相关申请数据
本申请要求于2018年12月4日提交的题为“治疗嗜中性病症的方法”的美国专利申请no62/774,974，于2019年8月12日提交的题为“治疗嗜中性病症的方法”的美国专利申请no62/885,373，以及于2019年9月9日提交的题为“治疗嗜中性病症的方法”的美国专利申请no62/897,487的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
本发明涉及使用结合粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)的抗体治疗嗜中性病症的方法。
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(g-csf)是粒细胞产生的主要调节剂。g-csf由骨髓基质细胞、内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞产生，并且通过炎性刺激物诱导产生。g-csf通过g-csf受体(g-csfr)起作用，其在早期骨髓祖细胞、成熟嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、t和b淋巴细胞和内皮细胞上表达。g-csf或g-csfr缺乏的小鼠表现出显著的嗜中性白血球减少症，表明g-csf在稳态粒细胞生成中的重要性。g-csf增加嗜中性粒细胞的产生和释放，动员造血干细胞和祖细胞，并调节成熟嗜中性粒细胞的分化、寿命和效应子功能。g-csf还可以对巨噬细胞发挥作用，包括单核细胞/巨噬细胞数目的增加，吞噬细胞功能的增强以及炎性细胞因子和趋化因子产生的调节。g-csf还显示动员内皮祖细胞并诱导或促进血管生成。
尽管g-csf在治疗上例如用于治疗嗜中性白血球减少症和/或动员造血干细胞，但它在某些情况下也具有负面作用，例如炎性病症和/或癌症。例如，施用g-csf会加剧大鼠的类风湿性关节炎(ra)、小鼠胶原诱导的关节炎(cia)和cia的被动转移模型。在ra患者的血清和滑液中发现了g-csf。此外，在ra患者中发现水平升高的白介素(il-1)和肿瘤坏死因子(tnfα)，诱导人滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生g-csf。g-csf缺乏的小鼠对急性和慢性炎性关节炎的诱导有抗性。
还已经显示g-csf在多发性硬化(ms恶化)中起作用。例如，g-csf与已知恶化ms症状的干扰素γ和tnfα一样有效地增强ms的自身反应性t细胞系模型对细胞外基质的粘附。此外，g-csf缺陷小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的发展具有抗性。
g-csf和g-csfr也与癌症相关，研究显示这种信号传导途径有助于各种癌症的化疗抗性、生长、存活、侵入和转移。此外，已经显示g-csf诱导血管生成，血管生成是实体瘤发展中的重要过程。
使用吸附性粒细胞和单核细胞分离术(gma)去除髓细胞(包括嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞)也已显示可用于治疗多种病症。gma是体外处理，其中将受试者的血液泵送通过乙酸纤维素珠的柱并除去髓样细胞。目前，gma在日本被批准用于治疗溃疡性结肠炎、克罗恩(crohn)病和脓疱性银屑病。也已经报道了皮肤病学疾病(例如，坏疽性脓皮病，贝赫切特(behcet)病、泛发性脓疱性银屑病、银屑病、斯蒂尔(still)病、斯威特(sweet)病、皮肤变应性血管炎和系统性红斑狼疮)和诸如关节炎和银屑病关节炎的其他病症的临床功效(参见，kanekura,j.dermatol.,45:943-950,2018)。gma的缺点是患者必须在医院环境中进行一次或两次白细胞单采，每周五至十次，每次约一小时。这样的治疗是耗时的，对于患者是不舒服的，并且需要专门的设备和经过培训的工作人员来管理。
根据前述内容，本领域技术人员将清楚，需要降低g-csf通过g-csfr的信号传导而不诱导嗜中性白血球减少症的方法。
技术实现要素：
在导致本发明内容的工作中，本发明人寻求鉴定抗-g-csfr抗体的剂量，其能够减少受试者中循环嗜中性粒细胞的数量而不诱导严重的嗜中性粒细胞减少症或不诱导严重的嗜中性粒细胞减少症持续延长的时间段。通过减少循环嗜中性粒细胞的数量，本发明人能够治疗嗜中性粒细胞介导的病症。然而，发明人还认识到在延长的时间内不诱导严重的嗜中性粒细胞减少症以避免将受试者置于例如感染的风险中的重要性。本发明人已经鉴定了降低受试者的循环嗜中性粒细胞数目但不引起严重的嗜中性粒细胞减少症持续延长的时间段的抗体剂量。
基于发明人的发现，本发明提供了减少受试者中的循环嗜中性粒细胞连续两天以上而不引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)的方法，所述方法包括向受试者施用介于0.1mg/kg和1.0mg/kg之间剂量的抑制g-csf信号传导的化合物，例如蛋白质基抑制剂，诸如包含抗体fc区的蛋白质，例如结合g-csfr并抑制g-csf信号传导的抗体。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续三天以上。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续四天或五天或六天以上。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续七天以上。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于减少人受试者中的循环嗜中性粒细胞而不引起持续3级或4级嗜中性粒细胞减少症持续连续七天以上的方法，所述方法包括向所述受试者施用介于0.1mg/kg和1.0mg/kg之间剂量的抑制g-csf信号传导的抗体。
在一个实施例中，所述化合物是结合g-csf并抑制g-csf信号传导的抗体。在一个实施例中，所述化合物是结合g-csfr并抑制g-csf信号传导的抗体。例如，所述抗体与g-csfr结合或特异性结合，并且竞争性抑制抗体c1.2g(在本文中也称为csl324)与g-csfr的结合，所述抗体c1.2g包括含有seqidno：4所示序列的重链可变区(vh)和包含seqidno：5所示序列的轻链可变区(vl)。
在一个实施例中，受试者患有嗜中性粒细胞介导的病症。因此，本发明还提供用于治疗嗜中性粒细胞介导的病症的方法，所述方法包括向患有嗜中性粒细胞介导的病症的受试者施用介于0.1mg/kg和1.0mg/kg之间剂量的抑制g-csf信号传导(如上文和本文所述)的化合物，例如结合g-csf或g-csfr并抑制g-csf信号传导的抗体。在一个实施例中，抗体结合或特异性结合g-csfr并竞争性抑制抗体c1.2g与g-csfr的结合，抗体c1.2g包括含有seqidno：4中所示序列的vh和包含seqidno：5中所示序列的轻链可变区vl。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续两天以上。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续三天以上。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续四天或五天或六天以上。
在一个实施例中，施用抗体不会在受试者中引起3级嗜中性粒细胞减少症或4级嗜中性粒细胞减少症(或严重嗜中性粒细胞减少症)持续连续七天以上。
在一个实施例中，抗体的施用不会在受试者中引起持续的3级或4级嗜中性粒细胞减少症持续连续七天以上。
在一个实施例中，施用化合物或抗体不诱导4级嗜中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，施用所述化合物或抗体在少于10％的施用所述化合物或抗体的受试者群体中诱导4级嗜中性粒细胞减少症持续连续3天以上。
在一个实施例中，化合物或抗体的施用与感染无关，例如严重感染，诸如结核感染。
在一个实施例中，化合物或抗体的施用不诱导嗜中性粒细胞减少症或诱导2级或3级中性嗜中性粒细胞减少症持续连续两天以下。例如，施用抗体诱导2级或3级嗜中性粒细胞减少症持续36小时或更少，例如24小时或更少。
在一个实施例中，施用化合物或抗体不诱导嗜中性粒细胞减少症。因此，在一个实施例中，在用抑制g-csf信号传导的化合物或抗体治疗期间，受试者的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)保持高于约2×109/l。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞减少症与发热无关。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞减少在没有治疗的情况下消除。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞减少症与感染无关，例如严重感染，诸如结核感染。
在一个实施例中，化合物或抗体的施用在单次施用后不诱导4级嗜中性粒细胞减少症。在另一个实施例中，在多次施用，例如两次施用或三次施用或四次施用或五次施用或六次施用后，施用化合物抗体不诱导4级嗜中性粒细胞减少症。在一个实施例中，在至少三次施用后，化合物或抗体的施用不诱导4级嗜中性粒细胞减少症。
在一个实施例中，在单次施用后，化合物或抗体的施用诱导2级或3级嗜中性粒细胞减少症持续少于连续两天。在另一个实例中，在多次施用后，例如两次或三次施用或四次施用或五次施用或六次施用后，化合物或抗体的施用诱导2级或3级嗜中性粒细胞减少症持续连续两天以下。在一个实施例中，在至少三次施用后，化合物或抗体的施用诱导2级或3级嗜中性粒细胞减少症持续连续两天以下。
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和1mg/kg之间的剂量施用。例如，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.9mg/kg之间的剂量施用，例如介于0.1mg/kg和0.8mg/kg之间，例如介于0.1mg/kg和0.8mg/kg之间。在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.6mg/kg之间的剂量施用。在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.3mg/kg和0.6mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.1mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.3mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.6mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，所述化合物或抗体以多次施用。例如，所述化合物或抗体每7至35天施用一次。例如，所述化合物或抗体每14至28天施用。例如，所述化合物或抗体每20至25天施用。例如，所述化合物或抗体以多次施用，其中所述化合物或抗体每21天施用一次。在这方面，“每21天”(或任何其它数量)将被本领域技术人员理解为意指随后的施用在紧接之前施用之后的第21天进行。
化合物或抗体可以长期施用，例如数月或数年，除非另有说明，否则本发明不限于特定的时间段。
在一个实施例中，施用化合物或抗体直至病症或病症的症状消退或控制。
在一个实施例中，施用化合物或抗体以诱导病症的缓解。在另一个实例中，施用化合物以维持病症的缓解。
在一个实施例中，施用一个或多个负荷剂量的化合物，随后施用一个或多个维持剂量。通常，与维持剂量相比，负荷剂量将更高或在其间以更短的时间段施用。
在一个实施例中，化合物抗体结合包含选自seqidno：1的111-115、170-176、218-234和/或286-300的一个或两个或三个或四个区内的残基的表位。
在一个实施例中，所述抗体包含：
(i)包含seqidno：4所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：5所示氨基酸序列的vl；
(ii)包含seqidno：2所示氨基酸序列的vh和包含seqidno：3所示氨基酸序列的vl；
(iii)vh，其包括含有seqidno：4所示的氨基酸序列的vh的三个cdr；和vl，其包括含有seqidno：5所示的氨基酸序列的vl的三个cdr；或者
(iv)vh，其包括含有seqidno：2所示的氨基酸序列的vh的三个cdr；和vl，其包括含有seqidno：3所示的氨基酸序列的vl的三个cdr；
在一个实施例中，所述抗体包含：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，所述抗体包含一条包含seqidno：14所示序列的重链和一条包含seqidno：16所示序列的重链以及两条包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，抗体在包含以下抗体的混合物的组合物中施用：
(i)抗体，其包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；
(ii)抗体，其包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的；以及
(iii)抗体，其包含一条包含seqidno：14所示序列的重链和一条包含seqidno：16所示序列的重链以及两条包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一些实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是自身免疫性疾病、炎性疾病、癌症或缺血-再灌注损伤。
示例性自身免疫性病症包括自身免疫性肠病症(诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、关节炎(诸如类风湿性关节炎、银屑病关节炎和/或特发性关节炎，例如特发性幼年型关节炎)或银屑病。
示例性炎性病症包括炎性神经病症(例如，德维克(devic)病、脑中病毒感染、多发性硬化和视神经脊髓炎)，炎性肺病(例如慢性阻塞性肺病[copd]或哮喘)或炎性眼部病症(例如葡萄膜炎)。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是缺血-再灌注损伤。例如，局部缺血-再灌注损伤是由于组织或器官移植(例如移植肾)引起的或与组织或器官移植(例如移植肾)相关。例如，在器官采集之前将抗体施用给组织或器官移植接受者和/或在移植之前施用给组织或器官，或离体施用给采集的组织或器官。
在一些实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是银屑病。在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是斑块状银屑病(本领域也称为“寻常型银屑病”或“普通银屑病”)。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是嗜中性皮肤病或嗜中性皮肤病损。例如，嗜中性皮肤病是脓疱性银屑病。
在一个实施例中，所述嗜中性皮肤病选自由以下组成的组：褶皱的无菌性脓疱病(apf)；斑块状银屑病；card14-介导的脓疱性银屑病(camps)；冷吡啉相关的周期性综合征(caps)；白细胞介素-1受体缺陷(dira)；白细胞介素-36受体拮抗剂缺陷(dirta)；化脓性汗腺炎(hs)；掌跖脓疱病；化脓性关节炎；坏疽性脓皮病和痤疮(papa)；坏疽性脓皮病、痤疮、化脓性汗腺炎(pash)；坏疽性脓皮病(pg)；贝赫切特(behcet)病皮损；斯蒂尔(still)病；斯威特(sweet)综合症；角膜下脓疱病(sneddon–wilkinson)；脓疱性银屑病；掌跖脓疱病；急性泛发性发疹性脓疱病；婴儿肢端脓疱病；滑膜炎、痤疮、脓疱病；骨质增生和骨炎(sapho)综合征；肠相关皮肤病-关节炎综合征(badas)；手背嗜中性皮肤病；嗜中性小汗腺汗腺炎；持久性隆起性红斑；和坏疽性脓皮病。在一个实施例中，嗜中性皮肤病是化脓性汗腺炎(hs)或脓疱性掌跖炎(ppp)。
在一个实施例中，嗜中性皮肤病是化脓性汗腺炎(hs)。如实施例中所示，已经发现g-csf信号传导的抑制显著降低了与cxcr1相关的嗜中性细胞迁移，cxcr1是一种迁移趋化因子受体，其表达与hs疾病严重程度相关。
在一个例子中，嗜中性皮肤病是掌跖实施性脓疱病(ppp)。如实施例5所示，已经发现用抑制g-csf信号传导的抗体治疗ppp是安全和有效的。
可以使用本领域已知的任何方法测定ppp治疗的功效。例如，在一些实施例中，施用如本文公开的抗体降低pppasi得分。pppasi是基于银屑病面积和严重度指数的评估工具，其广泛用于评估慢性斑块状银屑病的严重度。以1-4的等级对包括严重程度、红斑、脓疱总数和脱皮的参数进行评分，然后针对所涉及的区域和部位(手掌或脚掌)进行校正。四个值的总和产生最终的pppasi，范围在0(无ppp)和72(最严重的ppp)。可以在筛查时，在施用本文公开的抗体之前、期间和/或之后评估pppasi以评估治疗的功效。例如，相对于施用前，在施用抗体后较低的pppasi分数是有效治疗ppp的证据。
用于评估ppp治疗功效的另一量度是palm-sole医师的全局评估(pga)。在一个实施例中，如本文所公开的抗体的施用降低了palm-sole医师总体评估(pga)评分。pga是基于红斑、鳞屑和硬结的所有银屑病损伤的平均评估。可以在筛查时，施用本文公开的抗体之前、期间和/或之后评估pga以评估治疗功效。例如，相对于施用前，在施用抗体后较低的pga分数是有效治疗ppp的证据。本文描述了用于评估治疗诸如ppp的嗜中性皮肤病的功效的其它合适的措施。
在一些实施例中，在用抑制g-csf信号传导的抗体治疗之前，受试者被诊断为患有ppp至少1年、或至少2年、或至少3年、或至少4年。
在一些实施例中，患有ppp的受试者先前已经针对ppp治疗。在一些实施例中，受试者先前已经用以下疗法中的任何一种或多种治疗：
(i)甲氨蝶呤；
(ii)阿维a；
(iii)他克莫司(tacrolimus)；
(iv)皮质类固醇；以及
