明，当前所述的方法和过程可以以任何顺序进行。例如，描述步骤(a)、(b)和(c)的方法可以首先用步骤(a)，然后用步骤(b)，然后用步骤(c)进行。或者，该方法可以以不同的顺序进行，如例如，首先进行步骤(b)，然后进行步骤(c)，然后进行步骤(a)。此外，那些步骤可以同时或分开进行，除非特别说明。
本文所示的细节仅作为实例且出于对本发明的优选方面的说明性讨论的目的，且以提供被认为是对本发明的各个方面的原理和概念方面的最有用且容易理解的描述的原因来呈现。在这一点上，没有试图比基本理解本发明所必需的更详细地显示本发明的结构细节，结合附图和/或实施例的描述使得本领域技术人员清楚如何在实践中可以体现本发明的几种形式。
尽管本文已经显示和描述了本公开的优选方面，但是应当理解，本公开不限于所述的本公开的具体方面，因为可以进行具体方面的变化，并且这些变化仍然落入所附权利要求的范围内。还应当理解，所采用的术语是为了描述本公开的具体方面，而不是旨在限制。相反，本公开的范围由所附权利要求确定。
在提供数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限至下限的每个居间值至下限的单位的十分之一，以及在所述范围内的任何其它陈述的或居间值涵盖在本文所提供的公开内容内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，在所述范围内受任何特别排除的限制。在所述范围包括限制中的一个或两个的情况下，排除所包括的那些限制中的一个或两个的范围也包括在本文所提供的公开内容中。
结合本文的一个方面或方面讨论的所有特征可以容易地适用于本文的其它方面和方面。对于不同方面中的类似特征使用不同的术语或参考数字化并不必然暗示除明确阐述的那些之外的不同。因此，本公开旨在仅通过参考所附权利要求来描述，并且不限于本文所公开的方面。
实施例
包括以下实施例以进一步描述本公开的一些方面，并且不应用于限制本发明的范围。
实施例1
用链置换扩增(sda)检测分析物
该实施例描述了在对应于上述和图2中示出的过程的过程中的分析物检测。用于第一探针的dna是使用标准的、可商购获得的dna合成方法通过合成两部分而产生的。作为附接至结合部分的锚的dna的第一条链(dnaa)是长度为60个核苷酸的3'胺封端的寡核苷酸。合成该序列以在5'端的25个核苷酸的位置含有nb.bsrdi产生切口核酸内切酶的限制性位点。作为阻断剂的另一条链是与锚的第30-60位核苷酸互补的30个核苷酸的寡核苷酸。两个dna分子的解链温度显著高于65℃。阻断剂在其3'端用反向的dt修饰以防止被聚合酶延长。
通过将～1μm的等摩尔浓度置于合适的缓冲液(例如，40mm的tris-hcl、50mm的氯化钠)中至80℃并以0.1℃/秒缓慢冷却，使锚和阻断剂杂交。然后通过凝胶电泳纯化两部分复合物以去除任何残留的未结合的单链dna。
用于第二探针的dna是通过合成长度为30个核苷酸且序列与阻断剂相同的5'胺封端的寡核苷酸而产生的。这是合成的，以与与阻断剂相同的锚的位置杂交。对于第二探针的dna链(即dnab)，在溶液中置换阻断剂没有显著的能量优势，并且链置换反应缓慢。这样，dnab不易于与溶液中的dnaa结合。
一种针对目的靶标(例如，白细胞介素-2或il-2)aba的抗体与dnaa化学连接以形成第一探针。第二抗体abb与dnab化学连接以形成第二探针。这两种抗体都结合il-2，但在不同的表位。通过fplc或类似方法纯化dna-抗体缀合物以去除任何游离dna。
用在含有bst大片段聚合酶、nb.bsrdi产生切口的核酸内切酶的缓冲液中的两种dna-抗体缀合物并且在酶活性的合适条件(例如，40mm的tris-hcl、5mm的dtt、50mm的氯化钠、10mm的氯化镁，ph8.8，于25℃下，datp、dctp、dttp和dgtp各0.5mm，加上1/100,000稀释的sybrgreeni)下处理含有il-2的样品。在适当孵育2小时后，将温度升高至65℃以引发反应。
il-2抗体与溶液中的il-2结合，使dnaa和dnab接近。dnab置换了附接于dnaa的阻断剂。这产生了bst大片段聚合酶的活性底物。当聚合作用完成时，新产生的双链dna产物现在含有nb.bsrdi产生切口核酸内切酶的识别位点。nb.bsrdi产生单链断裂，其随后可以被聚合酶识别以置换单链产物。核酸内切酶和聚合酶的循环引起单链dna的积累。使用标准荧光检测通过来自sybrgreeni的增加的荧光来检测这种累积。
