分离和扩增细胞的方法与流程

分离和扩增细胞的方法
发明领域
1.本发明涉及分离和/或扩增非造血组织驻留淋巴细胞(特别是γδt细胞)的方法。这样的γδt细胞包括非vδ2细胞，例如vδ1、vδ3和vδ5细胞以及此类非造血组织包括皮肤和肠道。应当理解，这种分离和/或扩增的非造血组织驻留淋巴细胞在过继t细胞疗法、嵌合受体疗法等中发现了巨大的实用性。本发明还涉及通过本文描述的方法产生的细胞。
2.发明背景
3.对用于癌症的t细胞免疫疗法日益浓厚的兴趣集中于cd8+和cd4+αβt细胞子集识别癌细胞并介导宿主保护性功能潜能的明显能力上，特别是被临床上介导的由pd
‑
1、ctla
‑
4和其他受体发挥的抑制途径的拮抗作用压抑时。但是，αβt细胞是mhc限制的，其可以导致移植抗宿主病。
4.gamma delta t细胞(γδt细胞)代表在其表面表达独特的、定义γδt细胞受体(tcr)的t细胞子集。这种tcr由一个gamma(γ)和一个delta(δ)链组成。人γδtcr链选自三个主要的δ链：vδ1、vδ2和vδ3，以及六个γ链。人γδt细胞可以基于其tcr链进行广泛分类，因为某些γ和δ类型在一种或多种组织类型中的细胞上更为普遍，虽然不是排他地。例如，大多数血液驻留γδt细胞表达vδ2tcr，例如vγ9vδ2，而这在组织驻留γδt细胞中不太常见，其在皮肤中更频繁地使用vδ1，而在肠道中使用vγ4。
5.分离淋巴细胞的大多数方法都依赖于从血液中分离那些细胞类型。非造血组织驻留淋巴细胞，如αβt细胞、γδt细胞和nk细胞，可能具有特别适合某些应用的特性，如靶向非造血肿瘤和其他靶标。然而，分离临床上相关量的此类组织驻留淋巴细胞仍然是一个挑战，特别是因为许多适应症需要从108个细胞朝上的临床剂量。重要的是，生产过程中大量的细胞损失意味着必须产生甚至更多的起始细胞。
6.由于非造血组织驻留淋巴细胞，特别是αβt细胞、γδt细胞和nk细胞不易大量获得，因此尚未对其进行很好的表征或研究用于治疗应用。因此，在该领域中需要将非造血组织驻留淋巴细胞(特别是γδt细胞)分离和扩增到足以研究并潜在地用作疗法(例如作为过继性t细胞疗法)的量的方法。
7.clark等(2006)j.invest.dermatol.126(5)：1059
‑
70描述了从正常和患病皮肤中分离皮肤驻留t细胞的方法。然而，由于存在动物产品，但尤其是由于分离的细胞相对低的产量，即每cm2组织少于106个细胞，因此其中描述的方法不适用于临床。clark等描述的方法使用切碎的样品，这导致故意破坏了组织样品的结构完整性。wo2017072367和wo2018/202808涉及通过在至少白介素
‑
2(il
‑
2)和/或白介素
‑
15(il
‑
15)的存在下培养从非造血组织获得的淋巴细胞来体外扩增非造血组织驻留γδt细胞的方法。wo2015189356描述了用于扩增从通过单采(aphaeresis)获得的样品获得的淋巴细胞的组合物，其包含至少两种类型的选自il
‑
2、il
‑
15和il
‑
21的细胞因子。因此，仍然需要一种如从皮肤中分离组织驻留非造血淋巴细胞的方法，其产生更大量的适于临床使用的细胞。
8.发明概述
9.根据本发明的第一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，
包括步骤：
10.(i)在白介素
‑
2(il
‑
2)和白介素
‑
15(il
‑
15)存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm的最小横截面的完整活检；和
11.(ii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
12.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
13.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm的最小横截面的完整活检；和
14.(ii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
15.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，包括步骤：
16.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm2的最小横截面积的完整活检；和
17.(ii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
18.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
19.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm2的最小横截面积的完整活检；和
20.(ii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
21.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，包括步骤：
22.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm3的体积的完整活检；和
23.(ii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
24.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
25.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm3的体积的完整活检；和
26.(ii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
27.根据本发明的再一个方面，提供了从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，其包括步骤：
28.(i)将非造血组织样品放在包含透气材料的容器中；
29.(ii)在il
‑
2和il
‑
15的存在下培养非造血组织样品；和
30.(iii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
31.根据本发明的再一个方面，提供了从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，其包括步骤：
32.(i)将非造血组织样品放在包含透气材料的容器中；
33.(ii)在il
‑
2和il
‑
15的存在下培养非造血组织样品；和
34.(iii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
35.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离和扩增淋巴细胞的方法，包括步骤：
36.(i)根据本文限定的方法从非造血组织样品分离淋巴细胞群；和
37.(ii)进一步培养所述淋巴细胞群至少5天，以产生扩增的淋巴细胞群。
38.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离和扩增γδt细胞的方法，包括步骤：
39.(i)根据本文限定的方法从非造血组织样品分离γδt细胞群；和
40.(ii)进一步培养所述γδt细胞群至少5天，以产生扩增的γδt细胞群。
41.附图简述
42.图1：初始测试，比较了3mm打孔活检样品和标准皮肤切碎方法的总细胞产量。
43.图2：与切碎的手术刀取样对照相比，在24孔板中含有5％人ab血清的aim
‑
v中来自分离的不同尺寸的穿孔活检样品的γδ细胞产量。
44.图3：使用含有5％人ab血清的aim
‑
v的不同培养容器的每个活检样品(上图)和每个平板(下图)的总细胞产量。
45.图4：在g
‑
rex6中含有所示血清补充的aim
‑
v中分离2周(上图)或3周(下图)后的总细胞产量比较。
46.图5：使用含有5％血清替代物(sr)vs g
‑
rex6中5％或10％人ab血清分离的总细胞产量和vδ1细胞的比例。
47.发明详述
48.根据本发明的第一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤：
49.(i)在白介素
‑
2(il
‑
2)和白介素
‑
15(il
‑
15)存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm的最小横截面的完整活检；和
50.(ii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
51.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
52.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是从非造血组织获得的具有至少2mm的最小横截面的完整活检；和
53.(ii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
54.本文中提及细胞(特别是淋巴细胞和/或γδt细胞)的“分离(isolation)”或“分离(isolating)”，是指从组织或细胞的集合中取出、分离、纯化、富集或以其他方式取出细胞的方法或过程。将理解这样的提及包括术语“分离的”、“取出的”、“纯化的”、“浓缩的”等。淋巴细胞和/或γδt细胞的分离包括从完整的非造血组织样品或非造血组织的基质细胞(例如成纤维细胞或上皮细胞)中分离或分开细胞。这种分离可以可替换地或另外地包括将γδt细胞与其他造血细胞(例如，αβt细胞或其他淋巴细胞)分离或分开。分离可以持续限定的时间段，例如，从将组织外植体或活检样品放置在分离培养物中开始，直到从培养物中收集细胞时，(如通过离心或用于转移分离的细胞群至扩增培养物或用于其他目的的其他方式)或从培养物中取出原始的组织外植体或活检样品时结束。分离步骤可以持续至少约三天至约45天。在一个实施方案中，分离步骤持续至少约10天至至少28天。在再一个实施方案中，
分离步骤持续至少14天至至少21天。因此，分离步骤可以持续至少三天，四天，五天，六天，七天，八天，九天，十天，11天，12天，13天，14天，15天，16天，17天，18天，19天，20天，21天，22天，23天，24天，25天，26天，27天，28天，29天，30天，31天，32天，约35天，约40天或约45天。可以理解，尽管在该分离步骤过程中分离细胞的增殖可能不是很明显，但不一定没有。实际上，对于本领域技术人员而言，已经认识到，分离的细胞也可以开始分裂，以在含有组织和/或支架的分离容器内产生多个这样的细胞。
55.因此，本文中提及“分离的淋巴细胞”、“分离的淋巴细胞群”、“分离的淋巴细胞的群”、“分开的淋巴细胞”、“分开的淋巴细胞群”、“分开的淋巴细胞的群”、“分离的γδt细胞”、“分离的γδt细胞群”、“分离的γδt细胞的群”，“分开的γδt细胞”、“分开的γδt细胞群”或“分开的γδt细胞的群”应当理解是指造血细胞或造血细胞群，其包括已经从来源的非造血组织样品中分离、分开、取出、纯化或富集的γδ细胞，使得该细胞与非造血细胞或完整的非造血组织内所含的细胞基本上不接触。同样，本文中提及“分离的或分开的vδ1t细胞的群”是指包括已经从来源的非造血组织样品中分离、分开、取出、纯化或富集的vδ1t细胞的造血细胞，从而使细胞与非造血细胞或完整的非造血组织内所含的细胞基本上不接触。因此，分离或分开是指从非造血细胞(例如基质细胞、成纤维细胞和/或上皮细胞)分离、分开、取出、纯化或富集造血细胞(例如γδt细胞或其他淋巴细胞)。
56.如本文所定义的淋巴细胞和/或γδt细胞的分离方法可包括破坏组织(例如切碎)，然后将淋巴细胞和/或γδt细胞与其他细胞类型分开。优选地，本文定义的淋巴细胞和/或γδt细胞的分离方法可包括从完整的非造血组织样品或外植体或活检样品的组织基质中“爬出(crawl
‑
out)”淋巴细胞和/或γδt细胞和其他细胞类型，其中组织驻留淋巴细胞物理上与组织基质分离而无需破坏组织基质。通过保持组织基质的完整性，令人惊讶地发现了组织驻留淋巴细胞优先从组织基质中流出，而很少或没有抑制性细胞类型(如成纤维细胞)流出，其保留在外植体或活检样品中，然后可以在分离结束时容易地取出。因此，在一些实施方案中，完整非造血组织样品或组织基质的使用带来少量的成纤维细胞从组织释放到培养物中。这种利用完整的非造血组织或组织基质的“爬出”方法的优点是减少了对非造血组织样品或组织基质的过度处理的需要，维持了非造血组织或组织基质的结构完整性，并提供出乎意料的可以获得更高分离细胞产量的优势。