(v)维生素d和皮质类固醇。
在一些实施例中，在用抑制g-csf信号传导的抗体治疗之前，患有ppp的受试者的掌跖脓疱银屑病区域严重性指数(pppasi)为至少11、或至少16、或至少21、或至少26、或至少31。因此，在一些实施例中，ppp是中度或重度ppp。在一些例子中，ppp是严重的ppp(即，至少16秒的pppasi)。
在一些实施例中，在用抑制g-csf信号传导的抗体治疗之前，患有ppp的受试者的ppp-医师全局评估(ppp-pga)评分为3(即，中度)或4(即，重度)。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗嗜中性皮肤病的方法，所述方法包括向患有嗜中性皮肤病的受试者施用0.1至1mg/kg剂量的抗体，所述抗体结合或特异性结合粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)，其中所述抗体每21天施用多次，并且其中所述抗体包括：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗嗜中性皮肤病的方法，所述方法包括向患有嗜中性皮肤病的受试者施用0.1至1mg/kg剂量的抗体，所述抗体结合或特异性结合粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)，其中所述抗体每21天施用多次，并且其中所述抗体包括：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗hs的方法，所述方法包括向患有嗜中性皮肤病的受试者施用0.1至1mg/kg剂量的抗体，所述抗体结合或特异性结合粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)，其中所述抗体每21天施用多次，并且其中所述抗体包括：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗ppp的方法，所述方法包括向患有嗜中性皮肤病的受试者施用0.1至1mg/kg剂量的抗体，所述抗体结合或特异性结合粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)，其中所述抗体每21天施用多次，并且其中所述抗体包括：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
本发明还提供了用本文所述的抗体包装的试剂盒，其包装有用于本文所述的方法的说明书。
附图说明
图1是说明如实施例1所述，在施用单剂量的0.1、0.3、0.6、0.8和1.0mg/kgc1.2g的健康受试者中，平均血清csl324浓度随时间变化的图。
图2是说明如实施例1中所述，在施用单剂量的0.1、0.3、0.6、0.8和1.0mg/kgcsl324的健康受试者中随时间推移占据靶受体(g-csfr)的百分比的图。
图3是说明如实施例2中所述，施用csl324用于治疗嗜中性皮肤病的受试者的每个群组的筛选、治疗和随访期的示意图。
图4是说明如实施例2所述，施用csl324治疗嗜中性皮肤病的受试者的群组#1的导入和群组#2的延迟开始的示意图。
图5是热图，表明如实施例1中所述，在施用单剂量的0.1、0.3、0.6、0.8和1.0mg/kgcsl324健康受试者中根据嗜中性粒细胞减少症毒性等级(即，等级1、2、3和4)的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)。
图6是热图，表明如实施例1中所述，在施用三个剂量的0.6mg/kgcsl324的健康受试者中根据嗜中性粒细胞减少症毒性等级(即，等级1、2、3和4)的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)。
图7显示了说明与细胞迁移相关的趋化因子受体cxcr1在来自hs患者的嗜中性粒细胞上的表达的图。图7a显示，与健康对照相比，cxcr1表达在hs患者样品嗜中性粒细胞中显著更高。图7b显示hs患者脓肿与结节计数和嗜中性粒细胞上cxcr1表达之间的相关性。
图8显示说明csl324对嗜中性粒细胞上g-csf诱导的cxcr1(图8a)和cxcr2(图8b)表达的影响的图。与不存在g-csf的单独培养基相比，csl324(灰色)不改变cxcr1或cxcr2的表达。与单独的培养基相比，在单独的g-csf(黑色)存在下培养嗜中性粒细胞增加了cxcr1和cxcr2的细胞表面表达。与csl324(灰色)预孵育能够减少g-csf诱导的cxcr1和cxcr2表达的上调。
图9显示说明csl324对g-csf诱导的嗜中性粒细胞迁移的影响的图。在单独存在g-csf的情况下预孵育诱导嗜中性粒细胞迁移至mip-2(图9a；黑色条)，其通过csl324减少至与单独介质对照相同的水平(图9a；灰色条)。与g-csf预孵育导致cxcr1和cxcr2的上调，这与嗜中性粒细胞向mip-2的迁移增加相关(图9b和9c)。
图10显示说明银屑病患者中嗜中性粒细胞计数和细胞迁移标志物cxcr1和cxcr2表达的图。与未受影响的对照相比，患有银屑病的人的外周血中的嗜中性粒细胞计数(图10a)显著增加。通过pasi评分评估的基于银屑病严重性的分层显示在具有10或更大的pasi评分的个体中嗜中性粒细胞计数显著升高。与具有小于10的pasi评分的个体相比，具有10或更大的pasi评分的个体中的嗜中性粒细胞:淋巴细胞比率(nlr)显著升高(图10b)。在轻度(pasi<10)和重度(pasi>10)银屑病中，cxcr2在嗜中性粒细胞表面的表达均显著升高(图10c)。没有检测到趋化因子受体cxcr1的水平的统计学显著变化(图10d)。
图11是显示每21天用五次csl324静脉注射(iv)输注处理的患有掌跖脓疱病(ppp)的人类受试者的掌跖脓疱银屑病面积严重性指数(pppasi)的图。
图12是显示每21天用五次csl324iv输注处理的患有掌跖脓疱病(ppp)的人类受试者的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)的图。垂直虚线表示csl324剂量。正常anc范围的下限和上限分别用“lln”和“uln”表示。
序列表的关键字
seqidno：1–智人g-csfr(hg-csfr)的25-335位氨基酸，具有c端多组氨酸标签
seqidno：2–c1.2的vh
seqidno：3–c1.2的vl
seqidno：4–c1.2g的vh
seqidno：5–c1.2g的vl
seqidno：6–c1.2的hcdr1
seqidno：7–c1.2的hcdr2
seqidno：8–c1.2的hcdr3
seqidno：9–c1.2的lcdr1
seqidno：10–c1.2的lcdr2
seqidno：11–c1.2的lcdr3
seqidno：12–c1.2的hcdr3的共有序列
seqidno：13–c1.2的lcdr3的共有序列
seqidno：14-c1.2g的重链，具有稳定化的igg4恒定区
seqidno：15-c1.2g的轻链，具有kappa(κ)恒定区
seqidno：16-c1.2g的重链，具有稳定化的igg4恒定区，并缺少c端赖氨酸。
具体实施方式
通则
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，提及单个步骤、物质组合物、一组步骤或一组物质组合物应理解为包含一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质组合物、一组步骤或一组物质组合物。
本领域技术人员将理解，本发明除了具体描述的之外，还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独或共同包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本发明的范围不受这里描述的特定实施例的限制，这里描述的特定实施例仅用于示例的目的。功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
除非另外明确说明，否则本文的本发明的任何实施例应被认为对本发明的任何其它实施例已作必要的变更。
除非另有明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义(例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)。
除非另有说明，本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在整个文献中都进行了描述和解释：诸如：j.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(《分子克隆实用指南》),johnwileyandsons(1984),j.sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆:实验室手册》),coldspringharbourlaboratorypress(1989),t.a.brown(编辑),essentialmolecularbiology:apracticalapproach(基本分子生物学:一种实用的方法)，第1和2卷，irlpress(1991),d.m.glover和b.d.hames(编辑),dnacloning:apracticalapproach(dna克隆:一种实用的方法)，第1-4卷,irlpress(1995和1996),和f.m.ausubel等人(编辑)，currentprotocolsinmolecularbiology(分子生物学实验指南),greenepub.associates和wiley-interscience(1988，包括到现在为止的所有更新)，edharlow和davidlane(编辑)antibodies:alaboratorymanual(抗体:实验室手册),coldspringharbourlaboratory,(1988)，和j.e.coligan等人(编辑)，currentprotocolsinimmunology(免疫学实验指南)，johnwiley&sons(包括所有更新至现在)。
本文中可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过在以下文献中的讨论进一步阐明：kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealth(免疫学相关蛋白序列),bethesda,md.,1987和1991,bork等人，jmol.biol.242,309-320,1994,chothia和leskj.molbiol.196:901-917,1987,chothia等人，nature342,877-883,1989和/或al-lazikani等人,jmolbiol273,927-948,1997。
术语“和/或”，例如“x和/或y”应被理解为表示“x和y”或“x或y”，并且应被理解为对这两种含义或无论哪种含义提供明确的支持。
在整个说明书中，单词“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
如本文所用，术语“衍生自”应理解为表示指定的整数可从特定来源获得，尽管不必直接从该来源获得。
选定的定义
本文中提及的“粒细胞集落刺激因子”(g-csf)包括天然形式的g-csf，其突变形式，例如非格司亭(filgrastim)和聚乙二醇化形式的g-csf或非格司亭。该术语还包括保持与g-csfr结合的活性并诱导信号传导的g-csf的突变形式(例如，人g-csfr)。
g-csf是粒细胞产生的主要调节剂。g-csf由骨髓基质细胞、内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞产生，并且通过炎性刺激物诱导产生。g-csf通过g-csf受体(g-csfr)起作用，其在早期骨髓祖细胞、成熟嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、t和b淋巴细胞和内皮细胞上表达。
仅出于命名而非限制的目的，人g-csfr的示例性序列在ncbi参考序列np_000751.1中列出(并且在seqidno：16中列出)。来自其他物种的g-csfr的序列可以使用本文提供的序列和/或在公众可获得的数据库中确定和/或使用标准技术确定(例如，如ausubel等人(编辑)，currentprotocolsinmolecularbiology(分子生物学实验指南),greenepub.associates和wiley-interscience(1988,包括所有更新至现在)或sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆:实验室手册》),coldspringharborlaboratorypress(1989))。提及人g-csfr可以缩写为hg-csfr，并且提及食蟹猴g-csfr可以缩写为cynog-csfr。提及可溶性g-csfr是指包含g-csfr的配体结合区的多肽。g-csfr的ig和crh结构域参与配体结合和受体二聚化(layton等人,j.biolchem.,272:29735-29741,1997和fukunaga等人,emboj.10:2855-2865,1991)。包含受体的这些部分的可溶形式的g-csfr已经用于受体的各种研究，并且在受体的位置78、163和228处的游离半胱氨酸的突变有助于在不影响配体结合的情况下表达和分离可溶受体多肽(mine等人,biochem.,43:2458-24642004)。
如本文所用，术语“嗜中性粒细胞介导的病症”应理解为涵盖由嗜中性粒细胞的活性引起的或通过去除或减少循环嗜中性粒细胞的数目实现治疗益处的任何不良病症或疾病。
如本文所用，术语“嗜中性粒细胞减少症”用于指低于正常范围的下限的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)，例如小于2000个细胞/μl血液、或小于1500个细胞/μl血液、或小于1000个细胞/μl血液、例如小于500个细胞/μl血液的anc(参见sibille等人，2010brjclinpharmacol70(5):736–748)。在一些实施例中，抑制g-csf信号传导的抗体以不引起严重中性粒细胞减少的量施用。如本文所用，术语“严重嗜中性粒细胞减少症”用于指小于1000个细胞/μl血液的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)。出于本发明的目的，以下将用于定义嗜中性粒细胞减少症的等级
·1级：<2.0×109/l(2000/mm3)和>1.1×109/l(1500/mm3)
·2级：<1.5×109/l(1500/mm3)和>1.0×109/l(1000/mm3)
·3级：<1.0×109/l(1000/mm3)和>0.5×109/l(500/mm3)
·4级：<0.5×109/l(<500/mm3)。
如本文所用，术语“预防(preventing/prevent)”包括施用本发明的抗体，从而停止或阻止病症的至少一种症状的发展。该术语还包括治疗缓解的受试者以预防或阻止复发。例如，在缓解期间治疗患有复发-缓解型多发性硬化的受试者，从而预防复发。
如本文所用，术语“治疗(treating/treat/treatment)”包括施用本文所述的抗体，从而减少或消除特定疾病或病症的至少一种症状。
如本文所用，术语“受试者”应理解为意指任何动物，包括人，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人和非人灵长类。例如，受试者是人。
本领域技术人员将意识到，“抗体”通常被认为是包含由多条多肽链(例如包含vl的多肽和包含vh的多肽)组成的可变区的抗体。抗体通常还包含恒定区，其中一些恒定区可以排列为恒定区，在重链的情况下，恒定区包括可结晶的恒定片段或片段(fc)。vh和vl相互作用形成fv，所述fv包含能够特异性结合一种或几种密切相关抗原的抗原结合区。通常，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链并且来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy抗体)，种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长类化抗体、人抗体和嵌合抗体。
术语“全长抗体”或“完整抗体”可互换使用，是指相对于抗体的抗原结合片段，基本上完整形式的抗体。具体地，全抗体包括具有包括fc区的重链和轻链的那些。恒定区可以是野生型序列恒定区(例如，人野生型序列恒定区)或其氨基酸序列变体。
如本文所用，“可变区”是指能够特异性结合抗原并且包括互补性决定区(cdr)的氨基酸序列的如本文定义的抗体的轻链和/或重链的部分；即，cdrl、cdr2、和cdr3以及框架区(fr)。示例性可变区包含三个或四个fr(例如，fr1、fr2、fr3和任选的fr4)以及三个cdr。vh指重链的可变区。vl指轻链的可变区。