实施例2
用sda加指数扩增反应(expar)检测分析物
该实施例描述了在对应于上述和图3中示出的过程的过程中的分析物检测。根据图3中所示的方案生产合成dna。使用有效的expar模板，其具有结构域1-2-1，其中对于该具体实例，结构域1是ctcacgctac(seqidno:1)，以及结构域2是ggacgactc。还可以包括具有结构域1和随后是错配的碱基的阈值寡核苷酸，以在没有活性底物的情况下抑制假反应。使用实施例1中所述的方法，将具有如图3中示出的结构域的合成dna连接到两种各自抗体的每一种上，以形成抗体-dna缀合物。每种抗体包括与靶分析物的不同表位结合的结合位点。
总体方案涉及将样品稀释到包括抗体-dna缀合物的反应缓冲液中。如图3中示出的，当这些缀合物与靶分析物结合时，这可以释放expar的引发剂。加入expar酶、底物dna和嵌入染料，并将样品分成液滴。将反应体积加热至聚合酶活性的适当温度。在使能温度(theenablingtemperature)(对于bst聚合酶为55℃)下，反应指数地扩增已经释放的任何引物。不需要消化或连接，也不需要改变任何酶条件(缓冲液交换等)。
更具体地，按照上述实施例1中所述的方案将抗体缀合到dna上。将抗原加dna-修饰的抗体连同对照组合的所有变换一起以纳摩尔浓度混合。这些样品各自添加30μl体积的6单位的nt.bstnbi产生切口的酶、0.9u的bstdna聚合酶、0.24mm的每种dntp、3mm的mgcl2、1×evagreen、20mmtris-hclph7.9、15mm硫酸铵、30mmkcl、0.005％的tritonx-100和50nm的expar底物dna(例如，具有序列ctcacgctacggacgactctctcacgctac(seqidno:2)的寡核苷酸)的反应混合物。这是thermopol缓冲液的调整版本。thermopol缓冲液(20mm的tris-hcl；0.1％的
实施例3
用无酶催化的发夹反应检测分析物
该实施例描述了在对应于上述和图5中示出的过程的过程中的分析物检测。用于第一探针的dna是使用标准的、可商购获得的dna合成方法通过合成寡核苷酸产生的。作为附接至结合部分的锚的dna的第一条链(dnaa)是长度为60个核苷酸的3'胺封端的寡核苷酸。该序列被设计成含有dnab的结合区。
用于第二探针的dna是通过合成长度为30个核苷酸且与dnaa部分互补的序列的5'胺封端的寡核苷酸而产生的。第二探针(即dnab)的结合能在接近或低于室温的熔点下非常弱。这样，dnab不易于与溶液中的dnaa结合。
一种针对目的靶标(例如，白细胞介素-2或il-2)aba的抗体与dnaa化学连接以形成第一探针。第二抗体abb与dnab化学连接以形成第二探针。这两种抗体都结合il-2，但在不同的表位。
发夹dna1和发夹dna2被设计形成折叠结构。合成发夹dna2以含有荧光团和猝灭剂来作为分子信标。在反应缓冲液(例如，40mm的tris-hcl、150mm的氯化钠、10mm的氯化钾，ph8，于25℃下)中分别制备发夹寡核苷酸。通过加热至80℃持续3分钟，然后在冰上快速冷却，使发夹dna退火。然后将发夹dna1和发夹dna2稀释，并在反应缓冲液中与各自1nm的第一探针和第二探针各自混合至200nm的浓度。然后将含有il-2的样品加入到该混合物中。
il-2抗体与溶液中的il-2结合，使dnaa和dnab接近。dnab与dnaa结合并产生活性催化复合物。催化复合物可以与发夹dna1杂交并破坏双链茎。这使得可以获得与发夹dna2杂交的单链区域。然后发夹dna2可以与发夹dna1结合，以置换催化复合物。这导致双链产物的积累。当发夹dna2中的荧光团和猝灭剂被分离时，通过增加的荧光来检测这种积累。
实施例4
用分离的滚环扩增反应检测分析物
该实施例描述了在对应于上述和图10中示出的过程的过程中的分析物检测。用于第一探针的dna是使用标准的、可商购获得的dna合成方法通过合成两部分而产生的。作为附接至结合部分的锚的dna的第一条链(dnaa)是长度为60个核苷酸的3'胺封端的寡核苷酸。合成该序列以含有来自噬菌体m13(m13dna)的环状模板病毒基因组的一部分(16个碱基)。另一条链(引物)是与锚的第30-60位核苷酸互补的30个核苷酸的寡核苷酸。两个dna分子的解链温度显著高于65℃。引物在不适于通过聚合酶延长的位置处与dnaa结合。