57.因此，如本文所定义的非造血组织衍生的淋巴细胞的分离方法包括用于从非造血组织的完整活检样品或外植体分离非造血组织衍生的淋巴细胞的方法。这种完整的活检样品或外植体是其中活检样品或外植体的结构完整性没有在从组织样品取出活检样品或外植体的切除周边内被故意破坏的。这种完整的活检样品或外植体将具有很大程度上保持的三维结构，除了因操作造成的轻微破坏。因此，这种完整的活检样品或外植体没有被机械地破坏，例如，如通过切碎或剁碎，也没有被化学酶法破坏。但是，破坏的组织可以用于本发明的分离方法中。在一个实施方案中，分离的淋巴细胞是αβt细胞。在可替换的实施方案中，分离的淋巴细胞是γδt细胞。在另一个实施方案中，分离的淋巴细胞是nk细胞。可以理解可以从同一分离步骤中分离出一种以上类型的淋巴细胞。
58.利用本文定义的“爬出”方法分离淋巴细胞和/或γδt细胞的方法，可以包括在足以诱导γδt细胞和/或如本文定义的其他淋巴细胞的分离或分开的细胞因子和/或趋化因子存在下培养细胞和/或非造血组织。因此，在本发明的一个实施方案中，从非造血组织分
离淋巴细胞和/或γδt细胞包括在il
‑
2和il
‑
15存在下培养非造血组织。
59.如本文使用的，“il
‑
2”是指作为一个或多个il
‑
2受体(il
‑
2r)亚基的激动剂的天然或重组il
‑
2或其变体(例如突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同工型及其拟肽)。这样的试剂可以支持il
‑
2依赖性细胞系ctll
‑
2(33；美国典型培养物保藏中心tib 214)的增殖。如fujita等cell 1986.46.3：401
‑
407所述的，成熟的人il
‑
2以133个氨基酸的序列(除去了由另外的20个n
‑
末端氨基酸组成的信号肽)存在。il
‑
2突变蛋白是其中已经对白介素
‑
2蛋白进行了特定置换同时保持结合il
‑
2rβ的能力的多肽，如us2014/0046026中描述的那些。il
‑
2突变蛋白的特征在于在天然il
‑
2多肽链的一个或多个位点或其他残基上的氨基酸插入、缺失、置换和修饰。根据本公开，任何这样的插入、缺失、置换和修饰带来了保留il
‑
2rβ结合活性的il
‑
2突变蛋白。示例性突变蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的置换。
60.可以通过常规程序，如聚合酶链式反应(pcr)，获得编码人il
‑
2的核酸。人il
‑
2的氨基酸序列(gene id 3558)在genbank中依据登录号np_000577.2gi:28178861找到。鼠(小家鼠(mus musculus)的il
‑
2氨基酸序列(基因id 16183)在genbank中依据登录号np_032392gi:7110653找到。
61.il
‑
2也可以指源自各种哺乳动物物种的il
‑
2，所述哺乳动物物种包括，例如，人、猿、牛、猪、马和鼠。变体可以包括保守置换的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似生理化学特征的残基替代。保守置换的实例包括一个脂族残基被另一个置换，如ile、val、leu或ala彼此置换，或一个极性残基被另一个置换，如在lys和arg；glu和asp；或gln和asn之间。其他这样的保守置换，例如具有相似疏水性特征的整个区域的置换，是众所周知的。天然存在的il
‑
2变体也涵盖在本发明中。这种变体的实例是由可变的mrna剪接事件或由il
‑
2蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中il
‑
2结合性质得以保留。mrna的可变剪接可能会产生截短但具有生物活性的il
‑
2蛋白。归因于蛋白水解的变化包括，例如，由于蛋白水解从il
‑
2蛋白去除了一个或多个末端氨基酸(通常为1
‑
10个氨基酸)，因此在不同类型的宿主细胞中表达时导致n
‑
或c
‑
末端中的差异。在一些实施方案中，可以用如聚乙二醇这样的化学基团修饰蛋白质的末端或内部以改变其物理性质(yang等，cancer 1995.76：687
‑
694)。在一些实施方案中，可以用另外的氨基酸修饰蛋白质的末端或内部(clark
‑
lewis等，pnas 1993.90：3574
‑
3577)。
62.如本文使用的，“il
‑
15”是指作为一个或多个il
‑
15受体(il
‑
15r)亚基的激动剂的天然或重组il
‑
15或其变体(例如突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同工型及其拟肽)。il
‑
15，与il
‑
2一样，是已知的t细胞生长因子，其可以支持il
‑
2依赖性细胞系ctll
‑
2的增殖。il
‑
15作为114个氨基酸的成熟蛋白首次由grabstein等报道(grabstein等，science 1994.264.5161：965
‑
969)。如本文所用的，术语“il
‑
15”是指天然或重组il
‑
15及其突变蛋白、类似物、亚基，或其复合物(例如，受体复合物，例如sushi肽，如wo 2007/046006中所述)，并且其中每个都能刺激ctll
‑
2细胞的增殖。在ctll
‑
2增殖测定中，用il
‑
15的重组表达的前体和成熟形式的框内融合体转染的细胞的上清液可以诱导ctll
‑
2细胞增殖。
63.可以通过grabstein等所述的程序(grabstein等，science 1994.264.5161:965
‑
969)或通过常规程序，如聚合酶链式反应(pcr)，来获得人il
‑
15。1993年2月19日，在
对人il
‑
15cdna进行了保藏，且分配的登录号为69245。
64.人il
‑
15的氨基酸序列(gene id 3600)在genbank中依据登录号np_000576.1gi:10835153(同工型1)和np_751915.1gi:26787896(同工型2)找到。鼠(小家鼠)的il
‑
15氨基酸序列(基因id 16168)在genbank中依据登录号np_001241676.1gi:363000984找到。
65.il
‑
15也可以指源自各种哺乳动物物种的il
‑
15，所述哺乳动物物种包括例如人、猿、牛、猪、马和鼠。如本文所指，il
‑
15“突变蛋白”或“变体”是与天然哺乳动物il
‑
15的序列基本同源但由于氨基酸缺失、插入或置换而具有不同于天然哺乳动物il
‑
15多肽的氨基酸序列的多肽。变体可以包含保守置换的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似生理化学特征的残基取代。保守置换的实例包括一个脂肪族残基置换为另一个，如ile、val、leu或ala彼此置换，或一个极性残基置换为另一个，如lys和arg；glu和asp；或gln和asn之间。其他这样的保守置换，例如具有相似疏水性特征的整个区域的置换，是众所周知的。本发明还涵盖天然存在的il
‑
15变体。此类变体的实例是由可变的mrna剪接事件或由il
‑
15蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白，其中il
‑
15结合性质得以保留。mrna的可变剪接可以产生截短但具有生物活性的il
‑
15蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括，例如，在不同类型的宿主细胞中表达时n
‑
末端或c
‑
末端中的差异，这是由于蛋白水解从il
‑
15蛋白去除了一个或多个末端氨基酸(通常为1
‑
10个氨基酸)引起的。在一些实施方案中，可以用如聚乙二醇这样的化学基团修饰蛋白质的末端或内部以改变其物理性质(yang等，cancer 1995.76：687
‑
694)。在一些实施方案中，可以用另外的氨基酸修饰蛋白质的末端或内部(clark
‑
lewis等，pnas 1993.90：3574
‑
3577)。
66.应当理解，在某些实施方案中，根据本文定义的方法分离淋巴细胞和/或γδt细胞可进一步包括在至少一种其它细胞因子的存在下培养非造血组织。在某些实施方案中，本文定义的方法可进一步包括在至少一种额外的物质，如趋化因子的存在下培养非造血组织。还应理解趋化因子的选择取决于被分离的γδt细胞或其它淋巴细胞。此外，趋化因子将根据用于分离γδt细胞或淋巴细胞的非造血组织而变化和选择。
67.在某些实施方案中，本文限定的方法包括il
‑
2，通常浓度为至少10iu/ml，如至少100iu/ml(例如，10iu/ml至1,000iu/ml，20iu/ml至800iu/ml，25iu/ml至750iu/ml，30iu/ml至700iu/ml，40iu/ml至600iu/ml，50iu/ml至500iu/ml，75iu/ml至250iu/ml，或100iu/ml至200iu/ml，例如，10iu/ml至20iu/ml，20iu/ml至30iu/ml，30iu/ml至40iu/ml，40iu/ml至50iu/ml，50iu/ml至75iu/ml，75iu/ml至100iu/ml，100iu/ml至150iu/ml，150iu/ml至200iu/ml，200iu/ml至500iu/ml，或500iu/ml至1,000iu/ml)。在某些实施方案中，本文限定的方法包括il
‑
2，通常浓度为小于1,000iu/ml，如小于500iu/ml。在一些实施方案中，方法包括浓度为约100iu/ml的il
‑
2。
68.在更多实施方案中，本文限定的方法包括il
‑
15，浓度通常为至少0.1ng/ml，如至少10ng/ml(例如，0.1ng/ml至10,000ng/ml，1.0ng/ml至1,000ng/ml，5ng/ml至800ng/ml，10ng/ml至750ng/ml，20ng/ml至500ng/ml，50ng/ml至400ng/ml，或100ng/ml至250ng/ml，例如，0.1ng/ml至1.0ng/ml，1.0ng/ml至5.0ng/ml，5.0ng/ml至10ng/ml，10ng/ml至20ng/ml，20ng/ml至100ng/ml，20ng/ml至50ng/ml，40ng/ml至70ng/ml，50ng/ml至100ng/ml，50ng/ml至60ng/ml，100ng/ml至200ng/ml，200ng/ml至500ng/ml，或500ng/ml至1,000ng/ml)。在更多实施方案中，本文限定的方法包括浓度通常为小于500ng/ml的il
‑
15，如小于100ng/ml。
在一些实施方案中，方法包括浓度约50ng/ml的il
‑
15。
69.在一些实施方案中，从非造血组织样品中分离淋巴细胞和/或γδt细胞包括在il
‑
2和il
‑
15存在下培养，il
‑
2和il
‑
15均处于上述任何浓度。在某些情况下，il
‑
2的浓度约为100iu/ml，且il
‑
15的浓度为55ng/ml。
70.本文对“非造血组织”或“非造血组织样品”的提及包括皮肤(例如人皮肤)和肠道(例如人肠道)。非造血组织是除血液、骨髓或胸腺组织之外的组织。在一个实施方案中，非造血组织样品是皮肤(例如人皮肤)。在另一个实施方案中，非造血组织样品是肠道或胃肠道(例如人肠道或人胃肠道)。在一些实施方案中，淋巴细胞和/或γδt细胞不是从特定类型的生物流体(如血液或滑膜液)样品获得的。在一些实施方案中，根据本文定义的方法从中分离淋巴细胞和/或γδt细胞的非造血组织样品是皮肤(例如人皮肤)，其可以通过本领域已知的方法获得。或者，本文提供的淋巴细胞和/或γδt细胞的分离方法可应用于胃肠道(例如结肠或肠)、乳腺、肺、前列腺、肝、脾、胰腺、子宫、阴道和其他皮膜、粘膜或浆膜。淋巴细胞和/或γδt细胞也可能定居于人癌组织样品中，例如，乳腺或前列腺的肿瘤。在一些实施方案中，淋巴细胞和/或γδt细胞可以来自人癌组织样品(例如实体瘤组织)。在其他实施方案中，淋巴细胞和/或γδt细胞可以来自人癌症组织以外的非造血组织样品(例如，没有大量肿瘤细胞的组织)。例如，淋巴细胞和/或γδt细胞可以来自与附近或邻近癌组织分开的皮肤区域(例如健康皮肤)。因此，在一些实施方案中，γδt细胞不是从人癌组织获得的。在进一步的实施方案中，淋巴细胞不是从人癌组织获得的。
71.在一个实施方案中，本文限定的方法的非造血组织样品获自人。在可替代的实施方案中，本文限定的方法的非造血组织样品获自非人动物受试者。
72.用于获得此类组织的方法是本领域已知的。此类方法的实例包括解剖刀外植体或穿孔活检，并且大小可以因方法而异。在一些实施方案中，非造血组织样品通过穿孔活检获得。
73.在本发明的一些实施方案中，非造血组织样品是完整的活检样品。本文中对“完整”活检样品或“外植体”的提及包括组织和组织样品，其基本上没有被破坏，或没有被破坏，使得活检样品或外植体的结构完整性在切除周边内没有被故意破坏，所述切除从组织样品取出活检样品或外植体。这种完整的活检样品或外植体将在很大程度上保持三维结构，除了处理造成的轻微破坏。因此，这种完整的活检样品或外植体没有被机械破坏，例如，如通过切碎或剁碎，也没有被化学酶破坏。完整活检样品或完整组织样品可以包括整个组织、完整组织、组织的一部分或所述组织的所有要素。例如，在一个实施方案中，完整活检样品包含皮肤的所有层。在另一个实施方案中，活检样品包含皮肤的表皮层和真皮层。将理解的是，在其中活检样品完整的此类实施方案中，维持了这些层之间的分离和区分。因此，本文对“完整”的提及另外包括非造血组织样品的全厚度活检样品。