如本文使用，术语“互补决定区”(syn.cdr；即，cdrl、cdr2和cdr3)是指抗体可变区的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变区通常具有鉴定为cdr1、cdr2和cdr3的三个cdr区。分配给cdr和fr的氨基酸位置可以根据免疫学感兴趣的蛋白质的kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(免疫学相关蛋白序列)，nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1987和1991，或执行本发明的其他编号系统，例如规范编号系统，chothia和leskj.molbiol.196:901-917,1987；chothia等人，nature342,877-883,1989；和/或al-lazikani等人，jmolbiol273:927-948,1997；imgt编号系统，lefranc等人，devel.andcompar.immunol.,27:55-77,2003；或aho编号系统，honnegher和plükthunj.mol.biol.,309:657-670,2001.例如，根据kabat的编号系统，vh框架区(fr)和cdr如下定位：残基1-30(frl)，31-35(cdr1)，36-49(fr2)，50-65(cdr2)，66-94(fr3)，95-102(cdr3)和103-113(fr4)。根据kabat的编号系统，vlfr和cdr如下定位：残基1–23(frl)，24-34(cdr1)，35-49(fr2)，50-56(cdr2)，57-88(fr3)，89-97(cdr3)和98-107(fr4)。本发明不限于如kabat编号系统所定义的fr和cdr，而是包括所有编号系统，包括以上所讨论的那些。在一个实施例中，本文提及的cdr(或fr)是关于根据kabat编号系统的那些区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合位点与抗原的相互作用的术语“结合”意指所述相互作用取决于抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体识别并结合特定蛋白质结构，而不是通常结合蛋白质。如果抗体结合表位“a”，则在含有标记的“a”和蛋白质的反应中，含有表位“a”(或游离的，未标记的“a”)的分子的存在将减少结合至抗体的标记的“a”的量。
如本文所用，术语“特异性结合(specificallybinds/bindsspecifically)”应理解为意指本发明的抗体与表达其的特定抗原或细胞的反应或缔合比与替代抗原或细胞的反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更大。例如，抗体以比与其他细胞因子受体或通常由多反应性天然抗体识别的抗原(例如，通过天然存在的抗体结合已知的人类天然存在的多种抗原)更大的亲和力(例如，20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍)结合g-csfr(例如，hg-csfr)。一般地，但不是必须地，对结合的提及意指特异性结合，并且每个术语应被理解为对另一个术语提供明确的支持。
如本文所用，术语“表位”(syn.“抗原决定簇”)应理解为是指抗体结合的hg-csfr区域。该术语不必限于抗体接触的特定残基或结构。例如，该术语包括跨越与蛋白质接触的氨基酸的区域和/或在该区域外的5-10或2-5或1-3个氨基酸。在一些实施例中，该表位包含当hg-csfr折叠时彼此靠近定位的一系列不连续氨基酸，即“构象表位”。例如，构象表位在对应于seqidno：1的111-115、170-176、218-234和/或286-300的一个或多个或两个或更多个或全部区域中包含氨基酸。本领域技术人员还将知道，术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包括分子的化学活性表面基团，诸如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链，并且在某些实施例中可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
术语“竞争性抑制”应理解为意指本发明的抗体(或其抗原结合位点)减少或阻止另一种抗体与g-csfr结合，例如与hg-csfr结合。这可能是由于抗体(或抗原结合位点)和其它抗体结合相同或重叠表位。从前述显而易见的是，抗体不需要完全抑制其它抗体的结合，而是仅需要以统计学显著的量降低结合，例如，至少约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％。优选地，抗体将抗体的结合降低至少约30％、更优选地至少约50％、更优选地至少约70％、还更优选地至少约75％、甚至更优选地至少约80％或85％、并且甚至更优选地至少约90％。用于测定竞争性抑制结合的方法是本领域已知的和/或本文描述的。例如，抗体在存在或不存在抗体的情况下暴露于g-csfr。如果在抗体存在下结合的抗体比在抗体不存在下结合的抗体少，则认为抗体竞争性抑制抗体的结合。在一个实施例中，竞争性抑制不是由于空间位阻。
在两个表位的上下文中，“重叠”应被认为是指两个表位共享足够数目的氨基酸残基以允许结合一个表位的抗体(或其抗原结合位点)竞争性抑制结合另一个表位的抗体(或抗原结合位点)的结合。例如，“重叠”表位共有至少1或2或3或4或5或6或7或8或9或20个氨基酸。
如本文所用，术语“中和”应理解为意指抗体能够阻断、减少或防止细胞中通过g-csfr的g-csf介导的信号传导。用于测定中和的方法是本领域已知的和/或本文描述的。
治疗嗜中性粒细胞介导的病症
在一些实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是自身免疫性疾病、炎性疾病、癌症或缺血-再灌注损伤。
示例性自身免疫性病症包括自身免疫性肠病症(诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、关节炎(诸如类风湿性关节炎、银屑病关节炎和/或特发性关节炎，例如特发性幼年型关节炎)或银屑病。
示例性炎性病症包括炎性神经病症(例如，德维克(devic)病、脑中病毒感染、多发性硬化和视神经脊髓炎)，炎性肺病(例如慢性阻塞性肺病[copd]或哮喘)或炎性眼部病症(例如葡萄膜炎)。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是缺血-再灌注损伤。例如，局部缺血-再灌注损伤是由于组织或器官移植(例如移植肾)引起的或与组织或器官移植(例如移植肾)相关。例如，在器官采集之前将抗体施用给组织或器官移植接受者和/或在移植之前施用给组织或器官，或离体施用给采集的组织或器官。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是嗜中性皮肤病或嗜中性皮肤病损。
示例性自身免疫性病症
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是类风湿性关节炎(ra)。可以根据本发明治疗ra的某些亚型。在一种情况下，通过施用本文公开的抗体来治疗中度至重度ra。在一个实施例中，受试者已证实为中度至重度ra，例如多关节ra。
本发明还提供了用于治疗可能特别难以治疗的ra患者的某些亚群的方法。例如，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗对疗法具有亚治疗反应的患者的方法，所述患者诸如对用于治疗其ra的甲氨蝶呤或肿瘤坏死因子抑制剂无应答或不耐受的患者。
本发明还提供用于基于用于测量疾病状态的指标改善受试者的ra症状的方法。使用本文公开的抗体治疗ra也可以使用本领域已知的方法测定。
测量ra严重性的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，比较治疗期间基线和各个时间点之间的触痛和肿胀关节的数量是评估关节状态和对治疗的反应的典型方式。在美国风湿病学会(acr)中，ra的关节计数(felson等人，arthritis&rheumatology38:727-735,1995)，评价68个关节的压痛和66个关节的肿胀(没有评价髋部肿胀)。在主要在欧洲使用的疾病活动性评分(das)中，在ra中使用44或28个关节计数。除了联合计数之外，acr评价标准还包括以下要素以包括综合评分：患者全局(在视觉模拟评分[vas]上，患者疼痛，医师全局，健康评估问卷(haq；功能测定)和急性期反应物(c-反应蛋白或沉淀速率)。acr20响应将构成压痛和肿胀关节计数的20％改善和复合标准中其他5个要素中至少3个的20％改善。acr50和70响应代表这些要素的至少50％和70％的改善。acr系统仅代表变化，而das系统代表疾病活动性的当前状态和变化。das评分系统采用由ra临床试验得出的加权数学公式。例如，das28为0.56(t28)+0.28(sw28)+0.70(lnesr)+0.014gh，其中t表示嫩关节数，sw为肿胀关节数，esr为红细胞沉降率，且gh为全局健康。das的各种值表示高或低疾病活动性以及缓解，并且变化和终点分数导致根据反应程度对患者分类(无，中度，良好)。
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是银屑病。如本文所用，术语“银屑病”涵盖银屑病的所有亚型，包括斑块、斑点、逆转剂、脓疱和红皮病。在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是斑块状银屑病(本领域也称为“寻常型银屑病”或“普通银屑病”)。可以根据本发明治疗银屑病的某些亚型。在一种情况下，通过施用本文公开的抗体来治疗中度至重度银屑病。在一个实施例中，受试者已证实为中度至严重银屑病，例如慢性中度至严重银屑病。
本发明还提供了用于治疗可能特别难以治疗的银屑病患者的某些亚群的方法。例如，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗对疗法具有亚治疗反应的患者的方法，所述患者诸如对用于治疗其银屑病的局部皮质类固醇或肿瘤坏死因子抑制剂无应答或不耐受的那些患者。
本发明还提供了用于基于用于测量疾病状态的指标来改善受试者中的银屑病症状的方法。使用本文公开的抗体治疗银屑病也可以使用本领域已知的方法测定。
测量银屑病严重性的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，皮肤病学家使用银屑病面积和严重程度指数(pasi)来评估银屑病疾病强度。该指标基于对银屑病皮损：红斑、浸润和脱屑三种典型征象并结合皮肤表面受累面积的定量评估。自1978年发展以来，该仪器已被临床研究者用于全世界(fredrikssont,peterssonu:dermatologica1978；157:238-41)。pasi表示为pasi50(从基线pasi改善50百分比)，pasi75(从基线pasi改善75百分比)，pasi90(从基线pasi改善90百分比)和pasi100(从基线pasi改善100百分比)。
医师全局评估(pga)用于评估银屑病活性并跟踪对治疗的临床响应。这是六点评分，其总结了相对于基线评估的总体质量(红斑、鳞屑和厚度)和斑块的程度。患者的反应评定为：糟糕，差(0-24％)，一般(25-49％)，良好(50-74％)，优异(75-99％)或被清除(100％)(vanderkerkhofp.brjdermatol137:661-662,1997)。患有银屑病的受试者的疾病状态的改善的其他措施包括临床响应，诸如皮肤病学生活质量指数(dlqi)和最小临床重要差异(mcid)，以下更详细地描述。
哮喘
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是哮喘，例如严重哮喘。在哮喘的上下文中，术语“治疗(treating/treat)”是指施用本文所述的抗体以减少、消除或预防至少一种症状的发生或恶化。例如，可以施用本文所述的抗体以预防哮喘发作。可替代地或另外地，可以施用抗体以缓解哮喘症状，诸如喘息、气短、胸闷和/或咳嗽。
在一个实施例中，哮喘是变应性哮喘。如本文所用，术语“变应性哮喘”(也称为“急性哮喘”)是指由激活位于呼吸道下气道粘膜下的肥大细胞的过敏原(例如，尘螨或花粉)引发的哮喘。肥大细胞的激活触发颗粒的释放，所述颗粒刺激鼻上皮以产生粘液并随后在气道内收缩平滑肌。这种平滑肌的收缩使气道收缩，引起哮喘症状。
在一个实施例中，哮喘是嗜中性哮喘。如本文所用，术语“嗜中性哮喘”是指特征在于受试者气道中嗜中性粒细胞量增加的哮喘亚群。嗜中性哮喘可以通过痰中的高嗜中性粒细胞计数分类，例如大于40％或大于60％的痰细胞。与嗜酸性哮喘患者相比，通常发现用皮质类固醇治疗嗜中性哮喘的反应无效。嗜中性哮喘还与气道中il-8、il-17和ifn-γ的表达上调有关。相反，特征在于气道中嗜酸性粒细胞水平增加的“嗜酸性哮喘”与il-5表达增加和th2-显性炎症应答有关。
在一个实施例中，哮喘为混合型粒细胞性哮喘。如本文所用，术语“混合型粒细胞性哮喘”是指特征在于受试者气道中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞两者的量增加的哮喘。
在一个实施例中，哮喘是严重哮喘。如本文所用，术语“严重哮喘”是指尽管用标准疗法强化治疗，但症状仅部分控制或甚至不受控制的哮喘。严重哮喘可以根据国际ers/ats关于严重哮喘的定义、评价和治疗的指导方针来定义(chung等人,eurrespirj.2014；43(2):343-73)。根据ers/ats指南，严重哮喘被定义为需要用高剂量吸入皮质类固醇(ics)加第二控制剂(例如长效β2激动剂、孟鲁司特(montelukast)或茶碱)治疗和/或用全身皮质类固醇治疗以防止其变得不受控制或尽管治疗仍保持不受控制的哮喘。
在一个实施例中，哮喘是中度哮喘。在一个实施例中，哮喘为中度或严重哮喘。如果症状每天发生，症状经常恶化并且通常持续数天，则哮喘被分类为“中度”。咳嗽和喘息会干扰正常的日常活动并使睡眠困难。夜间症状恶化每周发生一次以上。在中度哮喘中，肺功能大致在未治疗的正常的60％和80％之间。全球哮喘防治创议(gina)指南可用于对哮喘严重程度进行分类，包括中度哮喘。
在一个实施例中，哮喘是控制不佳或不受控制的哮喘。哮喘控制的水平，与严重程度相反，可以使用例如哮喘控制问题分析(acq)来确定，如下所述：等人在以下文献中描述的：juniper等人,(1999)eurrespirj14:902–907，juniper等人,respiratorymedicine(2006)100:616–621，和juniper等人,respiratorymedicine(2005)99:553–558。
在一个实施例中，哮喘是难治性哮喘。如本文所用，术语“难治性哮喘”包括具有“致命的”或“接近致命的”哮喘以及下述哮喘亚组的患者，诸如“严重哮喘”和“类固醇依赖性的和/或抗性的哮喘”、“难以控制的哮喘”、“控制不良的哮喘”、“脆性的哮喘”或“不可逆的哮喘”。当满足如下所述的一个或两个主要标准和两个次要标准时，可以根据美国胸腔社会指南定义难治性哮喘。主要标准是：为了达到控制至轻度-中度持续性哮喘水平：(1)用连续或接近连续(≥50％的一年)口服皮质类固醇治疗，2)需要用高剂量吸入皮质类固醇治疗。次要条件为：(1)需要使用除吸入的皮质类固醇以外的控制药物的每日治疗，例如，laba、茶碱或白三烯拮抗剂，(2)需要每日或接近每日使用短效β激动剂的哮喘症状，(3)持续性气道阻塞(fev1<80％预测；日呼气流量峰值(pef)变异性>20％)，(4)每年一次或多次哮喘紧急护理访视，(5)每年三次或更多次口服类固醇“突发”，(6)提示恶化，口服或吸入皮质类固醇剂量减少≤25％，(7)过去接近致命性哮喘事件。为了定义难治性哮喘，药物(μg/d)和剂量(抽吸/d)如下：(a)二丙酸倍氯米松>1,260>40次抽吸(42μg/吸入)>20次抽吸(84μg/吸入)；(b)布地奈德>1,200>6次抽吸；(c)氟尼缩松>2,000>8次抽吸；(d)丙酸氟替卡松>880>8次抽吸(110μg)，>4次抽吸(220μg)；(e)曲安奈德>2,000>20次抽吸。
“慢性哮喘”不是由过敏原引起的，而是由急性哮喘引起的炎症的结果。急性哮喘引起慢性炎症，这引起粘膜上皮对环境响应变得过敏。因此，简单的环境剂，诸如烟雾，可以刺激过敏上皮产生大量的粘液和收缩。
在一个实施例中，抗体以足以增强肺功能的量施用。肺功能可通过例如肺活量测定法来评估。在一个实施例中，抗体以足以在增加fev1(一秒钟内用力呼气量)的量施用。在一个实施例中，抗体以足以增加fvc(强迫肺活量)的量施用。fev1是在完全吸气时开始的最大呼气的第一秒中呼气的体积，并且是肺功能的一个量度。fvc是在测试期间可呼气的最大空气体积。
在一个实施例中，抗体以足以降低或防止气道高反应性(ahr)的量施用。ahr是气道对吸入的收缩激动剂的增加的敏感性，剂量-反应曲线的更陡的斜率，和对激动剂的更大的最大反应。ahr通常与肺功能减退和哮喘症状有关。例如，可用支气管激发试验评估ahr。这通常使用收缩激动剂，如乙酰甲胆碱或组胺。这些化学品也在非哮喘受试者中引发支气管痉挛，但是患有ahr的受试者对收缩激动剂具有较低的反应阈值。合适的方法描述于(fitzpatrick等人,scirep,20166:22751)。
示例性嗜中性皮肤病
在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是hs。hs是顶泌腺(在身体的某些部位发现的汗腺)和毛囊的皮肤病，其中在腹股沟中并且有时在手臂下和乳房下形成肿胀、疼痛、炎性损害或肿块。当顶泌腺出口被汗液阻塞或由于腺体发育不完全而不能正常排出时发生hs。捕获在腺体中的分泌物迫使汗液和细菌进入周围组织，引起皮下硬结、炎症和感染。hs局限于包含顶泌腺的身体区域。这些区域是腋窝、乳头乳晕、腹股沟、会阴、围肛和脐周围区域。
可以根据本发明治疗hs的某些亚型。在一种情况下，通过施用本文公开的抗体来治疗中度至重度hs。在一个实施例中，通过施用本文公开的抗体来治疗慢性hs，例如中度至重度慢性hs。在一个实施例中，受试者已证实为中度至重度hs，例如，慢性中度至重度hs。
本发明还提供了用于治疗可能特别难以治疗的hs患者的某些亚群的方法。例如，在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗对疗法具有亚治疗响应的患者的方法，所述患者诸如对用于治疗其hs的口服抗生素无应答或不耐受的那些患者。
本发明还提供用于基于用于测量疾病状态的指标改善受试者的hs症状的方法。
使用本文公开的抗体治疗hs也可以使用本领域已知的方法测定。hs的治疗可以使用本领域已知的任何措施来确定，例如，在hurley分期或sartorius分级中的改善，或本领域技术人员已知的任何措施。
例如，在一个实施例中，患有hs的受试者的hurley期的改善，或本文所述的任何措施，都是有效hs治疗的证据。在一个实施例中，根据hurley分期系统确定hs的严重性。hurley分期基于根据疾病水平将患有hs的受试者分配为三个不同的“期”之一。更具体地，i期是指单发或多发的脓肿形成，没有窦道和疤痕形成；ii期是指复发脓肿，伴有导管形成和疤痕形成，以及单个或多个广泛分开的损伤；iii期，指弥漫性或近弥漫性累及，或跨越整个区域的多个相互连接的管束和脓肿。第iii期是最严重的形式。在一种情况下，患有hs的受试者具有存在于至少两个不同解剖学区域的病损(例如左腋窝和右腋窝；或左腋和左腹股沟-脚褶)，其中之一至少为hurleyii期。在另一种情况下，所治疗的受试者具有至少一处为hurleyii期的病变。