通过将～1μm的等摩尔浓度置于合适的缓冲液(例如，40mm的tris-hcl、50mm的氯化钠)中至80℃，并以0.1℃/秒缓慢冷却，使锚和引物杂交。然后通过凝胶电泳纯化两部分复合物以去除任何残留的未结合的单链dna。
用于第二探针的dna(dnab)是通过合成长度为30个核苷酸且序列与引物相同的5'胺封端的寡核苷酸而产生的。3'末端也用反向碱基修饰以防止被聚合酶延长。这是合成的，以与与引物相同的锚的位置杂交。对于第二探针的dna链(即dnab)，在溶液中置换阻断剂没有显著的能量优势，并且链置换反应缓慢。这样，dnab不易于与溶液中的dnaa结合。
一种针对目的靶标(例如，白细胞介素-2或il-2)aba的抗体与dnaa化学连接以形成第一探针。第二抗体abb与dnab化学连接以形成第二探针。这两种抗体都结合il-2，但在不同的表位。通过fplc或类似方法纯化dna-抗体缀合物以去除任何游离dna。
用在含有1nm的m13dna、bst大片段聚合酶的缓冲液中的两种dna-抗体缀合物并且在酶活性的合适条件(例如，40mm的tris-hcl、5mm的dtt、50mm的氯化钠、10mm的氯化镁，ph8.8，于25℃下，datp、dctp、dttp和dgtp各0.5mm)下，加上被设计用于与m13dna的反向互补序列结合的50nm分子信标，来处理含有il-2的样品。在适当孵育2小时后，将温度升高至65℃以引发反应。
il-2抗体与溶液中的il-2结合，使dnaa和dnab接近。dnab置换了附接于dnaa的引物。该引物然后与m13dna结合以产生用于bst大片段聚合酶的活性底物。随着聚合作用的进行，新产生的滚环dna产物可以与溶液中的分子信标结合，所述新产生的滚环dna产物通过使用标准荧光检测的增加的荧光来检测。
实施例5
用链置换扩增(sda)检测分析物。
该实施例描述了在对应于上述和图2中示出的过程的过程中的分析物检测。用于第一探针的dna是使用标准的、可商购获得的dna合成方法通过合成两部分而产生的。作为附接至结合部分的锚的dna的第一条链(dnaa)是长度为60个核苷酸的3'生物素封端的寡核苷酸，并且序列为ctttaactcacactcacactcacgctacggacgactctatgatggtacctgcttctgaattctaaa(seqidno:4)。
合成该序列以在距5'端22个核苷酸的位置处含有nb.bstnbi产生切口核酸内切酶的限制性位点的模板。作为阻断剂的另一链是与锚的第21-60位核苷酸互补的40个核苷酸的寡核苷酸(序列为：tttagaattcagaagcaggtaccatcatagagtcgtcc*ginvdt(seqidno:5))。用硫代磷酸(phosphorothioate)在距3'末端1个碱基的位置(表示为*)以及3'末端处的反向dt(表示为invdt)处修饰阻断剂以防止被核酸内切酶切割或被聚合酶延长。
在合适的缓冲液(在这种情况下，1×neb等温扩增缓冲液由20mm的tris-hcl、10mm的(nh4)2so4、50mm的kcl、2mm的mgso4、0.1％的吐温20组成，ph8.8，于25℃下)中制备锚(通过uv-vis确定为1μm)和阻断剂(通过uv-vis确定为1.1μm)。通过加热至80℃并以0.1℃/秒缓慢冷却，使混合物退火。以10％摩尔过量添加阻断剂链以确保所有模板链被覆盖。两部分复合物可以任选地通过凝胶电泳分离以去除任何残留的未结合的单链dna。
用于第二探针的dna是通过合成长度为39个核苷酸且序列与阻断剂减去修饰相同的5'生物素封端的寡核苷酸而产生的(序列为：tttagaattcagaagcaggtaccatagagagtcgtccg(seqidno:6))。这是合成的，以与与阻断剂相同的锚的位置杂交。对于第二探针的dna链(即dnab)，在溶液中置换阻断剂没有显著的能量优势，并且链置换反应缓慢。这样，dnab不易于与溶液中的dnaa结合。
将两种dna复合物与探针(生物素)缀合。可以测定样品中与该探针(抗生物素蛋白)结合的靶蛋白的存在。将含有1μm抗生物素蛋白的样品与两种dna-探针复合物一起加入到含有bst大片段聚合酶、nb.bsrnbi产生切口的核酸内切酶和酶活性的适当条件(例如，如上所述的适当缓冲液，datp、dctp、dttp和dgtp各0.5mm，加上1/50,000稀释的sybrgreenii)的反应缓冲液中。将温度升高至55℃以引发反应。还制备了省去反应组分(即，省略了模板、引物、阻断剂或抗生物素蛋白)的对照反应。