74.因此，在本发明的一个特定实施方案中，非造血组织样品没有被切碎。在更多实施方案中，完整活检样品是穿孔活检样品。在再一个实施方案中，通过钻孔活检获得了完整活检样品。本文呈现的其中非造血组织样品是完整活检样品的实施方案提供了令人惊讶的优势：从非切碎的和/或完整的非造血组织样品获得了大量分离或分开的细胞。此外，如本文证明的，从根据本文限定的方法从未切碎的和/或完整的非造血组织样品获得的细胞可以保留对随后本领域已知的扩增和/或工程化方法有用的表型。
75.在再一个实施方案中，完整活检样品是皮肤(例如，人皮肤)，或完整活检样品是肠道(例如，人肠道)。在一个实施方案中，非造血组织样品具有至少2mm的最小横截面。将理解“最小横截面”是指通过组织样品的质心测量的最小或最短长度。将进一步理解“最大横截面”是指通过组织样品的质心测量的最大或最长长度。如本文使用的术语“质心”是组织样品的所有点的平均(average或mean)位置。将认识到，根据更多实施方案，非造血组织样品具有至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少5mm、至少6mm、至少7mm或至少8mm的最小横截面。在更多实施方案中，非造血组织样品具有8mm或更小、7mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、或3mm或更小的最小横截面。在一个实施方案中，非造血组织样品具有2mm至8mm(包含)的最小横截面，如2mm至4mm。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约3mm的最小横截面。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约3mm的横截面。将认识到，根据更多实施方案，非造血组织样品具有至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少至少5mm、至少6mm、至少7mm或至少8mm的最大横截面。在更多实施方案中，非造血组织样品具有8mm或更小、7mm或更小、6mm或更小、5mm或更小、4mm或更小、3mm或更小或2mm或更小的最大横截面。在一个实施方案中，非造血组织样品具有1mm至8mm(包含)的最大横截面，如2mm至4mm。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约3mm的最大横截面。
76.根据更多实施方案，非造血组织样品具有至少2mm2的最小横截面积。将理解“最小横截面积”是指围绕组织样品质心测量的最小横截面的面积。将理解“最大横截面积”是指围绕组织样品质心测量的最大横截面的面积。如本文使用的术语“质心”是组织样品的所有点的平均(average或mean)位置。在再一个实施方案中，非造血组织样品具有至少2mm2、至少3mm2、至少4mm2、至少5mm2、至少6mm2、至少7mm2、至少8mm2、至少9mm2或至少10mm2的最小横截面积。在更多实施方案中，非造血组织样品具有50mm2或更小、40mm2或更小、30mm2或更小、25mm2或更小、20mm2或更小、15mm2或更小、10mm2或更小或8mm2或更小的最小横截面积。在一个实施方案中，非造血组织样品的最小横截面积在2mm2和50mm2之间，如在3mm2和12mm2之间。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约7mm2的最小横截面积。在更多实施方案中，非造血组织样品的最大横截面积为至少2mm2、至少3mm2、至少4mm2、至少5mm2、至少6mm2、至少7mm2、至少8mm2、至少9mm2或至少10mm2。在更多实施方案中，非造血组织样品具有50mm2或更小、40mm2或更小、30mm2或更小、25mm2或更小、20mm2或更小、15mm2或更小、10mm2或更小或8mm2或更小的最大横截面积。在一个实施方案中，非造血组织样品的最大横截面积在1mm2和50mm2之间，例如在3mm2和12mm2之间。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约7mm2的最大横截面积。
77.根据进一步的实施方案，非造血组织样品具有至少2mm3的体积。在进一步的实施方案中，非造血组织样品具有至少至少4mm3、至少5mm3、8mm3、至少10mm3、至少15mm3、至少20mm3、至少25mm3、至少30mm3、至少35mm3、至少40mm3、至少50mm3，或至少60mm3的体积。在进一步的实施方案中，非造血组织样品具有250mm3或更小、200mm3或更小，例如180mm3或更小、1600mm3或更小、140mm3或更小、120mm3或更小、100mm3或更小、80mm3或更小、60mm3或更小、50mm3或更小或40mm3或更小的体积。在一个实施方案中，非造血组织样品具有5mm3和250mm3之间，如15mm3和65mm3之间的体积。在一个特定的实施方案中，非造血组织样品具有约35mm3的体积。
78.在一个实施方案中，非造血组织样品为穿孔活检样品。穿孔活检样品可以是任何
形状，尽管方便地具有圆形横截面并且适当地直径至少为1mm。在更进一步的实施方案中，非造血组织样品包括直径至少2mm，例如直径至少3mm、直径至少4mm、直径至少5mm、直径至少6mm、直径至少7mm或直径至少为8mm的穿孔活检样品。在进一步的实施方案中，非造血组织样品包括直径为8mm或更小，如直径为7mm或更小、直径为6mm或更小、直径为5mm或更小或直径为3mm或更小的穿孔活检样品。在一个实施方案中，非造血组织样品包括直径在1mm和8mm之间，如直径在2mm和4mm之间的穿孔活检样品。在特定实施方案中，非造血组织样品包括直径为3mm的穿孔活检样品。
79.在某些实施方案中，非造血组织样品包含根据上文定义的尺寸、面积、体积和/或直径的活检样品(如穿孔活检样品，特别是圆形横截面的穿孔活检样品)并且通过获得活检样品的部位确定最大深度(尽管深度可能会减少)。在一个实施方案中，活检样品是皮肤活检样品并且包括表皮层和真皮层。在进一步的实施方案中，活检样品基本上不包括皮下脂肪。因此，在一个实施方案中，活检样品包括表皮层和真皮层并且基本上不包括皮下脂肪层。在进一步的实施方案中，活检样品不包括皮下脂肪。或者，皮下脂肪没有被去除，因此存在(或至少部分存在)于活检样品中。因此，在再一个实施方案中，活检样品由表皮层和真皮层组成。在一个实施方案中，活检样品包括非造血组织样品的全厚度。
80.因此，根据本发明的一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，包括步骤：
81.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是具有至少2mm2的最小横截面积的完整活检；和
82.(ii)从非造血组织样品收集淋巴细胞。
83.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
84.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是具有至少2mm2的最小横截面积的完整活检；和
85.(ii)从非造血组织样品收集γδt细胞群。
86.根据本发明的一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，包括步骤：
87.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是具有至少2mm3的体积的完整活检；和
88.(ii)从非造血组织收集淋巴细胞群。
89.根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，包括步骤：
90.(i)在il
‑
2和il
‑
15存在的情况下培养非造血组织样品，所述非造血组织样品是具有至少2mm3的体积的完整活检；和
91.(ii)从非造血组织样品收集γδt细胞群。
92.本发明的方法包括培养如本文定义的非造血组织样品。本文提及的“培养”包括将细胞和/或非造血组织样品(包括从非造血组织样品中分离、分开、取出、纯化或富集的细胞)加入包含细胞和/或非造血组织样品需要和/或优选的生长因子和/或必需营养素的培养基中。应当理解，这种培养条件可以根据待从本发明的非造血组织样品中分离的细胞或
细胞群进行调整，或可以根据待从非造血组织样品中分离和扩增的细胞或细胞群进行调整。
93.在某些实施方案中，非造血组织样品的培养持续足以从非造血组织样品中分离γδt细胞的时间。在可选的实施方案中，非造血组织样品的培养持续足以从非造血组织样品中分离除γδt细胞外的其他淋巴细胞(例如αβt细胞和/或nk(自然杀伤)细胞)的时间。在某些实施方案中，根据本文定义的方法的培养持续时间为至少14天。在某些实施方案中，根据本文定义的方法的培养持续时间少于45天，如少于30天，如少于25天。在进一步的实施方案中，根据本文定义的方法的培养持续时间在14天和35天之间，如14天和21天之间。在又一个实施方案中，根据本文定义的方法的培养持续时间为约21天。
94.在本发明的特定实施方案中，在培养非造血组织样品后，从非造血组织样品的培养物收集根据本文定义的方法分离的淋巴细胞和/或γδt细胞。如本文所定义的淋巴细胞和/或γδt细胞的收集可以包括从培养物物理收集淋巴细胞和/或γδt细胞、从其他淋巴细胞(例如αβt细胞、γδt细胞和/或nk细胞)分离淋巴细胞和/或γδt细胞或从基质细胞(例如，成纤维细胞)分离和/或分开淋巴细胞和/或γδt细。在一个实施方案中，通过机械方式(例如移液)收集淋巴细胞和/或γδt细胞。在另一个实施方案中，通过磁分离和/或标记的方式收集淋巴细胞和/或γδt细胞。在再一个实施方案中，通过流式细胞术技术(如facs)收集淋巴细胞和/或γδt细胞。因此，在某些实施方案中，通过特异性标记γδt细胞的方式来收集γδt细胞。在进一步的实施方案中，通过特异性标记淋巴细胞以将它们与培养物中的其他细胞区分开来收集淋巴细胞。将理解，淋巴细胞和/或γδt细胞的此类收集可以包括从非造血组织样品的培养物中物理取出、转移至分开的培养容器或转移至分开或不同的培养条件。
95.将理解在持续足以从非造血组织样品获得分离的淋巴细胞和/或γδt细胞群的时间后，进行这种淋巴细胞和/或γδt细胞的收集。在某些实施方案中，在非造血组织样品培养至少1周、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天后收集淋巴细胞和/或γδt细胞。适当地，在40天或更少，如38天或更少、36天或更少、34天或更少、32天或更少、30天或更少、28天或更少、26天或更少或24天或更少后收集淋巴细胞和/或γδt细胞。在一个实施方案中，在非造血组织样品培养至少14天后收集淋巴细胞和/或γδt细胞。在另一个实施方案中，在非造血组织样品培养14至21天后收集淋巴细胞和/或γδt细胞。
96.在本发明的某些实施方案中，在基本上不含血清的培养基(例如无血清培养基或含有血清替代物(sr)的培养基)中培养非造血组织样品。因此，在一个实施方案中，在无血清培养基中培养非造血组织样品。这种无血清培养基还可以包括血清替代培养基，其中血清替代是基于化学限定的成分以避免使用人或动物衍生的血清。在可选的实施方案中，在含有血清(例如人ab血清或胎牛血清(fbs))的培养基中培养非造血组织样品。在一个实施方案中，在含有血清替代物的培养基中培养非造血组织样品。在一种实施方式中，在不含动物衍生产品的培养基中培养非造血组织样品。
97.将理解根据本发明的其中在无血清培养基中培养非造血组织样品的实施方案具有避免与血清过滤、沉淀、污染和供应相关问题的优点。此外，动物衍生产品不利于用于人类治疗药物的临床级制造中。如本文中可见的，发明人还惊奇地发现了与使用含ab血清的培养基相比，使用无血清培养基用于分离细胞，特别是vδ1γδ细胞，显著增加了从非造血组
织样品获得的细胞数量。特别是，从无血清培养基中培养的非造血组织样品分离γδt细胞增加了vδ1细胞的产量。
98.在一个实施方案中，如本文所定义的方法在分离容器中进行。提及“分离容器”是指包含用于分离淋巴细胞和/或γδt细胞的非造血组织样品的容器，任选地还包含合成支架。应注意，分离容器可仅用于分离方法而不用于进一步的扩增步骤。
99.在一个实施方案中，如本文所定义的方法在包含透气材料的容器(例如分离容器)中进行。此类材料可渗透气体，如氧气、二氧化碳和/或氮气，以允许容器内容物与周围大气之间的气体交换。将理解本文对“容器”的提及包括培养皿、培养板、单孔皿、多孔皿、多孔板、烧瓶、多层烧瓶、瓶子(如滚瓶)、生物反应器、袋、管等。此类容器在本领域中已知用于涉及非贴壁细胞和其他淋巴细胞扩增的方法。然而，如本文所示的，令人惊讶地发现包含透气材料的容器也可用于分离通常认为是贴壁的γδt细胞。发现使用此类容器进行培养可大大提高从非造血组织样本中分离的γδt细胞的产量。还发现此类容器优于成纤维细胞和其他基质细胞(例如上皮细胞)(包括贴壁细胞类型)优先支持γδt细胞和其他淋巴细胞。因此，在一个实施方案中，如本文定义的包含透气材料的容器优先支持γδt细胞和其他淋巴细胞(例如αβt细胞和/或nk细胞)。在另一个实施方案中，在包含透气材料的容器中进行的培养中不存在成纤维细胞和/或其他基质细胞(例如上皮细胞)。