在一种情况下，用本文公开的抗体治疗hs是通过相对于给定基线(例如，在用tnfα抑制剂治疗之前受试者的hurley期)的改善的hurley评分来确定的。在一种情况下，hurley评分的改善指示受试者的hurley值在用抗体治疗后已经改善或保持。
可以根据标准临床定义确定hs的严重程度。参见，例如，hs的hurley分期{iii与(i或ii)}(polif,jemecgbe,revuzj.,clinicalpresentation.in:jemecgbe,revuzj,leydenjj,editors.hidradenitissuppurativa.springer,newyork,2006,pp11-24)。hurleyiii期疾病是化脓性汗腺炎最严重的阶段，反映了感染部位的弥散或近弥散。
在一个实施例中，可以将sartorius分级用作测量抗体效力的指标。sartorius分级描述于：sartorius等人，britishjournalofdermatology,149:211-213。简单地说，以下结果变量在基于sartorius分级的报告中明确提及：(1)累及解剖区域(腋窝，腹股沟，臀部或其他区域或乳房下区域，左侧和/或右侧：每个累及区域3分)；(2)损伤的数量和评分(脓肿，结节，瘘，疤痕：所有累及区域的每个损伤评分：结节2；瘘4；疤痕1；其他1；(3)每个区域中两个相关病变(即结节和瘘)之间的最长距离，或者如果只有一个病变(<5cm，2；<10cm，4；>10cm，8)；和(4)所有病变均被正常皮肤明显分隔吗？在每个区域中(是0/否6)。通过为这些变量分配数值分数，疾病强度可以以临床上更有意义的方式在开放式标度上量化。可以计算总分数以及选择用于外科手术或其它介入的选定区域的分数，并随时间跟踪。
在一个实施例中，用本文公开的抗体治疗hs是根据所治疗的受试者的hiscr(化脓性汗腺炎临床反应)的实现来确定的。hiscr定义为受试者的总炎性病变(脓肿和炎性结节)计数(an计数)相对于基线减少至少50％，脓肿计数无增加，引流瘘计数无增加。在一个实施例中，受试者中hs的治疗被定义为炎性损伤(脓肿和结节)计数减少至少50％。设计hiscr评分系统，评价患者治疗前后化脓性汗腺炎的活动情况。
在另一个实施例中，用本文公开的抗体治疗hs被定义为实现如下定义的医师全局评估(pga)评分：清除(0分)，最小(1分)，或轻微(2分)，在治疗期结束时(诸如，第16周)任选地从至少1级或2级的基线pga评分改善(即减少)。基线pga评分是就在治疗开始之前测量的pga分数，将在一个疗程之后获得的pga分数与基线pga分数进行比较。
表1：pga评分
在一个实施例中，本发明提供了用于改善患有hs的受试者的dlqi评分的方法。在一种情况下，通过获得与受试者的疾病状态的“无”或“小影响”相关的评分(例如，统计学显著的分数)来确定dlqi评分的改善。
在另一个实施例中，用本文公开的抗体治疗hs定义为实现国际化脓性汗腺炎严重程度评分系统(ihs4)。ihs4是用于hs的动态严重度评估的有效工具(zouboulis等人，brjdermatol,177:1401-09,2017)，并且由于其被设计用于评估治疗反应而不是疾病严重度横截面，因此改善了hiscr评估(kimball等人，brjdermatol,171:1434-42,2014)。ihs4分数(点)＝(结节数乘以1)+(脓肿数乘以2)+[引流管(瘘/窦)数乘以4]3分或更低表示轻度hs，4-10分表示中度hs，11分或更高表示重度hs(zouboulis等人，brjdermatol,177:1401-09,2017)。在一个实施例中，受试者在治疗前具有≥4的ihs4评分。
在一个实施例中，本发明提供了用于减少患有hs的受试者中炎性病变数目(an计数)的方法，所述方法包括向受试者全身施用本文公开的抗体，使得an计数减少。an计数的减少可以是大于10％的任何值，例如，相对于基线an计数，受试者中的an计数可以降低至少50％。受试者在用本文公开的抗体治疗后也可表现出hs的其它改善，例如受试者在施用抗体后脓肿计数没有增加和/或引流瘘计数没有增加。
在一个实施例中，在一个实施例中，嗜中性粒细胞介导的病症是ppp。ppp是影响手和/或脚的足底的慢性脓疱病症。ppp可与牛皮癣或无任何皮肤病一起发生。ppp影响在手掌和足底最常见的外分泌汗腺。ppp表现为手掌和/或足底瘙痒或脓疮。ppp可在一只手或双手和/或双脚上发生。还可以看到与脓疱相关的鳞片状红色斑块。在疾病的更慢性阶段，皮肤可以是干燥的和增厚的，有深裂(皮肤中的裂痕)。在正常和感染皮肤区域之间通常有明显的分界。ppp的严重性不同，可能持续多年。这种不适可能是相当可观的，干扰工作并影响生活质量。影响指尖的一种形式的ppp称为hallopeau连续肢端皮炎或肢端脓疱病。它可以导致患指指甲毁坏。
可以根据本发明治疗ppp的某些亚型。在一种情况下，通过施用本文公开的抗体来治疗中度至重度ppp。在一个实施例中，通过施用本文公开的抗体来治疗慢性ppp，例如中度至重度慢性ppp。在一个实施例中，受试者已证实为中度至重度ppp，例如，慢性中度至重度ppp。
本发明还提供了用于治疗可能特别难以治疗的ppp患者的某些亚群的方法。例如，在一个实施例中，本发明提供了用于治疗对疗法具有亚治疗反应的患者的方法，所述患者诸如对用于治疗其ppp的局部用皮质类固醇、维生素d3类似物、依曲替酯(etretinate)和光疗的无反应。
本发明还提供用于基于用于测量疾病状态的指标改善受试者的ppp症状的方法。
使用本文公开的抗体治疗ppp也可以使用本领域已知的方法测定。ppp的治疗可以使用本领域已知的任何措施来确定，例如，通过，pppasi的改善，或本领域技术人员已知的任何措施。
pppasi是基于银屑病面积和严重度指数的评估工具，其广泛用于评估慢性斑块状银屑病的严重度。以1-4的等级对包括严重程度、红斑、脓疱总数和脱皮的参数进行评分，然后针对所涉及的区域和部位(手掌或脚掌)进行校正。这四个值的总和产生最终的pppasi，其范围在0(无ppp)和72(最严重的ppp)之间(bhushan等人，brjdermatol,145:546-53,2001)。pppasi可以在筛查时评估，之后施用。在一个实施例中，如本文所公开的抗体的施用降低pppasi评分。在一个实施例中，受试者在开始如本文所述的治疗之前具有≥12的pppasi评分。在一个实施例中，受试者在如本文所述的治疗后具有<12的pppasi评分。
在一个实施例中，施用如本文所公开的抗体降低了患有ppp的受试者的掌-足底医师全局评估(pga)评分。pga是基于红斑、鳞屑和硬结的所有银屑病损伤的平均评估(robinson,2011)。可以在施用抗体之前评估pga。
针对ppp的其他反应指标包括：pasi评分系统，研究者的全局评估模式2011(iga模式2011)，皮肤病学生活质量指数(dlqi)和受试者的全局评估(sga)，工作生产力和活动问卷损伤-银屑病(wpai-pso)，palmar-pustular生活质量指数(ppqol-index)。
抗体
示例性抗体结合g-csfr并抑制g-csf信号传导。此类抗体描述于wo2012/171057中。
示例性抗体结合g-csf并抑制g-csf信号传导。此类抗体描述于wo2018/145206中。
产生抗体的方法是本领域已知的和/或描述于harlow和lane(编辑)antibodies:alaboratorymanual(抗体:实验室手册),coldspringharborlaboratory,(1988)。通常，在这样的方法中，g-csfr或g-csf(例如，hg-csfr或hg-csf)或其区域(例如，细胞外结构域)或其免疫原性片段或表位或表达其和显示其(即，免疫原)的细胞，任选地与任何合适的或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制，施用于非人动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。免疫原可以鼻内、肌内、皮下、静脉内、真皮内、腹膜内或通过其它已知途径施用。
单克隆抗体是本发明考虑的抗体的一个示例性形式。术语“单克隆抗体”或“mab”是指能够结合相同抗原(例如结合抗原内的相同表位)的均质抗体群。该术语不旨在限制抗体的来源或其制备方式。
为了制备mab，可以使用多种已知技术中的任何一种，诸如，us4196265或harlow和lane(1988)中举例说明的步骤，同上。
或者，使用abl-myc技术(neoclone,madisonwi53713,usa)产生分泌mab的细胞系(例如，描述于largaespadaetal,j.immunol.methods.197:85-95,1996)。
例如us6300064和/或us5885793中所述，还可以通过筛查展示文库，例如噬菌体展示文库，来产生或分离抗体。例如，本发明人已经从噬菌体展示文库中分离了全人抗体。
本发明的抗体可以是合成抗体。例如，抗体为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或去免疫抗体。
在一个实施例中，本文描述的抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种(例如，鼠，诸如小鼠)或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，而链的剩余部分与衍生自另一物种(例如灵长类动物，诸如人)或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。用于产生嵌合抗体的方法描述于例如us4816567；和us5807715。
本发明的抗体可以是人源化的或人的。
术语“人源化抗体”应理解为是指具有衍生自非人物种抗体的抗原结合位点或可变区和基于人抗体的结构和/或序列的剩余抗体结构的嵌合抗体亚类。在人源化抗体中，抗原结合位点通常包含来自移植到人抗体的可变区中的适当fr上的非人抗体的互补决定区(cdr)和来自人抗体的剩余区。抗原结合位点可以是野生型的(即，与非人抗体的那些相同)或通过一个或多个氨基酸取代而修饰的。在一些情况下，人抗体的fr残基被相应的非人残基替代。
将非人抗体或其部分(例如，可变区)人源化的方法是本领域已知的。可以按照us5225539或us5585089的方法进行人源化。不排除用于使抗体人源化的其它方法。结合g-csf并抑制g-csf信号传导的示例性人源化抗体描述于wo2018/145206中。
本文所用的术语“人抗体”是指具有可变区(例如vh，vl)和任选的恒定区的抗体，所述恒定区衍生自或对应于在人中例如在人种系或体细胞中发现的序列。
示例性人抗体在本文中描述并且包括c1.2和c1.2g和/或其可变区。与非人抗体相比，这些人抗体在人中提供降低的免疫原性的优点。示例性抗体描述于wo2012/171057中，其通过引用并入本文。
抑制g-csf信号传导的另外的化合物
在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物与g-csf或g-csfr结合。在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物与g-csf结合。在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物与g-csfr结合。
在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物是蛋白质。
在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物是包含与g-csfr结合或特异性结合并中和g-csf信号传导的抗体可变区的蛋白质。本文提及“结合”g-csfr的蛋白质或抗体为“特异性结合”g-csfr的蛋白质或抗体提供字面支持。
在一些实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物是包含fv的蛋白质。在一些实施例中，蛋白质选自由以下组成的组：
(i)单链fv片段(scfv)；
(ii)二聚体scfv(di-scfv)；或者
(iv)双体；
(v)三体；
(vi)四体；
(vii)fab；
(viii)f(ab’)2；
(ix)fv；
(x)(i)至(ix)之一，其连接至抗体的恒定区、fc或重链恒定结构域(ch)2和/或ch3；或者
(xi)(i)至(ix)之一，其连接至白蛋白、其功能片段或变体或与白蛋白结合的蛋白质(例如，抗体或其抗原结合片段)；
在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物是包含抗体fc区的蛋白质。
在一个实施例中，蛋白质是以至少约5nm的亲和力与细胞表面上表达的hg-csfr的抗体结合。在一个实施例中，蛋白质是以至少约4nm的亲和力与细胞表面上表达的hg-csfr的抗体结合。在一个实施例中，蛋白质是以至少约3nm的亲和力与细胞表面上表达的hg-csfr的抗体结合。在一个实施例中，蛋白质是以至少约2nm的亲和力与细胞表面上表达的hg-csfr的抗体结合。在一个实施例中，蛋白质是以至少约1nm的亲和力与细胞表面上表达的hg-csfr的抗体结合。
在一个实施例中，蛋白质是以至少约5nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。在一个实施例中，蛋白质是以至少约4nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。
在一个实施例中，蛋白质是以至少约3nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。在一个实施例中，蛋白质是以至少约2nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。在一个实施例中，蛋白质是以至少约1nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。在一个实施例中，蛋白质是以至少约0.5nm的ic50抑制表达hg-csfr的baf3细胞的g-csf诱导的增殖的抗体。
单结构域抗体
在一些实施例中，本发明的化合物是为或包含单结构域抗体(其可与术语“结构域抗体”或“dab”互换使用)的蛋白质。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域的单个多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见，例如，us6248516)。
双体、三体、四体
在一些实施例中，本发明的蛋白质是或包含双体、三体、四体或更高级的蛋白质复合物，诸如描述于wo98/044001和/或wo94/007921中的那些。
单链fv(scfv)
本领域技术人员将知道，scfv在单多肽链中包含vh和vl区以及vh和vl之间的多肽接头，所述多肽接头使scfv能够形成抗原结合所需的结构(即，使单多肽链的vh和vl彼此缔合以形成fv)。例如，接头包含超过12个氨基酸残基，其中(gly4ser)3是scfv更有利的接头之一。
重链抗体
重链抗体在结构上不同于许多其它形式的抗体，只要它们包含重链但不包含轻链即可。因此，这些抗体也称为“仅重链的抗体”。重链抗体存在于例如骆驼和软骨鱼(也称为ignar)中。
在以下参考文献wo94/04678、wo97/49805和wo97/49805中特别找到了来自骆驼科动物的重链抗体及其可变区的一般性描述及其生产和/或分离和/或使用方法。
在参考文献wo2005/118629中特别找到了来自软骨鱼的重链抗体及其可变区的一般性描述及其生产和/或分离和/或使用方法。
其它抗体和抗体片段
本发明还考虑了其他抗体和抗体片段，诸如：
(i)如us5,731,168中所述的“钥和孔(keyandhole)”双特异性蛋白；
(ii)异源缀合蛋白，例如描述于us4,676,980；
(iii)使用化学交联剂产生的异源缀合蛋白质，例如，如描述于us4,676,980；以及
(iv)fab3(例如，如描述于ep19930302894)。
v-样蛋白
本发明的化合物的实施例是t细胞受体。t细胞受体具有结合成类似于抗体fv模块的结构的两个v-结构域。novotny等人，procnatlacadsciusa88:8646-8650,1991描述了如何将t细胞受体的两个v-结构域(称为α和β)融合并表达为单链多肽，以及如何直接改变表面残基以降低疏水性，类似于抗体scfv。描述包含两个v-α和v-β结构域的单链t细胞受体或多聚体t细胞受体的生产的其它出版物包括wo1999/045110或wo2011/107595。
包含抗原结合结构域的其它非抗体蛋白质包括具有v-样结构域的蛋白质，其通常是单体的。包含此类v-样结构域的蛋白质的示例包括ctla-4、cd28和icos。包含此类v-样结构域的蛋白质的进一步公开内容包括在wo1999/045110中。
脂联素(adnectins)
在一个实施例中，本发明的化合物是脂联素。脂联素基于人纤连蛋白的第十种纤连蛋白iii型(10fn3)结构域，其中环区域被改变以赋予抗原结合。例如，可以工程化在10fn3结构域的β-夹层的一端的三个环，以使脂联素能够特异性识别抗原。更多细节参见us20080139791或wo2005/056764。
安替卡灵(anticalins)
在另一个实例中，本发明的化合物是安替卡灵。安替卡灵衍生自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是转运诸如类固醇、胆红素、类视黄醇和脂质的小疏水分子的细胞外蛋白家族。脂质运载蛋白具有刚性β-片状二级结构，在锥形结构的开口端具有多个环，其可以被工程化以结合抗原。这样的工程化脂质运载蛋白被称为安替卡灵。关于安替卡灵的进一步描述，参见us7250297b1或us20070224633。
亲和体
在另一个实施例中，本发明的化合物是亲和体。亲和体是来源于金黄色葡萄球菌的蛋白a的z结构域(抗原结合结构域)的支架，其可以被工程化以结合抗原。z结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化产生了文库。更多细节参见ep1641818。
avimer