生物素部分与溶液中的抗生物素蛋白结合，使dnaa和dnab接近。dnab置换了附接于dnaa的阻断剂。这产生了bst大片段聚合酶的活性底物。当聚合作用完成时，新产生的双链dna产物含有nb.bstnbi产生切口核酸内切酶的识别位点。nb.bstnbi产生单链断裂，其随后可以被bst聚合酶识别以置换单链产物。核酸内切酶和聚合酶的循环引起单链dna的积累。使用标准荧光检测通过来自sybrgreenii的增加的荧光来检测这种积累。结果如图12a-图12e中所示。
图12a显示了反应的示意图，其中接近诱导链置换以产生聚合酶和产生切口核酸内切酶的活性底物。图12b显示了随时间的荧光，这显了示dna与蛋白质结合驱动的接近效应。样品制备为：1.仅水；2.仅模板；3.含有模板和引物的阳性对照(无阻断物)；4.显示模板-阻断物的阴性对照；5.显示模板-阻断物+引物的阴性对照；和6.含有模板-阻断物、引物和靶蛋白的实验样品。含有模板-阻断物、引物和靶蛋白的样品6显示了荧光随时间显著增加。图12c显示了描绘样品1-6的相对荧光的终点荧光数码照片。虚线表示空白对照小瓶的位置。图12d显示了随时间的荧光，在具有和不具有靶蛋白的一式三份实验中进行。与不含靶蛋白的一式三份样品相比，含靶蛋白的一式三份样品显示出随时间增加的荧光。图12e显示了终点荧光数码照片，其显示了具有和不具有靶蛋白的一式三份样品的相对荧光。通过荧光数码照片，与没有靶蛋白的样品相比，具有靶蛋白的一式三份样品显示出增加的荧光。
实施例6
用expar检测溶液和液滴中的分析物
该实施例描述了在对应于上述和图3中示出的过程的过程中的分析物检测。用于第一探针的dna是使用标准的、可商购获得的dna合成方法通过合成两部分而产生的。作为附接至结合部分的锚的dna的第一条链(dnaa)是长度为60个核苷酸的3'生物素封端的寡核苷酸，并且序列为ctttaactcacactcacactcacgctacggacgactctatgatggtacctgcttctgaattctaaa(seqidno:4)。
合成该序列以在距5'端22个核苷酸的位置处含有nb.bstnbi产生切口核酸内切酶的限制性位点的模板。作为阻断剂的另一链是与锚的第34-60位核苷酸互补的32个核苷酸的寡核苷酸(序列为：tttagaattcagaagcaggtaccatcattttinvdt(seqidno:7))。用错配的聚t和在3'末端处的反向dt(表示为invdt)延伸阻断剂以防止被聚合酶延长。
在合适的缓冲液(在这种情况下，1×neb等温扩增缓冲液由20mm的tris-hcl、10mm的(nh4)2so4、50mm的kcl、12mm的mgso4、0.1％的吐温20组成，ph8.8，于25℃下)中制备锚(通过uv-vis确定为1μm)和阻断剂(通过uv-vis确定为1.1μm)。通过加热至80℃并以0.1℃/秒缓慢冷却，使混合物退火。以10％摩尔过量添加阻断剂链以确保所有模板链被覆盖。两部分复合物可以任选地通过凝胶电泳分离以去除任何残留的未结合的单链dna。
用于第二探针的dna是通过合成长度为28个核苷酸且序列与阻断剂减去错配的聚t和反向的dt修饰相同的5'生物素封端的寡核苷酸而产生的(序列为：tttagaattcagaagcaggtaccatcat(seqidno:8))。这是合成的，以与与阻断剂相同的锚的位置杂交。对于第二探针的dna链(即dnab)，在溶液中置换阻断剂没有显著的能量优势，并且链置换反应缓慢。这样，dnab不易于与溶液中的dnaa结合。
将两种dna复合物与探针(生物素)缀合。可以测定样品中与该探针(抗生物素蛋白)结合的靶蛋白的存在。将含有1μm抗生物素蛋白的样品与两种dna-探针复合物一起加入到含有bst大片段聚合酶、nb.bsrnbi产生切口的核酸内切酶和酶活性的适当条件(例如，如上所述的适当缓冲液，datp、dctp、dttp和dgtp各0.5mm，加上500nm的发夹报告子)的反应缓冲液中。发夹报告子是寡核苷酸(序列为：attgtactcacgctactacaat(seqidno:9))，其在5'末端用alexa
生物素部分与溶液中的抗生物素蛋白结合，使dnaa和dnab接近。dnab置换了附接于dnaa的阻断剂。这产生了bst大片段聚合酶的活性底物。当聚合作用完成时，新产生的双链dna产物含有nb.bstnbi产生切口核酸内切酶的识别位点。nb.bstnbi产生单链断裂，其随后可以被bst聚合酶识别以置换单链产物。核酸内切酶和聚合酶的循环导致单链dna的积累。单链产物可以作为辅助模板上的引物。辅助模板以与模板相同的方式起催化产生具有相同序列的单链产物dna的作用。这产生了产物的指数积累。通过由于产物和发夹报告子之间的结合而增加的荧光来检测产物。