100.这种包含透气材料的容器可另外包含无孔的透气材料。因此，在一个实施方案中，透气材料是无孔的。在一些实施方案中，透气材料是膜，如硅酮、氟乙烯聚丙烯、聚烯烃或乙烯醋酸乙烯酯共聚物。此外，这种容器可以仅包括一部分透气材料、可透气膜或无孔透气材料。因此，根据再一个实施方案，容器包括顶部、底部和至少一个侧壁，其中所述容器底部的至少一部分包括所述顶部在所述底部上方时处于实质水平面中的透气材料。在一个实施方案中，容器包括顶部、底部和至少一个侧壁，其中所述底部的至少一部分包括所述顶部在所述底部上方时处于水平面中的透气材料。在进一步的实施方案中，容器包括顶部、底部和至少一个侧壁，其中所述至少一个侧壁包括所述顶部在所述底部上方时处于垂直面中的或所述顶部不在所述底部上方时处于水平面中的透气材料。应当理解，在这样的实施方案中，仅所述底部或所述侧壁的一部分可以包括透气材料。或者，整个所述底部或整个所述侧壁可以包括透气材料。在再一个实施方案中，包括透气材料的所述容器的所述顶部可以被密封，例如通过使用o形环来密封。这种实施方案将被理解为防止容器内容物的溢出或减少蒸发。因此，在某些实施方案中，容器包括液体密封容器，其包括透气材料以允许气体交换。在可选的实施方案中，包括透气材料的所述容器的所述顶部处于水平面中并且在所述底部上方并且未被密封。因此，在某些实施方案中，所述顶部被配置为允许从容器顶部进行气体交换。在进一步的实施方案中，所述透气容器的底部配置成允许从容器底部进行气体交换。在又一个实施方案中，所述包括透气材料的容器可以是液体密封容器并且还包括入口和出口或管。因此，在某些实施方案中，包括透气材料的容器包括顶部、底部和任选的至少一个侧壁，其中所述顶部和所述底部的至少一部分包括透气材料，并且如果存在，至少一个侧壁的至少一部分包括透气材料。示例性容器描述于wo2005035728和us9255243中，将其通过引用并入本文中。这些容器也是市售的，如由wilson wolf manufacturing提供的细胞培养装置，如g
‑
rex6孔板、g
‑
rex24孔板和g
‑
rex10容器。
101.因此，根据本发明的一个方面，提供了从非造血组织样品分离淋巴细胞的方法，其
包括步骤：
102.(i)将非造血组织样品放在包含透气材料的容器中；
103.(ii)在il
‑
2和il
‑
15的存在下培养非造血组织样品；和
104.(iii)收集从非造血组织样品培养的淋巴细胞群。
105.根据本发明的再一个方面，提供了从非造血组织样品分离γδt细胞的方法，其包括步骤：
106.(i)将非造血组织样品放在包含透气材料的容器中；
107.(ii)在il
‑
2和il
‑
15的存在下培养非造血组织样品；和
108.(iii)收集从非造血组织样品培养的γδt细胞群。
109.在一个实施方案中，将非造血组织样品放置在合成支架上。如本文所用的，“合成支架”、“支架”和“网格”可互换使用，并且是指适合支持细胞生长的非天然三维结构。非造血组织样品可以放置在或粘附在合成支架上，以促进淋巴细胞从外植体排出到支架上。合成支架可以由天然和/或合成材料制成，如聚合物(例如天然或合成聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯)、陶瓷(例如磷酸三钙、铝酸钙、羟基磷灰石钙)或金属(例如钽、钛、铂以及与铂、铌、铪、钨同一元素组中的金属，及其合金)。在本发明的一个实施方案中，合成支架是钽涂层的。生物因子(例如胶原蛋白(例如胶原蛋白i或胶原蛋白ii)、纤连蛋白、层粘连蛋白、整合素、血管生成因子、抗炎因子、糖胺聚糖、体外原(vitrogen)、抗体及其片段、细胞因子(例如il
‑
2、il
‑
15及其组合)可根据本领域已知的方法涂覆到支架表面上、封装在支架材料内或添加到培养基中以增强细胞贴壁、迁移、存活或增殖。这种和其他方法可用于从许多其他非造血组织类型(例如皮肤、肠道、前列腺和乳房)中分离淋巴细胞。
110.在一个实施方案中，将非造血组织样品放置在用于从非造血组织样品分离淋巴细胞的容器内部的合成支架上。在进一步的实施方案中，将合成支架配置成促进淋巴细胞和/或γδt细胞从非造血组织样品排到容器底部。这样的实施方案具有允许从非造血组织样品和/或基质细胞(例如成纤维细胞和/或上皮细胞)分离和/或分出淋巴细胞(例如γδt细胞、αβt细胞和/或nk细胞)的优点。此外，此类实施方案允许将淋巴细胞(例如γδt细胞、αβt细胞和/或nk细胞)从非造血组织样品收集到培养容器的底部。在特定的实施方案中，合成支架被配置为促进γδt细胞从非造血组织样品中排出。在进一步的实施方案中，合成支架被配置为促进淋巴细胞(如αβt细胞和/或nk细胞)从非造血组织样品中排出。
111.因此，在本文定义的方法的一个方面中，合成支架被配置为促进淋巴细胞从非造血组织样品排到培养容器的底部。在本文定义的方法的另一个方面中，合成支架被配置为促进γδt细胞从非造血组织样品排到容器底部。
112.本发明的方法提供远高于先前描述的总细胞产量。在一个实施方案中，总分离的细胞数为至少106个细胞/cm2、至少2
×
106个细胞/cm2、至少5
×
106个细胞/cm2、至少10
×
106个细胞/cm2、至少20
×
106个细胞/cm2、至少30
×
106个细胞/cm2、至少40
×
106个细胞/cm2、至少50
×
106个细胞/cm2、至少60
×
106个细胞/cm2、至少70
×
106个细胞/cm2、至少80
×
106个细胞/cm2、至少90
×
106个细胞/cm2、至少100
×
106个细胞/cm2、至少150
×
106个细胞/cm2、至少200
×
106个细胞/cm2的组织样品。在特定实施方案中，总分离的细胞数至少为50
×
106个细胞/cm2。在另一个实施方案中，总分离的细胞数为至少100
×
106个细胞/cm2。
113.在血液中占优势的γδt细胞主要是vδ2t细胞，而在非造血组织中占优势的γδt细胞主要是vδ1t细胞，因此vδ1t细胞约占非造血组织驻留的γδt细胞群的70
‑
80％。然而，一些vδ2t细胞也存在于非造血组织中，例如在肠道中，它们在那可以构成约10
‑
20％的γδt细胞。一些驻留于非造血组织中的γδt细胞既不表达vδ1也不表达vδ2tcr，因此在本文中被称为双阴性(dn)γδt细胞。这些dnγδt细胞可能主要是表达vδ3的和少数表达vδ5的t细胞。因此，通常驻留于非造血组织中并且通过本发明的方法分离的γδt细胞优选是非vδ2t细胞，例如是vδ1t细胞，包含较少量dnγδt细胞。
114.因此，在一个优选实施方案中，通过本文定义的方法分离的γδt细胞包含vδ1t细胞群。在一个实施方案中，通过本文定义的方法分离的γδt细胞包括dnγδt细胞群。在一个实施方案中，通过本文定义的方法分离的γδt细胞包括vδ3t细胞群。在一个实施方案中，通过本文定义的方法分离的γδt细胞包括vδ5t细胞群。
115.γδt细胞也可以通过它们表达的γ链的类型来定义。在另一个实施方案中，通过本文定义的方法分离的γδt细胞包括vγ4t细胞群。最常见地，vγ4t细胞获自肠道组织样品。
116.分离方法提供了分离的数量大于参考群的γδt细胞群(例如至少2倍数量、至少3倍数量、至少4倍数量、至少5倍数量、至少6倍数量、至少7倍数量、至少8倍数量、至少9倍数量、至少10倍数量、至少15倍数量、至少20倍数量、至少25倍数量、至少30倍数量、至少35倍数量、至少40倍数量、至少50倍数量、至少60倍数量、至少70倍数量、至少80倍数量、至少90倍数量、至少100倍数量、至少200倍数量、至少300倍数量、至少400倍数量、至少500倍数量、至少600倍数量、至少700倍数量、至少800倍数量、至少900数量、至少1,000倍数量、至少5,000倍数量，至少10,000倍数量)。
117.在一些实施方案中，根据本发明的方法分离的γδt细胞群具有低比例的表达tigit的细胞。例如，分离的γδt细胞群可以具有低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％或低于10％的tigit+细胞频率。可选地，分离的γδt细胞群可以具有约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％的tigit+细胞频率。在某些实施方案中，分离的γδt细胞群具有小于80％的tigit+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的γδt细胞群具有约70％的tigit+细胞频率。在另一个实施方案中，分离的γδt细胞群具有小于60％的tigit+细胞频率。在又一个实施方案中，分离的γδt细胞群具有约30％的tigit+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的γδt细胞基本上不表达tigit。
118.在一些实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有低频率的tigit+细胞。例如，分离的vδ1t细胞群可以具有比其他vδ1t细胞群小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的tigit+细胞频率。可选地，分离的vδ1t细胞群可以具有约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％的tigit+细胞频率。在某些实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有小于80％的tigit+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有约70％的tigit+细胞频率。在进一步的实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有小于60％的tigit+细胞频率。在又一个实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有约30％的tigit+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的vδ1t细胞基本上不表达tigit。
119.在一些实施方案中，根据本发明的方法分离的γδt细胞群表达cd27。例如，分离的γδt细胞群可以具有大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的cd27+细胞频率。可选地，分离的γδt细胞群可以具有约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的cd27+细胞频率。在某些实施方案中，分离的γδt细胞群具有大于10％的cd27+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的γδt细胞群具有约20％的cd27+细胞频率。在进一步的实施方案中，分离的γδt细胞群具有大于20％的cd27+细胞频率。在一个实施方案中，分离的γδt细胞群具有约20％的cd27+细胞频率。
120.在一些实施方案中，分离的vδ1t细胞群表达cd27。在另一个实施方案中，分离的γδt细胞表达cd27。在一些实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的cd27+细胞频率。可选地，分离的γδt细胞群可以具有约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的cd27+细胞频率。在某些实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有大于10％的cd27+细胞频率。因此，在一个实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有约20％的cd27+细胞频率。在进一步的实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有大于20％的cd27+细胞频率。在一个实施方案中，分离的vδ1t细胞群具有约20％的cd27+细胞频率。
121.在任何前述方面的一些实施方案中，相对于参考群(例如相对于使用备选方法分离的γδt细胞群)，分离的γδt细胞群具有更高的一种或多种标志物的表面表达，所述标志物选自cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。另外地或可选地，相对于参考群，分离的γδt细胞群可以具有更高频率的表达一种或多种标志物的细胞，所述标志物选自cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。特别地，标志物选自cd45ra和cd25。在一些实施方案中，相对于参考群，分离的γδt细胞群具有较低的一种或多种标志物的表面表达，所述标志物选自nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。另外地或可选地，相对于参考群，分离的γδt细胞群可以具有较低频率的表达一种或多种标志物的细胞，所述标志物选自nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。