在另一个实施例中，本发明的化合物是avimer。avimer是衍生自a-结构域骨架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用限定的二硫键结构。多样性是通过改组a-结构域家族所显示的天然变异而产生的。更多细节参见wo2002088171。
darpin
在另一个实施例中，本发明的化合物是设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)。darpin来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白附着于细胞骨架的蛋白家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可以通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块数目可以增加它们的结合界面(亲和力成熟方法)。更多细节参见us20040132028。
可溶性g-csfr
本发明还考虑了g-csfr的可溶形式，其与天然存在的膜相关g-csfr竞争g-csf相互作用。本领域技术人员可容易地制备受体的可溶形式，参见例如美国专利no。no.5,589,456和honjoetal,actacrystallographsectfstructbiolcrystcommun.61(pt8):788-790,2005。
恒定区
可用于本发明的化合物和抗体的恒定区序列可以获自许多不同的来源。在一些实施例中，抗体的恒定区或其部分衍生自人抗体。恒定区或其部分可以衍生自任何抗体类别，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何抗体同种型，包括igg1、igg2、igg3和igg4。在一个实施例中，恒定区是人同种型igg4或稳定的igg4恒定区。
在一个实施例中，与天然或野生型人igg1或igg3fc区相比，恒定区的fc区具有降低的诱导效应子功能的能力。在一个实施例中，效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。用于评估含有fc区的蛋白质的效应子功能水平的方法是本领域已知的和/或本文描述的。
在一个实施例中，fc区是igg4fc区(即来自igg4恒定区)，例如人igg4fc区。合适的igg4fc区的序列对于本领域技术人员而言是显而易见的和/或可在公众可获得的数据库中获得(例如，从国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)获得)。
在一个实施例中，恒定区是稳定的igg4恒定区。术语“稳定的igg4恒定区”应理解为是指已经被修饰以降低fab臂交换或进行fab臂交换或形成半抗体的倾向或形成半抗体的倾向的igg4恒定区。“fab臂交换”是指人igg4的一种蛋白质修饰，其中igg4重链和连接的轻链(半分子)交换为来自另一igg4分子的重链-轻链对。因此，igg4分子可以获得识别两个不同抗原的两个不同fab臂(导致双特异性分子)。fab臂交换在体内自然发生，并且可以通过纯化的血细胞或诸如还原的谷胱甘肽的还原剂在体外诱导。当igg4抗体解离形成各自含有单重链和单轻链的两个分子时，形成“半抗体”。
在一个实施例中，稳定的igg4恒定区包含在根据kabat系统的铰链区的位置241处的脯氨酸(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterestwashingtondcunitedstatesdepartmentofhealthandhumanservices,1987和/或1991)。该位置对应于根据eu编号系统的铰链区的位置228(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterestwashingtondcunitedstatesdepartmentofhealthandhumanservices,2001和edelman等人,proc.natl.acad.usa,63,78-85,1969)。在人igg4中，该残基通常是丝氨酸。在丝氨酸取代脯氨酸之后，igg4铰链区包含序列cppc。在这方面，本领域技术人员将知道，“铰链区”是抗体重链恒定区的富含脯氨酸的部分，其连接赋予抗体的两个fab臂移动性的fc和fab区。铰链区包括参与重链间二硫键的半胱氨酸残基。通常将其定义为根据kabat的编号系统从人igg1的glu226至pro243的伸展。通过将形成重链间二硫键(s-s)键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其它igg同种型的铰链区与igg1序列比对(参见例如wo2010/080538)。
稳定的igg4抗体的另外的示例是其中人igg4(根据eu编号系统)的重链恒定区中位置409处的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代的抗体(例如wo2006/033386中所述)。恒定区的fc区可以另外地或可选地在对应于405的位置处包含选自由以下组成的组的残基：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(根据eu编号系统)。任选地，铰链区在位置241处包含脯氨酸(即，cppc序列)(如上文所述)。
在另一个实施例中，fc区是经修饰而具有降低的效应子功能的区域，即“非免疫刺激fc区”。例如，fc区是在选自由268、309、330和331组成的组的一个或多个位置处包含取代的igg1fc区。在另一个实施例中，fc区是包含以下改变中的一个或多个的igg1fc区：e233p、l234v、l235a和缺失g236和/或以下改变中的一个或多个：a327g、a330s和p331s(armour等人,eurjimmunol.29:2613-2624,1999；shields等人,jbiolchem.276(9):6591-604,2001)。非免疫刺激性fc区的其它示例描述于例如dall'acqua等人,jimmunol.177:1129-11382006；和/或hezarehjvirol；75:12161-12168,2001)。
在另一个实施例中，fc区是嵌合fc区，例如包含来自igg4抗体的至少一个ch2结构域和来自igg1抗体的至少一个ch3结构域，其中fc区在选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸位置处包含取代：240、262、264、266、297、299、307、309、323、399、409和427(eu编号)(例如，如描述于wo2010/085682)。示例性取代包括240f、262l、264t、266f、297q、299a、299k、307p、309k、309m、309p、323f、399s、和427f。
蛋白质生产
在一个实施例中，本文根据任何实施例描述的抗体是重组的。
在重组抗体的情况下，可以将编码其的核酸克隆到表达构建体或载体中，然后将其转染到宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞,昆虫细胞或哺乳动物细胞，诸如猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞或骨髓瘤细胞。用于表达抗体的示例性细胞是cho细胞、骨髓瘤细胞或hek细胞。实现这些目的分子克隆技术是本领域已知的，并且描述于例如ausubel等人(编辑),currentprotocolsinmolecularbiology,greenepub.associates和wiley-interscience(1988，包括到现在为止的所有更新)或sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1989)。多种克隆和体外扩增方法适于构建重组核酸。生产重组抗体的方法在本领域中也是已知的，参见，例如，us4816567或us5530101。
分离后，将与启动子可操作连接的核酸插入表达构建体或表达载体中，用于进一步克隆(dna扩增)或用于在无细胞系统或细胞中表达。
如本文所用，术语“启动子”在其最广泛的上下文中考虑并且包括基因组基因的转录调节序列，包括精确转录起始所需的tata盒或起始元件，具有或不具有额外调节元件(例如，上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，额外调节元件例如响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸表达。在本文中，术语“启动子”也用于描述重组的、合成的或融合的核酸或衍生物，其赋予、激活或增强与其可操作地连接的核酸的表达。示例性启动子可以含有一个或多个特异性调节元件的额外拷贝，以进一步增强所述核酸的表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指相对于核酸定位启动子，使得核酸的表达受启动子控制。
许多用于在细胞中表达的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、编码抗体的序列(例如，源自本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。本领域技术人员知道用于抗体表达的合适序列。示例性的信号序列包括原核分泌信号(例如，pelb、碱性磷酸酶、青霉素酶、ipp或热稳定肠毒素ii等)，酵母分泌信号(例如，转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹gd信号)。
在哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(cmv-ie启动)、人延长因子1-α启动子(ef1)、小核rna启动子(u1a和u1b)、α-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(sv40)、劳斯(rous)肉瘤病毒启动子(rsv)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含cmv增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂合调节元件。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是用sv40(cos-7、atcccrl、1651)转化的猴肾cv1系；人胚肾细胞系(293或293细胞，亚克隆用于在悬浮培养中生长；幼仓鼠肾细胞(bhk、atccccl10)；或中国仓鼠卵巢细胞(cho)。
适用于在诸如选自由毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和s.coli组成的组的酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于adh1启动子、gal1启动子、gal4启动子、cup1启动子、pho5启动子、nmt启动子、rpr1启动子或tef1启动子。
用于将分离的核酸或包含该核酸的表达构建体导入细胞用于表达的手段是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。将重组dna导入细胞的方法包括显微注射；deae-葡聚糖介导的转染；脂质体介导的转染，脂质体诸如使用脂转染胺(lipofectamine)(gibco，马里兰州，美国)和/或cellfectin(gibco，马里兰州，美国)；peg介导的dna摄取；电穿孔和微粒轰击，诸如使用dna包被的钨或金颗粒(agracetus公司，威斯康星州，美国)。
用于产生抗体的宿主细胞可以在多种培养基中培养，这取决于所使用的细胞类型。市售培养基，诸如ham'sfl0(sigma)、最小必需培养基((mem)，sigma)、rpml-1640(sigma)和杜氏改良伊戈尔培养基((dmem)，sigma)适于培养哺乳动物细胞。用于培养本文讨论的其它细胞类型的培养基是本领域已知的。
蛋白质的分离
分离抗体的方法是本领域已知的和/或本文描述的。
当抗体分泌到培养基中时，可首先使用市售蛋白质浓缩过滤器，例如amicon或微孔沉淀超滤单元，浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂，诸如pmsf，可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。可选择地，或附加地，上清液可以使用连续离心从表达抗体的细胞中过滤和/或分离。
从细胞制备的抗体可以使用例如离子交换、羟磷灰石层析、疏水作用层析、凝胶电泳、透析、亲和层析(例如，蛋白质a亲和层析或蛋白质g层析)或前述的任何组合来纯化。这些方法是本领域已知的并且描述于例如wo99/57134或edharlow和davidlane(编辑)，antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,(1988)。
测定抗体的活性
与g-csfr及其突变体结合
根据本文的公开内容，本发明的化合物或抗体与hg-csfr的配体结合结构域和hg-csfr的配体结合结构域的特异性突变形式(例如，seqidno：1，没有或具有某些点突变)结合和/或与人和食蟹猴g-csfr结合，对于本领域技术人员是显而易见的。用于评估与化合物或抗体的结合的方法是本领域已知的，例如，如描述于scopes(in:proteinpurification:principlesandpractice,第3版,springerverlag,1994)。这种方法通常涉及标记化合物或抗体并使其与固定化g-csfr接触。洗涤除去非特异性结合的化合物或抗体后，检测标记物的量，从而检测结合的化合物或抗体。当然，可以固定化合物或抗体并标记g-csfr信号。也可以使用淘选型测定。可选择地或者附加地，可使用表面等离子体共振分析。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置167处的赖氨酸和/或其中丙氨酸取代seqidno：1的位置168处的组氨酸，与其与seqidno：1结合的水平基本上相同(例如，10％或5％或1％内)。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置287处的精氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约100倍或150倍或160倍或200倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置287处的精氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约160倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置237处的组氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约20倍或40倍或50倍或60倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置237处的组氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约50倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置198处的蛋氨酸，比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约20倍或40倍或60倍或70倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置198处的蛋氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约40倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置172处的酪氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约20倍或30倍或40倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置172处的酪氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约40倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置171处的亮氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约100倍或120倍或130倍或140倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置171处的亮氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约140倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的a位置111处的亮氨酸，比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约20倍或40倍或60倍或70倍。在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的a位置111处的亮氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低至少约60倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1的位置168处的组氨酸，结合水平比其与seqidno：1的多肽结合的水平低不超过5倍或4倍或3倍或2倍或1倍。
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与seqidno：1的多肽结合，其中丙氨酸取代seqidno：1位置167处的赖氨酸，比其与seqidno：1的多肽结合的水平低不超过5倍或4倍或3倍或2倍或1倍。
使用生物传感器方便地测定结合水平。
本发明考虑了前述特征的任何组合。在一个实施例中，本文所述的抗体具有在前七个段落中阐述的所有结合特征。