反应也被封闭在液滴中。一旦如上所述制备反应混合物，就通过快速涡旋30秒在油相(用于探针的biorad液滴产生油)中使样品和反应缓冲液乳化。这产生了含有所有试剂组分的油包水液滴。在一些实施方案中，一些液滴含有靶分子，而一些液滴不含有靶分子(也称为分析物分子)。将温度升高至45℃以引发反应。在分离的液滴中bst大片段聚合酶的活性底物产生了荧光产物。非活性液滴指示无活性引发剂指数增长，并且仅显示低水平的荧光产物。在所有液滴含有反应产物的限制情况下，所有液滴都是发荧光的。结果如图13a-图13c中所示。
图13a显示了反应的示意图，其中接近诱导链置换以产生聚合酶和产生切口核酸内切酶以及随后的反应的活性底物来产生指数增长。图13b显示了随时间检测到的荧光，并且显示了由dna/探针与靶分子(或靶蛋白)结合所驱动的接近效应。制备以下样品：1.仅模板；2.含有模板和引物的阳性对照(无阻断物)；3.显示模板-阻断物的阴性对照；4.显示模板-阻断物+引物的阴性对照；和5.含有模板-阻断物、引物和靶蛋白的实验样品。阳性对照含有模板和引物，并且实验样品随时间显示出最高水平的荧光。图13c显示了所产生的荧光滴(其包围样品)的图像。顶部的三个图像显示了终点明场图像，而底部的三个图像显示了终点荧光图像。图像描绘了非活性模板(左)、活动模板(中间)和具有含反应产物的所有液滴的极限情况(右)。
序列表
<110>蓝普臻公司(lamprogen,inc.)
<120>用于蛋白质检测的数字化扩增
<130>39355-701.601
<140>
<141>
<150>62/736,972
<151>2018-09-26
<160>10
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>10
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>1
ctcacgctac10
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>2
ctcacgctacggacgactctctcacgctac30
<210>3
<211>10
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>3
gtagcgtgag10
<210>4
<211>60
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>4
ctttaactcacactcacgctacggacgactctatgatggtacctgcttctgaattctaaa60
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>5
tttagaattcagaagcaggtaccatcatagagtcgtccgt40
<210>6
<211>39
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>6
tttagaattcagaagcaggtaccatcatagagtcgtccg39
<210>7
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>7
tttagaattcagaagcaggtaccatcattttt32
<210>8
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>8
tttagaattcagaagcaggtaccatcat28
<210>9
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>9
attgtactcacgctactacaat22
<210>10
<211>15
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>10
tttttctcacgctac15
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