122.在一些实施方案中，相对于参考群，分离的vδ1t细胞群具有更高的一种或多种标志物的表面表达，所述标志物选自cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。在一些实施方案中，相对于参考，分离的γδt细胞群具有更高频率的表达一种或多种标志物的细胞，所述标志物选自cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。在一些实施方案中，相对于参考群，分离的γδt细胞群具有较低的一种或多种标志物的表面表达，所述标志物选自nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。在其他实施方案中，相对于参考群，分离的γδt细胞群具有较低频率的表达一种或多种标志物的细胞，所述标志物选自nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。
123.从非造血组织(例如皮肤)中分离时，γδt细胞通常是含有例如αβt细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞的较大淋巴细胞群的一部分。在一些实施方案中，1％
‑
10％的分离的淋
巴细胞群是γδt细胞(例如1
‑
10％的分离的皮肤衍生的淋巴细胞群是γδt细胞)。在大多数情况下，γδt细胞群(例如皮肤衍生的γδt细胞群)将包括大量vδ1t细胞。在一些实施方案中，1
‑
10％的分离的淋巴细胞群(例如皮肤衍生的淋巴细胞)是vδ1t细胞(例如vδ1t细胞可以代表超过50％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％的分离的γδt细胞群)。在一些情况中，小于10％的分离的γδt细胞群是vδ2t细胞(例如，小于10％的分离的皮肤衍生的γδt细胞群是vδ2t细胞)。
124.非vδ1t细胞或非dn t细胞，如vδ2t细胞、αβt细胞、b细胞或nk细胞，可以从分离的γδt细胞群中除去(例如在扩增之前、期间或之后)。
125.分离的γδt细胞(例如从皮肤分离的γδt细胞，例如从皮肤分离的vδ1t细胞)与相应的造血组织衍生的细胞(例如血液衍生的γδt细胞和/或血液衍生的vδ2t细胞)具有不同的表型。例如，分离的γδt细胞群可以表达比参考群更高水平的ccr3、ccr4、ccr7、ccr8或cd103，所述参考群例如为tcr激活的非造血组织驻留γδt细胞群或相应的造血组织衍生的细胞(例如血液衍生的γδt细胞和/或血液衍生的vδ2t细胞)群。在一些实施方案中，分离的γδt细胞群包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的ccr3
+
细胞；至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的ccr4
+
细胞；至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的ccr7
+
细胞；至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的ccr8
+
细胞；和/或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的cd103
+
细胞。分离的γδt细胞群可以表达ccr3、ccr4、ccr7、ccr8或cd103中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或所有六种。
126.在一些实施方案中，分离的γδt细胞群(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或皮肤衍生的vδ1t细胞)表达比参考群更高水平的nkgd2、cd56、cd69和/或tim3，所述参考群例如为tcr激活的非造血组织驻留γδt细胞群和/或相应的造血组织衍生的细胞(例如血液衍生的γδt细胞和/或血液衍生的vδ2t细胞)群。在一些实施方案中，分离的γδt细胞群包括至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的nkgd2
+
细胞；至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的cd56
+
细胞；至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的cd69
+
细胞；和/或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的tim3
+
细胞。分离的γδt细胞群可以表达nkgd2、cd56、cd69和/或tim3中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或所有五种。
127.分离的非造血组织衍生的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或皮肤衍生的vδ1t细胞)群也可以通过功能来表征。可以进行本领域已知的功能测定以确定本发明的任何非造血组织衍生的细胞(例如分离的γδt细胞群、皮肤衍生的vδ1t细胞或扩增的γδt细胞的群和/或皮肤衍生的vδ1t细胞)和参考细胞(例如tcr激活的非造血组织驻留γδt细胞群或相应的造血组织衍生的细胞群，例如血液衍生的γδt细胞群和/或血液衍生的vδ2t细胞群)之间的功能差异。此类测定可以包括增殖测定、细胞毒性测定、结合测定、测量持久性和/或位置的测定等。
128.因此，在本发明的一个方面中，如本文定义的用于分离淋巴细胞和/或γδt细胞群
的方法产生包含与未耗尽的淋巴细胞和/或γδt细胞群一致的表面表型的群。
129.根据本发明的一个方面，提供了通过本文定义的任何方法可获得的分离的淋巴细胞群(例如皮肤衍生的αβt细胞和/或nk细胞)。
130.根据本发明的一个方面，提供了通过本文定义的任何方法获得的分离的淋巴细胞群(例如皮肤衍生的αβt细胞和/或nk细胞)。
131.根据本发明的再一个方面，提供了通过本文定义的任何方法获得的分离的γδt细胞群。
132.根据本发明的再一个方面，提供了通过本文定义的任何方法可获得的分离的γδt细胞群。
133.在一个实施方案中，分离的群包括大于5％的γδt细胞，例如7％至12％之间的γδt细胞。在一个实施方案中，分离的群包括vδ1细胞，其中少于50％，例如少于40％的vδ1细胞表达tigit。在一个实施方案中，分离的群包括vδ1细胞，其中超过50％，如超过60％的vδ1细胞表达cd27。
134.分离的非造血组织驻留淋巴细胞可能适合没有进一步扩增而使用，或者它们可以在进一步的步骤中扩增。
135.在某些实施方案中，本发明的特征在于扩增非造血组织驻留淋巴细胞和/或γδt细胞(例如皮肤衍生的αβt细胞、nk细胞、γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)。这些方法可以在体外进行。在一些实施方案中，根据本文定义的方法从已经从非造血组织样品分离的γδt细胞群扩增γδt细胞。通常，非造血组织驻留γδt细胞能够在与基质细胞(例如皮肤成纤维细胞)的物理接触去除时自发扩增。本文定义的方法可以用于诱导这种分离，导致γδt细胞的去阻遏以触发扩增。在某些实施方案中，根据本文定义的方法从已经从非造血组织样品分离的淋巴细胞群扩增淋巴细胞(例如皮肤衍生的αβt细胞和/或nk细胞、肠衍生的αβt细胞和/或nk细胞)。
136.如本文使用的，提及“扩增的”或“扩增的淋巴细胞和/或γδt细胞群”包括比未扩增的群更大或含有更大量细胞的细胞群。此类群可以数量多、数量少或是混合群，在该群中具有一定比例或特定细胞类型的扩增。将认识到术语“扩增步骤”是指导致扩增或扩增的群的过程。因此，与未进行扩增步骤或在任何扩增步骤前的群相比，扩增或扩增的群可以是数量更大或包含更多数量的细胞。还将认识到本文中所指的任何表示扩增的数字(例如倍数增加或倍数扩增)说明细胞群的数量或大小或细胞数量的增加，并表示扩增的量。
137.因此，在一个实施方案中，将根据本发明的方法分离的淋巴细胞和/或γδt细胞扩增。这种扩增可以包括在il
‑
2和il
‑
15存在下培养γδt细胞。或者，扩增可以包括在il
‑
9和il
‑
15存在下培养γδt细胞。将认识到任何扩增步骤都进行有效产生扩增的淋巴细胞和/或γδt细胞群的持续时间。在一个实施方案中，有效产生扩增的淋巴细胞和/或γδt细胞群的持续时间为至少5天。因此，在一个实施方案中，扩增包括在il
‑
2和il
‑
15存在下以有效产生扩增的γδt细胞群的量培养γδt细胞至少5天。在可选的实施方案中，扩增包括在il
‑
9和il
‑
15存在下以有效产生扩增的γδt细胞群的量培养γδt细胞至少5天。
138.在进一步的实施方案中，扩增包括将淋巴细胞和/或γδt细胞以有效产生扩增的淋巴细胞和/或γδt细胞群的量培养一段时间(例如至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天或更长，
例如5天至40天、7天至35天、14天至28天，或约21天)。在一些实施方案中，淋巴细胞和/或γδt细胞在培养中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18或21小时)至约35天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天)的时间段。在一个实施方案中，淋巴细胞和/或γδt细胞扩增14至21天的时间段。因此，包括分离培养阶段(例如1至40天，如14至21天)，在一些实施方案中，分离和扩增步骤可以持续28至56天，或约41天。
139.在进一步的实施方案中，扩增包括将γδt细胞培养至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天或更长，例如5天至40天，7天至35天，14天至28天，或约21天。在一个实施方案中，扩增步骤包括培养γδt细胞至少10、15或20天以产生扩增的群。在一个实施方案中，扩增步骤包括将γδt细胞培养5至25天，例如14至21天。在进一步的实施方案中，扩增步骤包括将γδt细胞培养约20天。
140.在一些实施方案中，有效产生扩增的γδt细胞群的il
‑
2的典型含量为1iu/ml至2,000iu/ml(例如5iu/ml至1,000iu/ml，10iu/ml至500iu/ml，20iu/ml至400iu/ml，50iu/ml至250iu/ml，或约100iu/ml，例如5iu/ml至10iu/ml，10iu/ml至20iu/ml，20iu/ml至30iu/ml，30iu/ml至40iu/ml，40iu/ml至50iu/ml，50iu/ml至60iu/ml，60iu/ml至70iu/ml，70iu/ml至80iu/ml，80iu/ml至90iu/ml，90iu/ml至100iu/ml，100iu/ml至120iu/ml，120iu/ml至140iu/ml，140iu/ml至150iu/ml，150iu/ml至175iu/ml，175iu/ml至200iu/ml，200iu/ml至300iu/ml，300iu/ml至400iu/ml，400iu/ml至500iu/ml，500iu/ml至1,000iu/ml，1,000iu/ml至1,500iu/ml，1,500iu/ml至2,000iu/ml，或更高)。在一些实施方案中，有效产生扩增的γδt细胞群的il
‑
2的含量为约100iu/ml。
141.在一些实施方案中，有效产生扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群的il
‑
15的典型含量为至少0.1ng/ml(例如0.1ng/ml至10,000ng/ml，1.0ng/ml至1,000ng/ml，5ng/ml至800ng/ml，10ng/ml至750ng/ml，20ng/ml至500ng/ml，50ng/ml至400ng/ml，或100ng/ml至250ng/ml，例如，0.1ng/ml至1.0ng/ml，1.0ng/ml至5.0ng/ml，5.0ng/ml至10ng/ml，10ng/ml至20ng/ml，20ng/ml至50ng/ml，50ng/ml至100ng/ml，100ng/ml至200ng/ml、200ng/ml至500ng/ml或500ng/ml至1,000ng/ml)。在一些实施方案中，有效产生扩增的γδt细胞群的il
‑
15的含量为约10ng/ml。
142.还可以用在非造血组织驻留γδt细胞的扩增培养中替代或添加其他因子。用于扩增淋巴细胞(如αβt细胞或nk细胞)的此类额外或可选因子是本领域已知的。在一个实施方案中，将此类因子用于选择性地促进γδt细胞扩增的扩增中。在另一个实施方案中，将此类因子用于选择性地促进淋巴细胞(如αβt细胞和/或nk细胞)扩增的扩增中。