表位图
在另一个实施例中，绘制由本文所述的化合物或抗体结合的表位。表位图方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，制备跨越hg-csfr序列或其包含目的表位的区域的一系列重叠肽，例如包含10-15个氨基酸的同属肽。然后使化合物或抗体接触每种肽并测定其结合的肽。这允许确定包含抗体结合的表位的肽。如果多个非连续肽被蛋白质结合，则抗体可结合构象表位。
可选择地或附加地，hg-csfr内的氨基酸残基通过丙氨酸扫描诱变而突变(例如参见)，并且测定降低或阻止蛋白质结合的突变。降低或阻止化合物或抗体结合的任何突变可能在由蛋白质结合的表位内。
本文例示了另一种方法，其涉及将hg-csfr或其区域与本发明的固定化化合物或抗体结合，并用蛋白酶消化所得复合物。然后分离保持与固定化蛋白质结合的肽，并使用质谱法分析，以确定它们的序列。
测定竞争性结合
用于测定竞争性抑制单克隆抗体c1.2或c1.2g的结合的化合物或抗体的测定对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，将c1.2或c1.2g缀合至可检测标记物，例如荧光标记物或放射性标记物。然后将标记的抗体和测试化合物或抗体混合并与hg-csfr或其区域(例如，包含seqidno：1的多肽)或表达其的细胞接触。然后测定标记的c1.2或c1.2g的水平，并与当标记的化合物或抗体与hg-csfr，区域或细胞在不存在测试抗体的情况下接触时测定的水平进行比较。如果在测试化合物或抗体存在下标记的c1.2或c1.2g的水平与抗体不存在下相比降低，则认为抗体竞争性抑制c1.2或c1.2g与hg-csfr的结合。
任选地，测试化合物或抗体与不同的标记物缀合至c1.2或c1.2g。这种替代标记允许检测测试抗体与hg-csfr或其区域或细胞的结合水平。
在另一个实施例中，在使hg-csfr或其区域或细胞与c1.2或c1.2g接触之前，允许化合物或抗体与hg-csfr或其区域(例如，包含seqidno：1的多肽)或表达其的细胞结合。与在化合物或抗体不存在下相比，在化合物或抗体存在下结合的c1.2或c1.2g的量的减少指示蛋白质竞争性地抑制c1.2或c1.2g与hg-csfr的结合。还可使用经标记的化合物或抗体且首先允许c1.2或c1.2g与g-csfr结合来执行互反分析。在这种情况下，与不存在c1.2或c1.2g的情况相比，在存在c1.2或c1.2g的情况下与hg-csfr结合的标记的化合物或抗体的量减少表明化合物或抗体竞争性地抑制c1.2或c1.2g与hg-csfr的结合。
可以用本文所述的hg-csfr和/或seqidno：1的突变形式和/或与c1.2或c1.2g结合的hg-csfr的配体结合区进行任何前述测定。
中和测定
在本发明的一些实施例中，化合物或抗体能够中和hg-csfr信号传导。
本领域已知用于评估化合物或抗体中和配体通过受体的信号传导的能力的各种测定法。
在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体减少或阻止g-csf与hg-csfr结合。这些测定法可以使用标记的g-csf和/或标记的蛋白作为如本文所述的竞争性结合测定法进行。
在另一个实施例中，当在g-csf存在下培养cd34+骨髓细胞时，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体减少cfu-g的形成。在这样的测定中，将cd34+骨髓细胞在存在或不存在测试化合物的情况下，在存在g-csf(例如，约10ng/ml细胞培养基)和任选地干细胞因子(例如，约10ng/ml细胞培养基)的半固体细胞培养基中培养。在粒细胞克隆(cfu-g)形成足够的时间后，确定克隆或菌落的数量。与在不存在抑制g-csf信号传导的化合物或抗体的情况下相比，在存在抑制g-csf信号传导的抗体的情况下集落数目的减少指示抑制g-csf信号传导的化合物或抗体中和g-csf信号传导。通过测试抑制g-csf信号传导的抗体的多个浓度，确定ic50，即发生cfu-g形成的最大抑制的50％时的浓度。在一个实施例中，ic50为0.2nm或更小，诸如0.1nm或更小，例如0.09nm或更小、或0.08nm或更小、或0.07nm或更小、或0.06nm或更小或0.05nm或更小。在一个实施例中，ic50为0.04nm或更小。在另一个实施例中，ic50为0.02nm或更小。前述ic50涉及本文所述的任何cfu-g测定。
在另一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体减少在g-csf存在下培养的表达hg-csfr的细胞(例如，baf3细胞)的增殖。在存在或不存在测试化合物或抗体的情况下在g-csf(例如，0.5ng/ml)存在下培养细胞。用于评价细胞增殖的方法是本领域已知的，并且包括例如mtt还原和胸苷掺入。与在没有化合物或抗体的情况下观察到的水平相比，降低增殖水平的化合物或抗体被认为中和g-csf信号传导。通过测试化合物或抗体的多个浓度，确定ic50，即，确定发生细胞增殖的最大抑制的50％时的浓度。在一个实施例中，ic50为6nm或更小，诸如5.9nm或更小。在另一个实施例中，ic50为2nm或更小、或1nm或更小、或0.7nm或更小、或0.6nm或更小、或0.5nm或更小。前述ic50涉及本文所述的任何细胞增殖测定。
在另一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体在施用g-csf后减少体内造血干细胞和/或内皮祖细胞的动员和/或在施用g-csf后(然而这不是必需的)减少体内嗜中性粒细胞的数量。例如，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体任选地在施用g-csf或其修饰形式(例如peg化g-csf或非格司亭)之前、之时或之后施用。评估造血干细胞(例如，表达cd34和/或thy1)和/或内皮祖细胞(例如，表达cd34和vegfr2)和/或嗜中性粒细胞(形态学上鉴定的和/或表达例如cd10、cd14、cd31和/或cd88)的数量。认为与在没有抗体的情况下观察到的水平相比降低细胞水平的化合物或抗体中和g-csf信号传导。在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的化合物或抗体减少嗜中性粒细胞的数目而不诱导嗜中性粒细胞减少症。
本发明考虑了用于评估g-csf信号传导的中和的其它方法。
组合物
静脉内或皮下施用本发明的化合物或抗体的组合物。在一个实施例中，静脉内施用抗体/组合物。
用于将化合物或抗体制备成适于施用的形式(例如药物组合物)的方法是本领域已知的，并且包括例如在雷明顿药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)(第18版，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990年)和美国药典：国家处方集(u.s.pharmacopeia:nationalformulary)(麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1984年)。
本发明的药物组合物特别可用于肠胃外施用，诸如静脉内施用或皮下施用。用于施用的组合物通常包含溶解在药学上可接受的载体(例如水性载体)中的抗体的溶液。可以使用各种水性载体，例如，缓冲盐水等。组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如ph调节剂和缓冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本发明的化合物在这些制剂中的浓度可以广泛变化，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等根据所选择的具体施用模式和患者的需要来选择。示例性载体包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液。可以使用非水性溶媒，诸如增强等渗性和化学稳定性的添加剂，例如，缓冲剂和防腐剂。
联合治疗
在一个实施例中，本发明的化合物或抗体与可用于治疗本文所述的疾病或病症的另一种化合物组合施用，作为组合的或附加的治疗步骤或作为治疗制剂的附加的组分。
例如，其它化合物是抗炎化合物，例如甲氨蝶呤或非甾体抗炎化合物。或者或另外，其它化合物为免疫抑制剂。可选择地或附加地，其他化合物为皮质类固醇，诸如泼尼松和/或泼尼松龙。在一个实施例中，其他化合物是甲氨蝶呤。可选择地或附加地，其他化合物是环磷酰胺。
在一个实施例中，化合物或抗体与另一种化合物同时施用。在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的抗体在另一种化合物之前施用。在一个实施例中，抑制g-csf信号传导的抗体在另一种化合物之后施用。
在一些实施例中，化合物或抗体与细胞组合施用。在一些实施例中，细胞是干细胞，诸如间充质干细胞。
在一些实施例中，化合物或抗体与基因治疗组合施用。
在一些实施例中，化合物或抗体与非药物干预联合施用，例如，分离术，诸如血浆分离术、细胞分离术、白细胞分离术、粒细胞和/或单核细胞分离术。在本文中，可以在进行非药物干预的时间段期间施用化合物或抗体，并且将被认为与非药物干预“组合”。例如，非药物干预可以是粒细胞和/或单核细胞分离术，其每周进行一次持续五周，并且可以在该时间段内施用抗体或化合物。在一个实施例中，在非药物干预之前施用抗体或化合物。在一个实施例中，在非药物干预之后施用抗体或化合物。
另一种非药物干预是光疗法。光疗法用于治疗一些嗜中性皮肤病。
剂量
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和1mg/kg之间的剂量施用。例如，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.9mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.8mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.6mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.3mg/kg和0.6mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以介于0.1mg/kg和0.3mg/kg之间的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.1mg/kg的剂量施用。在一个实施例中，化合物或抗体以0.1mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.3mg/kg的剂量施用。在一个实施例中，化合物或抗体以0.3mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，化合物或抗体以约0.6mg/kg的剂量施用。在一个实施例中，化合物或抗体以0.6mg/kg的剂量施用。
在一个实施例中，所述化合物或抗体以多次施用。例如，所述化合物或抗体每5至40天施用一次。在一些实施例中，化合物或抗体不在连续日或在同一周内施用。
例如，所述化合物或抗体每14至28天施用。例如，所述化合物或抗体每20至25天施用。
例如，每7天或8天或9天或10天或11天或12天或13天或14天或15天或16天或17天或18天或19天或20天或21天或22天或23天或24天或25天或26天或27天或28天施用化合物。
在一个实施例中，化合物每两周一次或每三周一次或每4周一次施用。
例如，所述化合物或抗体以多次施用，其中所述化合物或抗体每21天施用一次。在这方面，“每21天”(或任何其它数量)将被本领域技术人员理解为意指随后的施用在紧接之前施用之后的第21天进行。
在一个实施例中，本发明的方法包括施用与粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)结合或特异性结合的抗体，其中抗体每21天施用多次，并且其中所述抗体包括：
(i)包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；或者
(ii)包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，本发明的方法包括施用包含与粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)结合或特异性结合的抗体的组合物，其中所述抗体每21天施用多次，并且其中所述组合物包含以下中的至少两种或全部三种：
(i)抗体，其包含seqidno：14所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的轻链；
(ii)抗体，其包含seqidno：16所示序列的重链和包含seqidno：15所示序列的；和/或
(iii)抗体，其包含一条包含seqidno：16所示序列的重链和一条包含seqidno：14所示序列的重链以及两条包含seqidno：15所示序列的轻链。
在一个实施例中，将化合物或抗体施用持续设定的时间段或剂量数。例如，施用化合物或抗体持续1个月或3个月或6个月或12个月。在另一个实例中，施用五或10或15或20个剂量的抗体或化合物。
在另一个实例中，化合物或抗体是长期施用的或持续施用的，例如，持续数月或数年，并且本发明不限于特定的时间段，除非另外说明。
在一个实施例中，施用化合物或抗体直至病症或病症的症状被消退或控制。例如，在病症的“活性”形式的情况下，施用化合物或抗体直到病症不再被认为是活性的。
在hs或ppp的情况下，施用化合物或抗体直到受试者不再具有任何可见的损伤或脓疱。
在一个实施例中，施用化合物或抗体以诱导病症的缓解。在另一个实例中，施用化合物以维持病症的缓解。
在一个实施例中，施用一个或多个负荷剂量的化合物，随后施用一个或多个维持剂量。通常，与维持剂量相比，负荷剂量将更高或在其间以更短的时间段施用。
例如，将一个或两个或三个或更多个负荷剂量的抗体或化合物施用至受试者，例如，以诱导缓解，随后进行持续的维持剂量。这些维持剂量可以无限期地持续或直至受试者遭受不良反应或直至病症恢复或恶化为止，此时可能需要一个或多个负荷剂量。
在一些实施例中，负荷剂量比维持剂量高1.5倍或两倍或三倍。例如，负荷剂量可以是0.9mg/kg并且维持剂量可以是0.3mg/kg或负荷剂量可以是0.3mg/kg并且维持剂量可以是0.1mg/kg或负荷剂量可以是0.6mg/kg并且维持剂量可以是0.1mg/kg。
在一些实施例中，负荷剂量比维持剂量更频繁地施用。例如，负荷剂量每周施用或每两周施用，维持剂量每21天施用。在这种情况下，负荷剂量和维持剂量的剂量可以相同或不同。
在受试者对治疗没有充分响应的情况下，可以施用更频繁或更高的剂量。
在另一个实施例中，对于经历不良反应的受试者，剂量可以在一周中的数天或连续数天内分开。
在一个实施例中，对于经历噬中性粒细胞减少症作为不良反应的受试者，可以指导护理者停止治疗。例如，如果受试者经历超过连续2天或连续3天的噬中性粒细胞减少症，则可以停止治疗。
在一个实施例中，对于经历噬中性粒细胞减少症作为不良反应的受试者，可以指导护理者跳过下一剂量。例如，如果受试者经历超过连续2天或连续3天的噬中性粒细胞减少症，则可以跳过下一剂量。
任选地，患有噬中性粒细胞减少症的受试者可以用g-csf或gm-csf治疗以治疗噬中性粒细胞减少症。
本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的广泛一般范围的情况下，可以对上述实施例进行许多变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
实施例1-向健康成年受试者施用结合g-csfr的抗体c1.2g的安全性、药代动力学(pk)和药效学(pd)
进行1期临床试验以评价在健康受试者中单次递增剂量(部分a和b)和csl324(本文也称为c1.2g)的重复(部分c)静脉内(iv)输注的安全性和耐受性。
方法
该试验是首次在人中单中心随机双盲安慰剂对照研究，评估单次递增剂量和重复剂量的ivcsl324在健康人受试者中的安全性、耐受性、pk和药效学(pd)。该研究由3部分组成：部分a、b和c。安全性、耐受性、pk和选择的pd数据的常规盲法审查由安全性审查委员会(src)进行以指导剂量选择。本试验描述于澳大利亚新西兰临床试验注册处(anzctr)，登记号actrn12616000846426，标题：“剂量递增安慰剂对照的1期研究，以评估csl324在健康成人中的安全性和耐受性”。
部分a：单次递增剂量
部分a评估向5个连续组施用单次递增剂量的csl324(群组a1至a5)。每个群组包括6个在第1天随机接受csl324(n＝4)或安慰剂(n＝2)的受试者。计划5个连续群组的单次递增剂量为0.1、0.3、1.0、3.0和10mg/kg的csl324。按src推荐，最大施用剂量为1.0mg/kg的csl324(群组a3)。群组a4和a5分别接受0.6和0.8mg/kgcsl324的中间剂量。随访受试者直至第85天。
部分b-用g-csf攻击的单次递增剂量
部分b在g-csf攻击期间评估单次剂量的csl324。群组b1、b2和b3各包含4个在第1天随机接受csl324(n＝3)或安慰剂(n＝1)的受试者。按src推荐，群组b1接受0.1mg/kgcsl324，群组b2和群组b3分别接受0.3和0.8mg/kgcsl324。在csl324之前和之后(在第-3、-2、-1、1、2和3天)，向受试者施用g-csf攻击(5μg/kg非格司亭)。群组b4包括6个在第1天随机接受csl324(n＝4)或安慰剂(n＝2)的受试者。受试者接受0.8mg/kgcsl324并且仅在csl324之后(在第2、3和4天)施用g-csf攻击(5μg/kg非格司亭)。随访受试者直至第85天。
部分c-重复剂量
部分c评估以21天间隔施用的3次重复剂量的csl324(第1、22和43天)。十名受试者随机接受csl324(n＝6)或安慰剂(n＝4)。受试者按src推荐施用0.6mg/kgcsl324。随访受试者直至第126天。
安全性、药代动力学(pk)和药效学(pd)评估
在所有研究部分中，安全性评估包括：不良事件(ae)；生命体征，包括直立挑战、身体和神经学检查、12导联心电图(ecg)、使用ecg遥测的心脏监测；临床实验室测试(血液学、血液化学、凝血和尿分析)，在视觉模拟量表上测量的疲劳和csl324免疫原性。
在血清(所有群组)和脑脊液(仅群组a5)中测量csl324。
pd评估包括嗜中性粒细胞功能属性(噬菌活性、氧化突发活性、g-csf受体磷酸信号传导子和转录激活剂-3[pstat-3]信号传导[仅a部分]，以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[gm-csf]pstat-3信号传导[仅部分a和部分c]；嗜中性粒细胞g-csf受体占用率/饱和(仅部分a和部分c)以及血清g-csf、细胞因子和趋化因子。
诊断和主要纳入标准
健康男性或女性受试者，18至55岁，体重指数为18.5至32.0kg/m2(包括端点)，体重≥50kg且≤100kg，提供书面知情同意书。女性受试者为非育龄期；男性受试者及其育龄期女性配偶/伴侣从筛查到最后iv输注后90天使用2种形式的高度有效的节育。
如研究者所判断，受试者将被排除如果其具有下述历史或证据：任何临床上显著的心血管、胃肠、内分泌、血液学、肝脏、免疫学、代谢、泌尿学、肺部、神经病学、皮肤病学、精神病学、肾脏和/或其它重大疾病或恶性肿瘤；静脉血栓形成、红细胞增多症或血友病史；自身免疫性疾病的病史；周期性噬中性粒细胞减少症或筛查绝对中性粒细胞计数(anc)<2.0×109/l；在筛查或现场入院时鉴定的任何临床显著异常；在筛查时或入院时脉率<40或>100次/分钟，平均收缩压>145mmhg，或平均舒张压>90mmhg；筛查时使用fridericia公式校正的平均qt间期>450msec；或在iv输注前10天内使用任何处方药或非处方药，但偶尔使用扑热息痛(最多2g/天)。仅对于部分a和b，如果受试者具有任何纹身或受损的皮肤健康、或瘢痕疙瘩形成史、肥厚性疤痕或淋巴管炎，则排除受试者。
csl324抗体剂量和施用模式
csl324以10ml小瓶中的无菌注射溶液提供。在第1天和群组剂量以由受试者的体重确定的体积iv施用csl324。
根据第1天的受试者体重和群组剂量，以与csl324相等的体积iv施用安慰剂，0.9％氯化钠。
使用注射泵在前臂静脉中在60±5分钟内给予所有csl324输注(剂量≤1.0mg/kg)。
治疗持续时间
部分a或b中的受试者在第1天接受作为单剂量的csl324或安慰剂，并随访直至第85天。部分c中的受试者在第1、22和43天以21天间隔接受3个剂量的csl324或安慰剂，并进行随访直至第126天。
评价标准：
主要终点：研究期间ae的发病率、因果关系和严重性。
次要终点：
·csl324在血清中的药代动力学参数：
部分a、b：
auc0-inf-从时间0外推至时间无穷大的浓度-时间曲线下的面积
auc0-t-从时间0到收集时间t的浓度-时间曲线下的面积
cmax-最大浓度
cltot-iv给药后的总全身清除率
tmax-最大浓度时间
t1/2-末端消除半衰期
vz-在终末消除期间iv给药后的分布体积
部分c：
auc0-t-从时间0到收集时间t的浓度-时间曲线下的面积
auc0-tau-在稳定状态下的给药间隔期间的浓度-时间曲线下的面积
cmin,ss-稳态下的最小(波谷)浓度
cmax,ss-稳态下的最大浓度
tmax,ss-稳态下最大浓度的时间
t1/2,ss-稳态下的末端消除半衰期
cltot,ss-在iv给药后的稳态下的总全身清除率
vz,ss-在终末消除期间iv给药后的稳态分布体积
·脑脊液中csl324和g-csf浓度(仅群组a5)
·血清中抗csl324抗体的存在。
·在csl324或安慰剂给药(仅部分b)后的g-csf挑战后，anc的非房室pd参数，包括从第1天的anc的最大效应(emax)和从时间0至24小时的anc的效应曲线下面积(auec0-24,anc)。
统计方法
分析群体
全分析集(fas)包括提供书面知情同意书并符合筛查后纳入研究条件的所有受试者。fas用于人口统计学、基线特征和免疫原性。
安全性群体包括接受至少1剂csl324的所有受试者，根据接受的剂量和药物分析，并用于所有安全性分析。
pk群体包括接受至少1剂csl324并具有至少1个测量的pk浓度的所有受试者，并用于所有pk分析。
pd群体包括接受至少1个剂量的csl324并且在csl324输注前和csl324输注后至少1个时间点获得pd数据的所有受试者。pd群体用于所有pd分析。
一般考虑
所有数据均按受试者列出。总结统计采用描述性统计。除非另有说明，所有统计测试均为2侧的，并且以5％的显著性水平进行。
药代动力学(pk)分析
pk参数通过使用实际取样时间的标准非室分析从血清csl324浓度获得。分别评估部分a和部分b中单剂量群组的pk参数cmax、auc0-t和auc0-inf的剂量比例性。使用包括log-转换的体重调节的剂量水平作为自变量的功率模型分析剂量比例性。如果90％置信区间(ci)在0.85至1.15的临界区间内，则可以声明pk参数与剂量之间的线性比例性。使用pearson相关分析研究部分a和部分b的pk参数cmax、auc0-t、和auc0-inf与总剂量(mg)和体重调节剂量(mg/kg)的相关性。
使用混合效应模型(治疗为固定效应且受试者为随机效应)和经对数转换的pk参数cmax、auc0-t和auc0-inf来评估没有共同施用g-csf(部分a)和共同施用g-csf(部分b)的csl324的相对生物利用度。如果对于任何比较，几何平均比率的90％ci在80％和125％之间，则认为不与(部分a)和与(部分b)共同施用g-csf的csl324是等同的。
在每21天3剂csl324(部分c)后，通过最小波谷浓度(cmin)的重复测量方差分析(anova)评估稳态的实现。第一个不显著的比较是达到稳态的给药间隔。
药效学(pd)分析
使用标准非室分析获得pd参数。通过anova比较部分a中的各csl324剂量与部分a的汇集安慰剂组的血清细胞因子和趋化因子浓度、嗜中性粒细胞吞噬和氧化爆发活性、g-csf受体占有率和pstat-3信号传导的pd参数。
使用pearson相关分析研究pd参数与csl324总剂量(mg)和体重调节剂量(mg/kg)的相关性。
安全性分析
紧急治疗用ae(teae)使用用于管制活动的医学词典(medicaldictionaryforregulatoryactivities)进行编码(meddra；版本20.1)。每个teae的严重程度由研究者使用国家癌症协会针对不良事件的通用术语标准第4版(nationalcancerinstitutecommonterminologycriteriaforadverseeventsversion4)来评估，除了使用俱乐部阶段1标准评级的异常anc值的teae之外。对csl324清除(cltot或cltot，ss)和所选择的pd参数(anc和g-csf浓度)进行了具有累积阳性和阴性免疫原性结果的受试者之间的箱线图比较。
结果：
受试者处置
总共58名受试者提供了知情同意书并随机进入研究。在部分a(n＝30)中，在5个群组中的每一组中，4名受试者接受csl324，2名受试者接受安慰剂(群组a1至a5)。在部分b(n＝18)，在每个群组b1至b3中3名受试者接受csl324且1名受试者接受安慰剂，在群组b4中4名受试者接受csl324且2名受试者接受安慰剂。在部分c中(n＝10)，6名受试者接受csl324，4名受试者接受安慰剂。
总体上，55名受试者(94.8％)完成研究；由于撤除同意，1名安慰剂治疗的受试者停止部分a(群组a5)，并且由于其他原因，在部分c完成3次剂量后，2名受试者(1名csl324治疗和1名安慰剂治疗)中断。完成研究的部分c的两个受试者未接受src推荐的csl324剂量3。
人口统计
研究对象为男性(100％)，主要为白色(65.5％)，平均年龄为30.3岁(范围：19至54岁)。部分a、b或c的受试者之间的人口统计学特征没有显著差异。总体上，受试者的医疗史和外科手术史与健康志愿者群体一致。
药代动力学(pk)
在单次iv给药csl324后，平均血清csl324浓度在输注结束时达到峰值，cmax与csl324剂量成线性比例(图1)。暴露于csl324，测量为auc0-t和auc0-inf，随着csl324剂量更高而增加，但未显示剂量线性，因为两个参数的置信限均在0.85至1.15临界区间之外(auc0-t的估计斜率为1.68[90％ci：1.58至1.79]，auc0-inf的估计斜率为1.67[90％ci：1.56至1.78])。csl324的平均cltot在测试的剂量范围内不是恒定的，随csl324剂量增加10倍而降低80％。
在单次iv剂量后，平均t1/2范围从0.1mg/kgcsl324的40.5小时至1.0mg/kgcsl324的206小时。以21天的间隔施用3剂0.6mg/kgcsl324后，平均t1/2为251小时。
在csl324输注之前和之后施用g-csf降低了单csl324剂量的相对生物利用度，测量为auc0-inf和auc0-t，并且对cmax具有最小影响。与仅给药csl324相比，给药csl324之前和之后施用g-csf时，g-csf对csl324暴露的减少更大。
基于波谷浓度，在21天间隔施用3个剂量的0.6mg/kgcsl324后没有达到稳态。在剂量1和剂量3后，峰值平均血清csl324浓度相似。
在单次0.8mg/kgcsl324剂量后，脑脊液中检测不到csl324。
药效学
当与安慰剂比较时，在没有g-csf攻击的情况下施用单一和重复csl324剂量后，平均anc降低。在单次csl324剂量中，平均anc最小作用(emin)在1.0mg/kgcsl324剂量时最低(1.3×109/l)，在安慰剂时最高(2.49×109/l)。在csl324重复给药后，平均ancemin降低至1×109/l，其中emin发生在剂量3后(约48天)。
较高剂量的csl324(0.3和0.8mg/kg)抑制升高的anc的g-csf介导的刺激；对g-csf攻击的anc应答与0.1mg/kgcsl324和安慰剂类似。基于auc0-t，anc与csl324剂量和csl324暴露负相关。
当作为嗜中性粒细胞吞噬和氧化爆发活性离体测量时，csl324对嗜中性粒细胞功能没有明显影响。与安慰剂相比，较高单剂量的csl324(0.3至1.0mg/kg)增加了用于体外刺激嗜中性粒细胞pstat-3信号传导的g-csf半数最大有效浓度(ec50)；然而，测定数据显示了大的可变性，限制了解释。没有观察到csl324对gm-csf刺激的与未刺激的嗜中性粒细胞pstat-3信号传导的比率的一致影响。
用0.1至1.0mg/kg的单csl324剂量快速实现嗜中性粒细胞g-csf受体饱和。约100％受体占有率的持续时间随csl324剂量的增加而增加，持续至第3天用0.1mg/kgcsl324，且持续至第29天用0.8和1.0mg/kgcsl324(图2)。
与安慰剂相比，单csl324剂量增加了峰值血清g-csf浓度和暴露量，其中g-csfauec0-t和auec0-24显示与csl324全身暴露量和剂量正相关。重复csl324剂量使血清g-csf持续增加，峰值浓度在每次给药后2天出现。在单次0.8mg/kgcsl324剂量后在脑脊液中检测不到g-csf。
与安慰剂相比，在csl324给药后，细胞因子和趋化因子的血清浓度随时间没有显示出明显的模式。血清白介素(il)-8浓度显示csl324和安慰剂的少量增加，表明iv输注的效果。在g-csf攻击后，血清il-1受体拮抗剂(il-1ra)水平升高，然后在施用较高的csl324剂量(0.3至1.0mg/kg)后降低。
安全性
总体上，teae频率与csl324(82.1％)和安慰剂(94.7％)相近。治疗相关teae在整个csl324组中占64.1％，在安慰剂组中占57.9％。在csl324中比在安慰剂中更频繁发生的teae是噬中性粒细胞减少症(19.2％相对于无受试者)，输注部位疼痛(7.7％相对于无受试者)，和鼻充血(7.7％相对于无受试者)。没有teae是严重的或致命的。根据src的推荐，两名受试者未接受剂量3。
剂量群组总teae频率无csl324剂量依赖性趋势。所有受试者(100％)在用csl324或安慰剂重复给药后经历teae。
大部分teae为1级或2级。csl324治疗后的所有治疗相关teae均已通过安全性随访访问解决，但正在进行的2级红斑teae除外。
csl324以剂量依赖性方式降低anc，其特征为噬中性粒细胞减少直至3级严重程度，其在第二天自发消退(图5和图6)。
一个受试者在1.0mg/kgcsl324的单剂量后第4天具有3级嗜中性粒细胞减少症的teae(图5)，并且4个受试者具有3级嗜中性粒细胞减少症的7个teae，重复0.6mg/kgcsl324剂量(图6)。在复查可获得的安全性、耐受性、pk和选择的pd数据后，根据src的推荐，经历超过1次3级噬中性粒细胞减少症事件的两名受试者未在部分c中接受csl324剂量3。所有3级噬中性粒细胞减少症的teae在次日没有处理的情况下自发地分解。
20名受试者中的6名经历满足噬中性粒细胞减少症2或3级标准的anc，所述受试者用单csl324剂量治疗，并且倾向于在csl324给药后1至4天内发生。接受csl324重复剂量的6名受试者中的五名具有符合噬中性粒细胞减少症2级或3级标准的anc，其倾向于在剂量3后发生。
未观察到输注反应或局部耐受反应。在csl324治疗的受试者和没有安慰剂治疗的受试者中，≤5％经历输注部位疼痛、穿刺部位红斑和穿刺部位疼痛的teae。
没有从实验室参数、生命体征(包括直立挑战、ecg、身体检查结果或疲劳评分)鉴定到安全信号。
没有受试者在单次和重复iv给药后产生抗csl324抗体。
结论：
当以高达0.8mg/kg的单剂量或以0.6mg/kg的重复剂量以21天的间隔施用时，csl324是安全且耐受良好的。csl324以剂量依赖性方式降低了anc水平，其特征在于噬中性粒细胞症减少达到3级严重程度，其在次日没有治疗的情况下自发消退。全身csl324暴露随着剂量增加而增加，其中cmax显示与csl324剂量成线性比例。较高的csl324剂量具有较长的t1/2和较慢的cltot。csl324显示出快速的g-csf受体饱和并在较高剂量下抑制g-csf介导的对anc的刺激，对炎性介质的影响最小。
实施例2-用结合g-csfr的抗体csl324治疗嗜中性皮肤病
研究设计
使用多中心开放标签的双方案重复剂量研究来研究在患有hs和ppp的受试者中静脉施用的csl324的重复剂量的安全性和pk。本研究还研究了csl324在患有hs和ppp的受试者中的初步功效。
该研究包括28天的筛查期，15周的治疗期和9周的随访期。研究有2个群组。每个群组由20名具有hs(n＝10)或ppp(n＝10)的受试者组成(图3)。csl324最初在第1、22、43、64和85天以21天的间隔以0.3mg/kgcsl324的60分钟iv输注向参与群组#1的受试者施用。当群组#1中施用csl324的前5名受试者完成15周的治疗期时，向群组#2中的受试者施用csl324。群组#2的最安全csl324剂量(≥0.1且≤0.6mg/kg)通过pk/anc模拟模型确定，其使用来自前5群组#1受试者的pk和anc数据更新以完成15周治疗周期(图4)。
在给药当天，受试者在输注结束后保持在研究中心至少3小时，用于安全性观察和血液采样pk、血液学、生物化学和细胞因子/趋化因子浓度和血清中其它选择的生物标志物。在整个治疗期间和随后阶段评估临床功效，并且在开始时(施用csl324之前的第1天)和治疗期间结束时(如果施用所有5个剂量的csl324，则第105天，或在用于早产治疗停止的最后剂量后3周)收集组织活组织检查。
csl324抗体
表1-抗体剂量、给药方案和施用
给药方案合理性
给患有hs或ppp的患者施用两个剂量以探索潜在的pk/pd(anc)关系。在本研究中在群组#1中测试的起始剂量方案是每21天0.3mg/kg，总共5个剂量。基于在实施例1中描述的阶段1研究中获得的安全性，pk和pd数据选择该起始剂量方案。在食蟹猴中的临床前结果也被认为支持每21天施用总共5个剂量。
实施例1的结果表明，当以高达0.8mg/kg的单剂量或以0.6mg/kg的重复剂量以21天的间隔施用时，csl324是安全且耐受良好的。在3次0.6mg/kg的多次剂量后观察到csl324的最小累积，平均(sd)终末半衰期为251(55.2)小时。
0.3和0.8mg/kg的单csl324剂量抑制g-csf对anc水平的刺激，证实作用机制；在0.1mg/kgcsl324剂量下观察到最小作用。在单次或多次给药csl324后，g-csf受体占有率(ro)迅速发生并且甚至在最低测试剂量(0.1mg/kg)下达到～100％占有率，并且随着剂量增加在该水平下持续更长的时间段。此外，在施用0.6mg/kg的第三剂量后，受体占有率为～100％，持续至多27天，表明在三次剂量后21天的给药间隔内的完全受体占有率。
尽管csl324是安全和良好耐受的，但在1mg/kg的单剂量后的1名受试者(1个事件)和0.6mg/kg的三次重复剂量后的4名受试者(7个事件)中观察到短暂的3级噬中性粒细胞减少症。群组#2的最安全的csl324剂量(≥0.1且≤0.6mg/kg)通过pk/anc模拟模型测定，并且由与食蟹猴中的glp毒理学研究相比的暴露安全限度支持。在glp毒理学研究(apq0045)中，通过缓慢推注，csl324每周施用一次，持续12周。csl324在食蟹猴(雄性和雌性)中耐受良好，并且没有观察到与测试物品相关的毒理学发现，导致使用的最高剂量noael，100mg/kg。在本研究中提出的剂量方案的安全界限对于auc和cmax分别为约122和231。
研究纳入和排除标准
表2-研究纳入标准
表3-研究排除标准
安全性评估
在本研究期间进行的与安全性评价相关的临床程序提供在下表4中。
表4-安全性评估
绝对嗜中性粒细胞计数(anc)和体温监测
在整个研究期间在预定时间点监测每个受试者的anc。
如果受试者在给药前当天记录3级或4级噬中性粒细胞减少症，则在24小时内进行重复anc评估，并且2个anc值的平均值必须≥800/mm3以允许csl324的剂量给药。如果2个anc值的平均值<800/mm3，则受试者不接受任何进一步的给药。为了允许在给药前当天响应于3级或4级噬中性粒细胞减少症进行重复的anc测量，可以在允许的给药窗口内延迟给药(+3天)。