143.应当理解，产生扩增的γδt细胞群所需的上述每种细胞因子的含量将取决于一种或多种其他细胞因子的浓度。例如，如果il
‑
2的浓度增加或减少，则il
‑
15的浓度可以相应地分别减少或增加。如上所述，有效产生扩增的群的含量在本文中是指所有因子对细胞扩增的复合效应。
144.扩增方法提供了数量大于参考群的扩增的γδt细胞群。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞群的数量高于扩增步骤前分离的γδt细胞群(例如，相对于扩增步骤前分离的γδt细胞群，至少2倍数量，至少3倍数量，至少4倍数量至少5倍数量，至少6倍数量，至少7倍
数量，至少8倍数量，至少9倍数量，至少10倍数量，至少15倍数量，至少20倍数量，至少25倍数量，至少30倍数量，至少35倍数量，至少40倍数量，至少50倍数量，至少60倍数量，至少70倍数量，至少80倍数量，至少90倍数量，至少100倍数量，至少200倍数量，至少300倍数量，至少400倍数量，至少500倍数量，至少600倍数量，至少700倍数量，至少800数量，至少900倍数量，至少1000倍数量，至少5,000倍数量，至少10,000倍数量，或更多)。
145.在一个实施方案中，扩增步骤包括在没有实质性的基质细胞接触的情况下培养分离的γδt细胞。在另一个实施方案中，扩增步骤包括在不存在大量成纤维细胞接触的情况下培养分离的γδt细胞。
146.将认识到本文定义的扩增方法也适用于其他淋巴细胞(例如αβt细胞和/或nk细胞)的扩增。在此类实施方案中，扩增步骤包括在相关生长因子和/或营养物(例如细胞因子和/或趋化因子)的存在下培养分离的淋巴细胞以产生扩增的淋巴细胞(例如αβt细胞和/或nk细胞)群。
147.在一个实施方案中，如本文定义的扩增γδt细胞群的方法包括在无血清培养基中培养γδt细胞或其他淋巴细胞。在另一个实施方案中，如本文定义的扩增γδt细胞群的方法包括在含有血清替代物的培养基中培养γδt细胞。因此应理解，γδt细胞在无血清或含有血清替代物的培养基中的这种扩增将实现与上述那些相似的优点。
148.在一些实施方案中，在扩增步骤期间不存在实质性的tcr途径激活(例如，培养物中不包括外源性tcr途径激活剂)。在一个实施方案中，扩增步骤包括不存在外源性tcr途径激动剂。此外，本文提供了根据本文定义的方法扩增分离的γδt细胞的方法，其中所述扩增方法不涉及与饲养细胞、肿瘤细胞和/或抗原呈递细胞的接触。因此，在本文定义的方法的另一个实施方案中，γδt细胞的扩增包括在缺乏实质性的基质细胞接触的情况下培养γδt细胞。
149.还提供了以高速率(例如，通过去除基质细胞接触和/或tcr刺激，或在有效量的因子存在下进行培养)产生大量非造血组织衍生的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群的方法。在一些实施方案中，本文所述的扩增步骤以低的群倍增时间扩增γδt细胞，其由以下等式给出：
[0150][0151]
鉴于本文提供的信息，技术人员将认识到本发明提供了以少于5天(例如少于4.5天、少于4.0天、少于3.9天、少于3.8天、少于3.7天、少于3.6天、少于3.5天、少于3.4天、少于3.3天、少于3.2天、少于3.1天、少于3.0天、少于2.9天、少于2.8天、少于2.7天、少于2.6天、少于2.5天、少于2.4天、少于2.3天、少于2.2天、少于2.1天、少于2.0天、少于46小时、少于42小时、少于38小时、少于35小时、少于32小时)的群倍增时间扩增非造血组织来源的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)的方法。
[0152]
在一些实施方案中，在7天培养内，扩增的γδt细胞群(例如扩增的vδ1t细胞和/或dn t细胞群)包含相对于扩增前分离的γδt细胞群至少10倍数量的γδt细胞(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000
倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍或至少8,000倍数量的γδt细胞)。在一些实施方案中，在14天的培养内，扩增的γδt细胞群(例如扩增的vδ1t细胞和/或dn t细胞群)包含相对于扩增前分离的γδt细胞群至少20倍数量的γδt细胞(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍，或至少10,000倍数量的γδt细胞)。在一些实施方案中，在21天培养内，扩增的γδt细胞群(例如扩增的vδ1t细胞和/或dn t细胞群)包含相对于扩增前分离的γδt细胞群至少50倍数量的γδt细胞(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍，或至少10,000倍数量的γδt细胞)。在一些实施方案中，在28天培养内，扩增的γδt细胞群(例如扩增的vδ1t细胞和/或dn t细胞群)包含相对于扩增前分离的γδt细胞群至少100倍数量的γδt细胞(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，至少110倍、至少120倍、至少130倍、至少140倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍，至少10,000倍，至少12,000倍，或至少15,000倍数量的γδt细胞)。
[0153]
通过本文提供的方法扩增的非造血组织衍生的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)可以具有充分适用于抗肿瘤功效的表型。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的vδ1t细胞)群比参考群(例如扩增步骤前分离的γδt细胞群)具有更高的cd27平均表达。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞群具有相对于分离的γδt细胞群至少2倍的cd27平均表达(例如相对于分离的γδt细胞群，至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍，至少30倍，至少40倍，至少50倍，至少60倍，至少70倍，至少80倍，至少90倍，至少100倍，至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少20,000倍，或更多)。
[0154]
扩增的γδt细胞群的不同部分(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)可以上调cd27，而另一部分是cd27
低
或cd27
阴性
。在这种情况下，相对于分离的γδt细胞群，扩增群中的cd27
阳性
细胞的频率可能更高。例如，与扩增前分离的γδt细胞群相比，扩增的γδt细胞群的cd27
阳性
细胞频率可以高至少5％(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，cd
27
阳性细胞频率高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％)。在一些实施方案中，相对于分离的γδt细胞群，扩增群中的cd27
阳性
细胞的数量可以增加。例如，相对于扩增前分离的γδt细胞群，扩增的γδt细胞群可具有至少2倍的cd27
阳性
细胞数量。扩增的γδt细胞群可具有大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、
大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的cd27+细胞频率。或者，扩增的γδt细胞群可以具有约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的cd27+细胞频率。在某些实施方案中，扩增的γδt细胞群具有大于50％的cd27+细胞频率。
[0155]
在一些实施方案中，相对于参考群(例如在扩增步骤前分离的γδt细胞群)，如本文提供的扩增方法产生具有低tigit表达的扩增的非造血组织衍生的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞群具有比参考群(例如，扩增步骤前分离的γδt细胞群)更低的tigit平均表达。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞群具有比分离的γδt细胞群低至少10％(例如比分离的γδt细胞群低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％或低达100％)的tigit平均表达。扩增的γδt细胞群可具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的tigit+细胞频率。或者，扩增的γδt细胞群可以具有约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％的tigit+细胞频率。在某些实施方案中，分离的γδt细胞群具有小于80％的tigit+细胞频率。
[0156]
在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群具有高数量或频率的cd27
+
细胞和低频率的tigit
+
细胞。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞群相对于参考群(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群)具有高频率的cd27
+
tigit
‑
细胞。例如，相对于扩增前分离的γδt细胞群，扩增的γδt细胞群的cd27+tigit
‑
细胞频率可以高至少5％(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，高至少10％，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％的cd27
+
tigit
‑
细胞频率)。在一些实施方案中，相对于分离的γδt细胞群，扩增群中的cd27
+
tigit
‑
细胞的数量可以增加。例如，相对于扩增前的γδt细胞的分离群，扩增的γδt细胞群可以具有至少2倍的cd27
+
tigit
‑
细胞数量(例如相对于扩增前分离的γδt细胞群，高至少10％，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％的cd27
+
tigit
‑
细胞频率)。
[0157]
在一些情况下，相对于参考群，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群中的cd27
+
γδt细胞群上的tigit平均表达低。在一些实施方案中，扩增的cd27
+
γδt细胞群具有低于参考群(例如，扩增步骤前分离的cd27
+
γδt细胞群)的tigit平均表达。在一些实施方案中，扩增的cd27
+
γδt细胞群具有比分离的cd27
+
γδt细胞群低至少10％的tigit平均表达(例如比分离的cd27
+
γδt细胞群低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％，或低最多100％)。
[0158]
另外地或可选地，相对于参考群，扩增的γδt细胞群(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)中的tigit
‑
γδt细胞群上的cd27中位表达高。例如，相对于扩增前分离的tigit
‑
γδt细胞群，扩增的tigit
‑
γδt细胞群可以具有高至少5％的cd27
+
细胞频率(例如相对于扩增前分离的tigit
‑
γδt细胞群，高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％的cd27
+
细胞频率)。在一些实施方案中，相对于
分离的tigit
‑
γδt细胞群，扩增群中的cd27+细胞的数量可以增加。例如，相对于扩增前分离的tigit
‑
γδt细胞群，扩增的tigit
‑
γδt细胞群可以具有至少2倍的cd27
+
细胞数量(例如相对于扩增前分离的tigit
‑
γδt细胞群，高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或高达100％的cd27
+
细胞频率)。
[0159]
其他标志物表达的增加或减少可另外地或可选地用于表征一种或多种扩增的非造血组织衍生的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群，所述其他标志物包括cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30、cd2、nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。在一些情况中，相对于分离的γδt群，例如，扩增前的，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，如vδ1t细胞和/或dn t细胞)群具有一种或多种选自以下的标志物的更高平均表达：cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。另外地或可选地，相对于分离的γδt细胞群，扩增的γδt细胞群可以具有更高频率的表达一种或多种选自以下标志物的细胞：cd124、cd215、cd360、ctla4、cd1b、btla、cd39、cd45ra、fas配体、cd25、icam
‑
1、cd31、klrg1、cd30和cd2。在一些实施方案中，相对于分离的γδt细胞群，扩增的γδt细胞群具有较低的选自以下的一种或多种标志物的平均表达：nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1和cd64。相对于分离的γδt细胞群，扩增的群可以类似地具有较低频率的表达一种或多种选自以下标志物的细胞：nkp44、nkp46、icam
‑
2、cd70、cd28、cd103、nkp30、lag3、ccr4、cd69、pd
‑
1、和cd64。
[0160]
通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞因此可具有以下一种或多种特性：(i)展示表型cd69
高
、tim3
高
和cd28
低/不存在
；(ii)上调ccr3、cd39、cd11b和cd9中的一种或多种；(iii)在不存在tcr激动剂的情况下，响应nkg2d配体产生ifn
‑
γ；(iv)在不存在tcr激动剂的情况下产生il
‑
13；(v)响应tcr激活产生ifn
‑
γ、tnf
‑
α和gm
‑
csf中的一种或多种；(vi)响应tcr激活不产生或基本上不产生il
‑
17；(vii)在不含额外生长因子的il
‑
2培养基中生长；(viii)在不存在tcr激动剂的情况下显示出细胞毒性t细胞反应；和/或(ix)对肿瘤细胞表现出优于正常细胞的选择性细胞毒性。
[0161]
在一些情况中，通过本发明的方法产生的非造血组织驻留γδt细胞在不存在tcr激动剂的情况下产生il
‑
13和/或在不存在tcr激动剂的情况下响应nkg2d配体产生ifn
‑
γ。
[0162]
许多适用于γδt细胞增殖的基础培养基是可用的，特别是诸如aim
‑
v、iscoves培养基和rpmi
‑
1640(life technologies)这样的培养基。培养基可以补充本文定义的其他培养基因子，如血清、血清蛋白和选择剂，如抗生素。例如，在一些实施方案中，rpmi
‑
1640培养基含有2mm谷氨酰胺，10％fbs，10mm hepes，ph7.2，1％青霉素
‑
链霉素，丙酮酸钠(1mm；life technologies)，非必需氨基酸(例如100μm gly、ala、asn、asp、glu、pro和ser；1x mem非必需氨基酸(life technologies))和10μl/lβ
‑
巯基乙醇。在可选的实施方案中，aim
‑
v培养基可以补充cts免疫血清替代物和两性霉素b。在如本文定义的某些实施方案中，培养基可以进一步补充il
‑
2和il
‑
15。方便地，在分离和/或扩增期间，细胞在合适的培养基中在含有5％co2的湿润气氛中37℃下培养。
[0163]
根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离和扩增淋巴细胞的
方法，包括步骤：
[0164]
(i)根据本文定义的方法从非造血组织样品分离淋巴细胞群；和
[0165]
(ii)进一步培养所述淋巴细胞群(如至少5天)以产生扩增的淋巴细胞群。
[0166]
在一个实施方案中，淋巴细胞包括αβt细胞。因此，根据本发明的再一个方面，提供了一种从非造血组织样品分离和扩增αβt细胞的方法，包括步骤：
[0167]
(i)根据本文定义的方法从非造血组织样品分离αβt细胞群；和
[0168]
(ii)进一步培养所述αβt细胞群(如至少5天)以产生扩增的αβt细胞群。
[0169]
步骤(ii)中的培养可以通过选择性扩增来进行，如通过选择其中αβt细胞优于步骤(i)分离的群中存在的其他细胞类型优先扩增的培养条件。或者，扩增条件不是选择性的，并且步骤(ii)中的培养可以接着非靶细胞(例如，αβt细胞以外的其他细胞)的耗竭。或者，扩增条件不是选择性的并且在步骤(ii)之前进行了非靶细胞(例如，αβt细胞以外的其他细胞)的耗竭。应注意这些实施方案的目的是扩增αβt细胞的总数，同时还增加了它们在群中的比例。
[0170]
在一个实施方案中，淋巴细胞包括nk细胞。因此，根据本发明的再一个方面，提供了从非造血组织样品分离和扩增nk细胞的方法，包括步骤：
[0171]
(i)根据本文限定的方法从非造血组织样品分离nk细胞群；和
[0172]
(ii)进一步培养所述nk细胞群(如至少5天)以产生扩增的nk细胞群。
[0173]
步骤(ii)中的培养可以通过选择性扩增来进行，如通过选择其中nk细胞优于步骤(i)分离的群中存在的其他细胞类型优先扩增的培养条件。或者，扩增条件不是选择性的，并且步骤(ii)中的培养可以接着非靶细胞(例如，nk细胞以外的其他细胞)的耗竭。或者，扩增条件不是选择性的并且在步骤(ii)之前进行了非靶细胞(例如，nk细胞以外的其他细胞)的耗竭。应注意这些实施方案的目的是扩增nk细胞的总数，同时还增加了它们在群中的比例。
[0174]
在一个实施方案中，淋巴细胞包括γδt细胞。因此，根据本发明的再一个方面，提供了从非造血组织样品分离和扩增γδt细胞的方法，包括步骤：
[0175]
(i)根据本文限定的方法从非造血组织样品分离γδt细胞群；和
[0176]
(ii)进一步培养所述γδt细胞群(如至少5天)以产生扩增的γδt细胞群。
[0177]
步骤(ii)中的培养可以通过选择性扩增来进行，如通过选择其中γδt细胞优于步骤(i)分离的群中存在的其他细胞类型优先扩增的培养条件。或者，扩增条件不是选择性的，并且步骤(ii)中的培养可以接着非靶细胞(例如，γδt细胞以外的其他细胞)的耗竭。或者，扩增条件不是选择性的并且在步骤(ii)之前进行了非靶细胞(例如，γδt细胞以外的其他细胞)的耗竭。应注意这些实施方案的目的是扩增γδt细胞的总数，同时还增加了它们在群中的比例。
[0178]
根据本发明的一个方面，提供了通过本文限定任一种方法获得的分离的淋巴细胞(例如，皮肤衍生的αβt细胞和/或nk细胞)的扩增群。
[0179]
根据本发明的再一个方面，提供了通过本文限定的任一种方法可获得的分离的淋巴细胞的扩增群。
[0180]
根据本发明的另一个方面，提供了通过本文限定的任一种方法获得的分离的γδt细胞的扩增群。
[0181]
根据本发明的再另一个方面，提供了通过本文限定的任一种方法可获得的分离的γδt细胞的扩增群。
[0182]
在一个实施方案中，分离的群包括高于50％的γδt细胞，如高于75％的γδt细胞，特别是高于85％的γδt细胞。在一个实施方案中，分离的群包括vδ1细胞，其中低于50％，如低于25％的vδ1细胞表达tigit。在一个实施方案中，分离的群包括vδ1细胞，其中超过50％，如超过60％的vδ1细胞表达cd27。
[0183]
通过本发明的方法获得的淋巴细胞和/或γδt细胞可以用作药物，例如用于过继性t细胞治疗。这涉及将通过本发明的方法获得的淋巴细胞和/或γδt细胞转移至患者中。治疗可以是自体的，即可以将γδt细胞转移回获得它们的同一患者，或者治疗可以是同种异体的，即可以将来自一个人的γδt细胞转移到不同的患者体内。在涉及同种异体转移的情况下，γδt细胞可以基本上不含αβt细胞。例如，可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，通过负选择，例如使用磁珠)，例如在扩增后，从γδt细胞群中耗尽αβt细胞。治疗方法可以包括；提供从供体个体获得的非造血组织样品；如上所述培养来自样品的γδt细胞以产生扩增的群；并将扩增的γδt细胞群施用于受体个体。
[0184]
待治疗的患者或受试者优选是人癌症患者(例如，正接受实体瘤治疗的人癌症患者)或感染病毒的患者(例如，感染cmv或感染hiv的患者)。在一些情况中，患者已经接受和/或正接受实体瘤的治疗。由于它们通常驻留在非造血组织中，因此组织驻留vδ1t和dnγδt细胞也比其全身血液驻留对应物更有可能归巢并保留在肿瘤块中，并且这些细胞的过继转移可能更有效地靶向实体瘤和潜在的其他非造血组织相关的免疫病理。
[0185]
由于γδt细胞是非mhc限制的，它们不会将它们转移进入的宿主识别为外来物，这意味着它们不太可能引起移植物抗宿主病。这意味着它们可以“现成”使用并转移到任何受体中，例如，用于同种异体过继性t细胞疗法。
[0186]
通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞表达nkg2d并响应nkg2d配体(例如mica)，其与恶性肿瘤密切相关。它们在不存在任何激活的情况下还表达细胞毒性特征，因此可能有效杀死肿瘤细胞。例如，如本文所述获得的非造血组织驻留γδt细胞可以在不存在任何激活的情况下表达ifn
‑
γ、tnf
‑
α、gm
‑
csf、ccl4、il
‑
13、颗粒溶素、颗粒酶a和b以及穿孔素的一种或多种，优选全部。可以不表达il
‑
17a。
[0187]
因此，本文报道的发现为通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞作为“现成的(off
‑
the
‑
shell)”免疫治疗剂的临床应用的实用性和适用性提供了令人信服的证据。这些细胞具有先天性样杀伤，不具有mhc限制，并且显示出与其他t细胞相比，归巢至肿瘤和/或在肿瘤内的驻留有所提高。
[0188]
在一些实施方案中，治疗在非造血组织中具有肿瘤的个体的方法可以包括：提供从供体个体获得的所述非造血组织样品，培养来自如上所述样品的γδt细胞以产生扩增的群，以及；将扩增的γδt细胞群施用于患有肿瘤的个体。
[0189]
药物组合物可以包括如本文所述的扩增的非造血组织驻留γδt细胞，并与一种或多种药学或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明药物组合物中的冷冻保存液包括例如dmso。可以配制组合物，
例如，用于静脉内给药。
[0190]
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含，例如，没有可检测水平的污染物，例如内毒素或支原体。
[0191]
在一些情况中，可以以治疗有效量向受试者施用治疗有效量的通过上述任何方法获得的扩增的γδt细胞(例如，用于治疗癌症，例如用于治疗实体瘤)。在一些情况中，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)的治疗有效量小于10
×
10
12
个细胞/剂(例如，小于9
×
10
12
个细胞/剂，小于8
×
10
12
个细胞/剂，小于7
×
10
12
个细胞/剂，小于6
×
10
12
个细胞/剂，小于5
×
10
12
个细胞/剂，小于4
×
10
12
个细胞/剂，小于3
×
10
12
个细胞/剂，小于2
×
10
12
个细胞/剂，小于1
×
10
12
个细胞/剂，小于9
×
10
11
个细胞/剂，小于8
×
10
11
个细胞/剂，小于7
×
10
11
个细胞/剂，小于6
×
10
11
个细胞/剂，小于5
×
10
11
个细胞/剂，小于4
×
10
11
个细胞/剂，小于3
×
10
11
个细胞/剂，小于2
×
10
11
个细胞/剂，小于1
×
10
11
个细胞/剂，小于9
×
10
10
个细胞/剂，小于7.5
×
10
10
个细胞/剂，小于5
×
10
10
个细胞/剂，小于2.5
×
10
10
个细胞/剂，小于1
×
10
10
个细胞/剂，小于7.5
×
109个细胞/剂，小于5
×
109个细胞/剂，小于2.5
×
109个细胞/剂，小于1
×
109个细胞/剂，小于7.5
×
108个细胞/剂，小于5
×
108个细胞/剂，小于2.5
×
108个细胞/剂，小于1
×
108个细胞/剂，小于7.5
×
107个细胞/剂，小于5
×
107个细胞/剂，小于2.5
×
107个细胞/剂，小于1
×
107个细胞/剂，小于7.5
×
106个细胞/剂，小于5
×
106个细胞/剂，小于2.5
×
106个细胞/剂，小于1
×
106个细胞/剂，小于7.5
×
105个细胞/剂，小于5
×
105个细胞/剂，小于2.5
×
105个细胞/剂，小于1
×
105个细胞/剂)。
[0192]
在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)的治疗有效量在治疗过程中小于10
×
10
12
个细胞(例如，在治疗过程小于9