如果受试者在除了给药前一天之外的任何其它天记录3级(gr3)嗜中性粒细胞减少症，则受试者可继续进行研究，除非此单gr3anc值与>38.3℃或>38.0℃的单鼓膜温度结合持续>1小时，和/或存在临床上显著的感染迹象或症状。如果受试者在治疗或随访期间的任何其它时间具有3级嗜中性粒细胞减少症，则可进行不定期的anc测量以尽可能密切地监测受试者的anc水平。
如果受试者在除了给药前一天之外的任何其它天记录4级噬中性粒细胞减少症，则必须在24小时内进行重复anc评估，并且如果受试者的重复anc值≥500/mm3，则受试者可继续研究。如果重复anc值<500/mm3，则受试者不接受任何进一步给药。
要求患有3或4级噬中性粒细胞减少症的受试者警觉并立即报告任何感染的体征和/或症状，包括体温升高。所有研究对象均配备体温计，并要求每天在一致的时间监测口腔温度。如果受试者的口腔温度测量值超过37.2℃，则要求受试者立即接触该部位，并要求进行非计划访问以进行临床评价。
功效评估
化脓性汗腺炎
总脓肿和炎性结节计数(an计数)：结节(炎性结节)是直径>10mm的隆起的三维圆形浸润损伤。脓肿是直径>10mm的柔嫩但起伏的肿块，由红斑区域包围；脓肿中部有脓液。引流管/瘘是隆起的柔嫩的但起伏的长度和深度可变的纵向块，终止于皮肤表面，并且有时渗出液体(lipsker等人，2016,dermatology232:137-42)。在第1、22、43、64和85天以及第105、126、147和168天(eosv高)，结合引流管/瘘的评估，在筛查时评估an计数，以评估hs的动态变化，包括
化脓性汗腺炎临床反应(hiscr)：hiscr于2014年开发并验证，以提高灵敏度、测量一致性和易用性(kimball等人，2014,brjdermatol171:1434-42)。hiscr是hs炎症表现的有效、响应性和有意义的临床终点，可以适应临床研究和日常实践。定义为总an计数从基线减少50％，脓肿或引流瘘计数无增加。该方法已用于若干2期hs研究(kimball,sobell等人，2016,jeuracaddermatolvenereol30:989-94；kanni等人，2018,jinvestdermatol138:795-801；tzanetakou等人，2016,nengljmed320:365-76)和3期pioneerhs临床研究(kimball,okun,等人，2016,nengljmed375:422-34)。
国际化脓性汗腺炎严重程度评分系统(ihs4)：ihs4是用于hs的动态严重程度评估的有效工具(zouboulis等人，2017,brjdermatol177:1401-09)，并且由于其被设计为评估治疗反应而不是疾病严重程度横断性，因此在hiscr评估时得以改善(kimball等人，2014,brjdermatol171:1434-42)。ihs4分数(点)＝(结节数乘以1)+(脓肿数乘以2)+[引流管(瘘/窦)数乘以4]3分或更低表示轻度hs，4-10分表示中度hs，11分或更高表示重度hs(zouboulis等人，2017,brjdermatol177:1401-09)。
化脓性汗腺炎医生总体评估(hs-pga)：在临床试验中使用六点hs-pga测量炎性结节、脓肿和引流瘘的临床改善。其范围从明确(0分)到非常严重(5分)。对疾病严重程度评分有明确的指导作用，使用相对简便(kimball等人，2014,brjdermatol171:1434-42)。hs-pga将在给药前第1、22、43、64和85天，第105、126、147和168天(eosv)进行评估。
掌跖脓疱病
掌跖脓疱病银屑病面积严重性指数(pppasi)是基于银屑病面积和严重度指数的评估工具，其广泛用于评估慢性斑块状银屑病的严重度。以1-4的等级对包括严重程度、红斑、脓疱总数和脱皮的参数进行评分，然后针对所涉及的区域和部位(手掌或脚掌)进行校正。这四个值的总和产生最终pppasi，其范围介于0(无ppp)和72(最严重的ppp)之间(bhushan等人，2001,brjdermatol145:546-53)。在筛差时，在第1、22、43、64和85天以及第105、126、147和168天给药前评估pppasi(eosv)。
掌-足底医师全局评估(pga)评分：pga是基于红斑、鳞屑和硬结的所有银屑病损伤的平均评估(robinson，2011年)。pga在给药前第1、22、43、64和85天，第105、126、147和168天(eosv)进行评估。
药代动力学(pk)评估
在第一次和最后一次输注后，在每次输注之前和在输注结束时以及在输注结束后3小时、4天、1周、2周和3周时通过静脉穿刺从对侧臂(相对于用于输注的i.v.线)收集用于测定csl324的血清浓度的pk样品。在最后剂量后6周、9周和12周收集另外的pk样品。
按时间点列出血清浓度并进行描述性总结。通过非房室方法获得的重复给药后csl324pk参数的图解显示通过剂量群组和适应症组进行描述性总结。
药效学(pd)评估
收集血液和组织样品用于各种评估。血液评估包括但不限于以下：系列anc测量、血清细胞因子和趋化因子(例如g-csf、gm-csf)；疾病相关的促炎标志物(例如crp、esr、c3a、c5a)、炎症基因标签(例如中性粒细胞/g-csf标签)和基于外周血涂片的中性粒细胞分布变化。用于研究分析的额外抽血在知情同意书(icf)中明确提及，关于其的收集需要具体批准。
皮肤活组织检查采集
在基线和最后剂量后3周通过穿刺活组织检查收集组织样品以评估细胞浸润，包括但不限于嗜中性粒细胞浸润。该分析通过组织学(免疫组织化学，h&e)和rna评估进行。
在第1天(基线)和治疗期结束时(第105天，如果施用所有5个剂量的csl324，或在用于过早治疗中断的最后剂量后3周)收集二×3mm活组织检查。在给药及血液收集之前以及在生命体征、体温及临床终点评估之后收集活组织检查。研究治疗结束时取尽可能接近第1天活检部位的活组织检查，即使病变部分或完全地被清除。对于hs，直接从>1cm(可能的最大结节)的结节收集基线活组织检查，避开结节中心。对于ppp，基线活组织检查是从手掌或脚掌上靠近脓疱(但不包括脓疱)的发炎皮肤区域收集的。
患者报告结果评估
所有疾病：
皮肤病学生活质量指数问卷(dlqi)评分：dlqi是经过10个问题验证的简单问卷，在超过80个国家的超过40种不同的皮肤状况中使用，并以超过90种语言提供。其用途已描述于超过1000篇出版物中，包括许多多国研究。每个问题评分为0(根本没有)到3(非常大)，撤消期为1周。总共30个点是最大评分，其中0-1被认为是无效的，2-5为小，6-10为中等，11-20为非常大，21-30对患者生活有极大影响(hongbo等人，2005,jinvestdermatol125:659-64)。在第1、22、43、64天和85天以及第105、126、147天和第168天在给药前评估dlqi(eosv)。
化脓性汗腺炎：
数字评级量表(nrs)疼痛评分：疼痛的nrs是成人疼痛强度的一维量度，包括具有与皮肤病相关的慢性疼痛的那些(kimball,okun,等人，2016,nengljmed,375:422-34)。nrs是视觉模拟评分(vas)的分段数字版本，其中响应者选择最能反映过去24小时内疼痛强度的整数(0-10的整数)(rodriguez2001,painmanagnurs,2:38-46)。通常的形式是水平条或线，并由描述疼痛严重程度极限的术语锚定(hawker等人，2011,arthritiscareres(hoboken),63suppl11:s240-52)。每天使用电子日记本收集nrs疼痛评分，得到每周平均值。
其他评估
照片捕获随时间的病变变化是受试者参与的可选评估。这些照片是在基线以及在研究过程中的不同时间拍摄的，以捕获用csl324治疗的病变(第3、6、9、12、15周和随访)。这些照片可用于各种设置和文档，包括内部和外部陈述、报告和出版物。
停止规则
研究停止标准
在以下情况，将研究将立即停止：
·一个受试者发展出导致死亡的严重ae(sae)，并且被研究者和/或发起人认为与施用csl324相关。如果以下事件中的任一个在研究期间发生并且这些事件被认为与csl324的施用相关，则停止招募并且调查事件以确定建议停止研究，在重新开始研究之前修改方案或重新开始研究：
·如果在较低剂量群组中满足任何群组停止标准
·一个或多个受试者发生被认为对研究中的其他受试者造成不可接受风险的任何其他事件。
群组停止标准
在该研究期间，所有适应症均有与安全性相关的群组停止标准。如果在较高剂量群组中满足群组停止标准，则可继续较低剂量群组，除非src建议停止研究。
在以下情况下，将立即停止对单个群组中的所有受试者进行给药：
·一个群组中的三(3)名受试者具有与csl324施用相关的4级中性粒细胞减少症的单一事件(定义为在大约24小时后重复测量证实的单一测量)。
·如果在研究期间在一个群组内的受试者中发生以下事件中的任一个并且这些事件被认为与施用csl324相关，则调查该事件以提供允许进一步给药和募集受影响群组的建议。还决定是否继续给尚未满足以下标准且在其治疗期间中途的同一群组内的研究受试者给药，或停止整个群组的所有csl324给药且使所有群组受试者经历治疗结束和随访评估并返回临床护理/soc。
·一个受试者在感染的任何临床体征或症状存在下具有4级嗜中性粒细胞减少症的单一事件(在约24小时后重复测量证实)。
·一个受试者已证实中性粒细胞减少性脓毒症，需要iv抗生素(标准定义脓毒症tbd)。
·被认为对群组中的其它受试者造成不可接受风险的任何其它事件。
受试者停止标准
在研究期间，安全相关的受试者停止标准适用于所有适应症。如果受试者在研究期间发展以下事件中的任一个并且事件被认为与csl324相关，则受试者不被施用任何剩余剂量的csl324。
·严重不良事件(sae)。
·如果受试者经历3级或4级输注反应(根据ctcae分级)的延长的症状，尽管管理包括减慢输注速率和/或口服抗组胺药的施用。
·被认为具有临床意义的烈性非严重ae(包括感染)。
·受试者在研究的治疗期间的任何阶段经历4级嗜中性粒细胞减少症的单一事件(在约24小时后重复测量证实)。
·如果受试者在施用给药前当天记录3级或4级嗜中性粒细胞减少症，并进行重复anc评估(约24小时后重复测量证实)，平均值<800/mm3。
·根据ctcae的3级嗜中性粒细胞减少症与>38.3℃或>38.0℃的单一鼓膜温度相关，持续>1小时和/或临床上显著的感染迹象或症状。
在受试者未接受其csl324的完全给药方案的情况下，他们返回临床护理并进行治疗结束评估(最后一次给药后3周)和随访评估。
实施例3-csl324减少与cxcr1表达相关的嗜中性粒细胞迁移，cxcr1表达是在hs患者中上调的标志物。
在hs患者中cxcr1表达
使用化脓性汗腺炎患者全血标本(hs；n＝15)与来自年龄和性别匹配的健康对照全血样品的嗜中性粒细胞相比，通过流式细胞术评估嗜中性粒细胞表面上的细胞迁移标志物cxcr1的水平(由高侧散射(ssc)定义，cd11b+cd49-)。
如图7a所示，与健康对照相比，hs患者样品中性粒细胞中cxcr1表达显著更高(n＝15)。观察了进一步分析，其显示hs患者脓肿与结节计数、疾病活动性评估形式和hs患者(n＝14)中嗜中性粒细胞上cxcr1表达之间的相关性(图7b；r2＝0.3532，p＝0.0250)。
csl324降低g-csf诱导的cxcr1和cxcr2表达
从健康人供体获得的全血样品用于评估嗜中性粒细胞上趋化因子受体cxcr1和cxcr2的表达，并评估在存在或不存在g-csf的情况下csl324对这些迁移受体水平的影响。将样品与1mg/mlcsl324预孵育30分钟(30ng/ml；n＝11),随后用重组人g-csf或重组人gm-csf(30ng/ml；n＝4)刺激细胞，并在37℃，5％co2下培养20小时。通过高度侧向散射(ssc)和cd11b+cd49d-表型鉴定嗜中性粒细胞。针对cxcr1或cxcr2的缀合抗体的平均荧光强度相对于在单独的培养基中培养的细胞进行归一化。
如图8所示，与单独的培养基相比，单独用g-csf(黑色)培养嗜中性粒细胞增加了cxcr1和cxcr2的细胞表面表达。用csl324(灰色)预孵育导致g-csf诱导的cxcr1和cxcr2上调减少，cxcr1或cxcr2染色的平均荧光强度(mfi)与嗜中性粒细胞单独在细胞培养基中孵育时观察到的相当。在gm-csf存在下培养细胞不显著改变表面标志物的水平，并且进一步地，样品与csl324的预孵育不改变。
csl324减少g-csf诱导的细胞迁移
使用细胞迁移测定来评估csl324抑制g-csf介导的嗜中性粒细胞向mip-2迁移的能力。具体地，分离纯化的嗜中性粒细胞(纯度>95％)并用或不用1μg/mlcsl324预培养30分钟，然后用30ng/ml人g-csf或30ng/ml人gm-csf刺激过夜。使用跨孔插入物(5μm孔)测定对mip-2(500ng/ml)的趋化性。
如图9所示，用g-csf预孵育导致嗜中性粒细胞向mip-2的迁移增加，这通过用csl324预孵育降低至与单独培养基条件相同的水平(图9a；灰色条)。gm-csf的促迁移作用不受csl324的预孵育的抑制，表明对接合g-csf受体的作用具有特异性。与g-csf预孵育导致cxcr1和cxcr2的上调，这与嗜中性粒细胞向mip-2的迁移增加相关(图9b和9c)。
这些数据一起表明：
·相对于健康个体，cxcr1在hs患者的嗜中性粒细胞上以显著更高的水平表达(图7a)；
·cxcr1表达与hs疾病的严重程度正相关(如通过脓肿和结节计数所测量的；图7b)；
·cxcr1(和cxcr2)表达与嗜中性粒细胞迁移正相关(图9b和图9c)；
·csl324抑制g-csf诱导的cxcr1(和cxcr2)在嗜中性粒细胞上的表达(图8a和图8b)以及g-csf诱导的嗜中性粒细胞迁移(图9a)。
实施例4-在银屑病患者中中性粒细胞数目和迁移标志物表达上调
为了评估用结合g-csfr的抗体治疗的潜力，评估银屑病患者的全血中的嗜中性粒细胞数目和表达细胞迁移标志物cxcr1和cxcr2。
招募总共21名患有斑块状银屑病(也称为“寻常型银屑病”或“普通银屑病”)的个体和21名年龄和性别匹配的未受影响的个体以收集血液和皮肤组织样品。使用流式细胞术对新鲜全血样品中的嗜中性粒细胞进行表型分析。
如图10所示，与未受影响的对照相比，患有银屑病的人的外周血中的嗜中性粒细胞计数(图10a)显著增加。通过pasi评分评估的基于银屑病严重性的分层显示在具有10或更大的pasi评分的个体中嗜中性粒细胞计数显著升高。此外，与具有低于10的pasi评分的个体相比，具有10或更高的pasi评分的个体中的嗜中性粒细胞:淋巴细胞比率(nlr)显著升高(图10b)。
通过流式细胞术检测银屑病患者与未感染对照人群相比外周血中性粒细胞表面活化和迁移标志物cxcr1和cxcr2的表达。在轻度(pasi<10)和重度(pasi>10)银屑病中，趋化因子受体cxcr2在嗜中性粒细胞表面均显著升高(图10c)。没有检测到趋化因子受体cxcr1的水平的显著改变(图10d)。假定与g-csfr的抗体结合，csl324，在本文中已经被证明减少嗜中性粒细胞计数(参见实施例1)和cxcr1和cxcr2的表达(参见实施例3)，这些数据提供了这样的证据，即这样的抗体可能是治疗银屑病的可行的治疗选项。
实施例5-用csl324治疗掌跖脓疱病(ppp)是安全和有效的
受试者00360098-0001
患者为52岁高加索人男性，具有掌跖脓疱病(ppp)病史四年以上，肥胖(129kg)，吸烟(30年以上)。他以前用以下药物治疗过ppp：
·每周施用氨甲喋呤10mg，持续约一年；
·每天50mg阿维a，持续大约四个月；
·他克莫司(局部)约三年；
·皮质类固醇(局部)约三年；以及
·维生素d+皮质类固醇(局部)约三年。
该受试者参加实施例2中描述的研究csl324_1002，并在第1天以0.3mg/kg的剂量接受他的csl324的第一次输注，然后在第22、43、64和85天每21天接受4次后续输注。
疗效结果
受试者的基线ppp严重程度，如通过掌跖脓疱银屑病区域严重程度指数(pppasi)测量的，在筛查时为34.2(严重)并且在第一次施用csl324之前为26.9(严重)。此外，在第一次施用csl324之前，ppp-医师全局评估(ppp-pga)是严重的。至第126天的效力测量结果示于表5和图11中。
表5-受试者00360098-0001的pppasi和ppp-pga评分
表5和图11中给出的数据表明，用csl324治疗成功地降低了ppp的严重性，如通过pppasi或ppp-pga所测量的。下表6提供了解释结果的指导原则。
表6-csl324功效评估的解释
安全性结果
不良事件
患者发生3例不良事件，均不严重，认为与csl324无关。第一次ae，下背痛，发生在第67天，用nsaid治疗并在1天内消退。在csl324的最终剂量当天，自研究筛查以来在葡萄糖升高后诊断出第二次ae，即糖尿病，尽管饮食改变但病情仍未改变。在用csl324治疗期间高血糖没有恶化。最后一次ae嗜睡发生在最后一次给药后的当天，并在同一天消退。
绝对嗜中性粒细胞计数
在第一次施用csl324之前，受试者具有4.9×109/l和6.3×109/l的绝对嗜中性粒细胞计数(anc)。在整个研究中，anc保持在正常范围内，如以下图12和表7所示。
序列表
<110>csl创新私人有限公司（cslinnovationptyltd）
<120>治疗嗜中性病症的方法
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505560
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thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala
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145150155160
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210
<210>16
<211>444
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>c1.2g重链igg4，具有s241p突变，缺乏c端
赖氨酸残基
<400>16
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serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserleutyr
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