×
10
12
个细胞，小于8
×
10
12
个细胞，小于7
×
10
12
个细胞，小于6
×
10
12
个细胞，小于5
×
10
12
个细胞，小于4
×
10
12
个细胞，小于3
×
10
12
个细胞，小于2
×
10
12
个细胞，小于1
×
10
12
个细胞，小于9
×
10
11
个细胞，小于8
×
10
11
个细胞，小于7
×
10
11
个细胞，小于6
×
10
11
个细胞，小于5
×
10
11
个细胞，小于4
×
10
11
个细胞，小于3
×
10
11
个细胞，小于2
×
10
11
个细胞，小于1
×
10
11
个细胞，小于9
×
10
10
个细胞，小于7.5
×
10
10
个细胞，小于5
×
10
10
个细胞，小于2.5
×
10
10
个细胞，小于1
×
10
10
个细胞，小于7.5
×
109个细胞，小于5
×
109个细胞，小于2.5
×
109个细胞，小于1
×
109个细胞，小于7.5
×
108个细胞，小于5
×
108个细胞，小于2.5
×
108个细胞，小于1
×
108个细胞，小于7.5
×
107个细胞，小于5
×
107个细胞，小于2.5
×
107个细胞，小于1
×
107个细胞，小于7.5
×
106个细胞，小于5
×
106个细胞，小于2.5
×
106个细胞，小于1
×
106个细胞，小于7.5
×
105个细胞，小于5
×
105个细胞，小于2.5
×
105个细胞，小于1
×
105个细胞)。
[0193]
在一些实施方案中，如本文所述的一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞包含约1
×
106、1.1
×
106、2
×
106、3.6
×
106、5
×
106、1
×
107、1.8
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108或5
×
108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含至少约1
×
106、1.1
×
106、2
×
106、3.6
×
106、5
×
106、1
×
107、1.8
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108或5
×
108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含多达约1
×
106、1.1
×
106、2
×
106、3.6
×
106、5
×
106、1
×
107、1.8
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108或5
×
108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤来源的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含约1.1
×
106‑
1.8
×
107个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含约1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
×
109或5
×
109个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含至少约1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
×
109或5
×
109个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)包含多达约1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
×
109或5
×
109个细胞/kg。
[0194]
在一个实施方案中，向受试者施用104至106个扩增的非造血组织驻留γδt细胞(例如皮肤衍生的γδt细胞和/或非vδ2t细胞，例如vδ1t细胞和/或dn t细胞)/kg受试者体重。在一个实施方案中，受试者接受非造血组织驻留γδt细胞群的初始给药(例如，初始给药104至106个γδt细胞/kg受试者体重，例如104至105个γδt细胞/kg受试者体重)，以及一次或多次(例如，2、3、4或5)次扩增的非造血组织驻留γδt细胞的后续给药(例如，一次或多次后续给药104至106个扩增的非造血组织驻留γδt细胞/kg受试者体重，例如104至105个扩增的非造血组织驻留γδt细胞/kg受试者体重)。在一个实施方案中，一次或多次后续给药在前一次给药后少于15天给药，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天，例如，在前一次给药后少于4、3或2天。在一个实施方案中，受试者在至少3次给药γδt细胞群的过程中接受总共约106个γδt细胞/kg受试者体重，例如受试者接受1
×
105个γδt细胞的初始剂量、3
×
105个γδt细胞的第二次给药和6
×
105个γδt细胞的第三次给药，并且例如每次给药在前一次给药后不到4、3或2天给药。
[0195]
通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞也可以被基因工程化以增强治疗特性，如用于car
‑
t疗法。这涉及产生工程化的t细胞受体(tcr)，以重新编程具有新特异性的t细胞，例如单克隆抗体的特异性。工程化的tcr可以使t细胞对恶性细胞具有特异性，并因此可用于癌症免疫治疗。例如，t细胞可以识别表达肿瘤抗原的癌细胞，如来自受试者组织的正常体细胞不表达的肿瘤相关抗原。因此，car修饰的t细胞可用于例如癌症患者的过继性t细胞疗法。
[0196]
已经描述了使用血液驻留γδt细胞进行car。然而，通过本发明的方法获得的非造血组织驻留γδt细胞很可能是特别好的用于car
‑
t方法的载体，因为它们可以用嵌合抗原特异性tcr转导，同时保留它们的先天样识别转化细胞的能力，并且可能比血液常驻γδt细胞或传统的全身αβt细胞具有更好的肿瘤渗透和驻留能力。此外，它们缺乏mhc依赖性抗原呈递，降低了移植物抗宿主病的可能性，并允许它们靶向表达低水平mhc的肿瘤。同样，它们不依赖传统的共刺激，例如通过cd28的参与，增强了对表达低水平的共刺激受体配体的肿瘤的靶向。
[0197]
在一些实施方案中，可以向受试者给药一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以选自免疫治疗剂、细胞毒剂、生长抑制剂、放射治疗剂、抗血管生成剂或其两种或更多种药剂的组合。可以在给药扩增的γδt细胞的同时、之前或之后给药另外的治疗剂。另外的
cts免疫血清替代物(life technologies)、人重组il
‑
2(miltenyi biotech，目录号130
‑
097
‑
746)和人重组il
‑
15(miltenyi biotech，130
‑
095
‑
766)，浓度如下文所述。对于培养的头7天，使用含有10ml两性霉素b(250μg/ml，life technologies)的完全分离培养基(“+amp”)。完全分离培养基中的细胞因子的目标终浓度如下：
[0213]
表1：完全分离培养基中的细胞因子的终浓度
[0214][0215][0216]
在收集48小时内获得、运输和处理成人皮肤样品。用手术刀和镊子从样品去除多余的皮下脂肪和毛发。将皮肤样品表皮面朝上放置，并使用适当大小的穿孔活检切割皮肤，用无菌钳夹住活检周围的皮肤。
[0217]
三个活检样品，表皮面朝上，均匀间隔并附着在一个钽涂层碳网格的表面上。使用无菌镊子，将网格转移到具有透气膜的组织培养容器中，如含有30ml完全隔离培养基(+amp)的g
‑
rex6孔板(wilson wolf manufacturing)的孔，或转移到含有300ml完全隔离培养基(+amp)的g
‑
rex100生物反应器(wilson wolf manufacturing)中。g
‑
rex6孔板的每个孔中放置一个网格，g
‑
rex10生物反应器中放置三个网格或g
‑
rex100生物反应器中放置十个网格。培养物在37℃下在5％co2培养箱中培养。
[0218]
除非另有说明，每7天更换一次培养基，轻轻吸出上层培养基并更换为2
×
完全分离培养基(不含amp)，尽量不干扰板或生物反应器底部的细胞。
[0219]
为了分离淋巴细胞，从g
‑
rex6孔板或g
‑
rex10或g
‑
rex100生物反应器取出带有皮肤的网格并丢弃处理。将存在于板或生物反应器底部的细胞重新悬浮，转移到500ml离心管中，然后离心(例如300g离心10分钟)。
[0220]
当需要细胞计数时，根据实施例1中所述的方案在此阶段对淋巴细胞进行计数。示例性研究的结果显示于表2中：
[0221]
表2.每个供体的分离的淋巴细胞产量
[0222][0223]
[0224]
实施例3.穿孔活检尺寸的优化
[0225]
初步测试显示了3mm穿孔活检优于标准皮肤切碎方法(图1)。
[0226]
通过测试1mm、2mm、3mm、4mm和8mm穿孔活检尺寸来进一步研究最佳穿孔活检尺寸，并使用2mm手术刀切碎的外植体作为对照。按照实施例2中所述的制备了皮肤样品。通过将一个活检样品(表皮面朝上)附着到碳网格的表面并放置在24孔板(corning)的孔中来测试每种尺寸。每个孔含有上述浓度的aim
‑
v 10％人ab血清+il
‑
2和il
‑
15，加上标准浓度的β
‑
巯基乙醇(2me)和青霉素/链霉素(p/s)。
[0227]
在细胞收获和细胞产量分析前，将活检样品在5％co2培养箱中在37℃下培养21天，培养基每周更新3次(培养基更换一半)。
[0228]
如实施例1中所述的测定总细胞产量。结果显示于表3中。结果显示了具有2
‑
4mm直径的活检样品提供了最高的细胞产量。
[0229]
表3：通过活检类型获得的总细胞产量
[0230]
外植体大小数量/组织平均产量/活检潜在的细胞产量/2
×
5cm组织2mm手术刀切碎的外植体2503.5e+052.9e+071mm直径穿孔活检9508.4e+057.9e+082mm直径穿孔活检2401.2e+062.9e+083mm直径穿孔活检968.9e+058.6e+074mm直径穿孔活检604.3e+052.6e+078mm直径穿孔活检123.0e+043.5e+05
[0231]
如实施例1中所述的确定细胞产量中存在的γδt细胞的比例。结果呈现于图2中。结果表明，直径为3mm的活检样品提供的γδt细胞产量最高。
[0232]
实施例4.分离容器的优化
[0233]
将24孔板中的分离与使用包含透气材料的容器(如g
‑
rex6孔板(wilson wolf manufacturing))进行比较。如实施例2中所述的制备皮肤样品。将活检样品以表皮面朝上的方式附着到碳网格的表面，然后将其放入24孔板或g
‑
rex6孔板的孔中。9mm网格用于24孔板，20mm网格用于g
‑
rex6孔板。所有样品都铺板在aim
‑
v 10％ab血清+p/s+2me+il
‑
2+il
‑
15中。对于24孔板，培养基每周更新3次。对于g
‑
rex6孔板，每周只需更新1次培养基。在细胞产量分析前，将活检样品在5％co2培养箱中在37℃下培养21天。
[0234]
如实施例1中所述的确定每个板和每个活检样品的总细胞产量。实验表明，与24孔板相比，g
‑
rex6孔板提供了每个活检样品和每个板增加的细胞产量(图3和表4)。g
‑
rex6孔板允许培养增加量的组织(与24孔板相比，组织多了2.5倍)，但它们产生的细胞数量惊人地增加了25倍。
[0235]
表4.通过24孔板vs.g
‑
rex6孔板获得的总细胞产量
[0236]
[0237]
实施例5.分离方案的优化
[0238]
进一步测试了在g
‑
rex容器中培养的3mm穿孔活检的使用，以优化分离方案。使用3mm穿孔活检制备、获得了皮肤样品，并将其置于g
‑
rex6孔板或g
‑
rex10生物反应器中。将活检样品在aim
‑
v(含有5％血清替代物(sr)、5％人ab血清或5％sr/5％ab“混合物”)+2me+p/s+il2/15中培养。
[0239]
首先，测试了细胞分离的持续时间。活检在37℃下在5％co2培养箱中孵育14或21天，然后进行细胞产量分析。如实施例1中所述的确定每个网格的总细胞产量。结果显示于图4中。对于所有培养基类型，与2周后的分离相比时，3周后的分离提高了细胞产量。
[0240]
还测试了血清替代物对比人ab血清(5％或10％)的使用。在细胞分析前，将活检样品在5％co2培养箱中在37℃下孵育21天。如实施例1中所述的测量每个网格的总细胞产量和vδ1细胞的％。结果显示于图5中。与人ab血清相比，使用补充了5％血清替代物的培养基获得了提高的细胞产量和更高的vδ1细胞比例。
[0241]
实施例6.细胞扩增
[0242]
一旦使用上述方案分离细胞，就可以使用本领域已知的方法扩增它们。例如，可以使用wo2017072367中描述的扩增方法实现γδt细胞的选择性扩增。