高糖品种甜菜转基因体系的建立方法与流程

本发明涉及一种甜菜转基因体系的建立方法。

背景技术：

甜菜(betavulgarisl.)是经济和观赏价值较高的一类草本植物。属藜科甜菜属二年生草本植物，地上部分为基生叶，叶片硕大，根圆锥至纺锤状，多汁。茎直立，基生叶矩圆形，长叶柄，上面皱缩不平，下面有粗壮凸出的叶脉，全缘或略呈波状，叶柄粗壮，茎生叶互生，较小，花团簇状，花被裂片条形或狭矩圆形，胞果上部稍肉质。种子双凸镜形，红褐色，5-6月开花，7月结果。

原产于欧洲西部和南部沿海，从瑞典移植到西班牙，该种广为栽培，变异很大，被分为若干亚种、变种和变型。

甜菜也是甘蔗以外的一个主要糖来源。菜用甜菜在美国普遍烹食或腌食，俄罗斯甜菜浓汤是东欧的传统甜菜汤。糖用甜菜是最重要的商业类型，饲料甜菜和叶用甜菜的栽培与大多数作物一样。

鲜艳、花姿独特及花后观叶等特点，广泛应用于园林地被绿化及鲜切花生产。而且甜菜所含的特有生物碱还具有重要药理价值。研究表明甜菜生物碱具有抗癌、消炎和胆碱酯酶抑制剂的作用，已被广泛应用于临床治疗。但甜菜中重要生物碱的含量很低，不能满足日益扩大的需求，而且过度采集严重破坏甜菜野生资源。因此，提高甜菜植株中重要生物碱的含量是当前甜菜开发利用迫切需要解决的问题。甜菜是我国甜菜属植物中分布范围最广、适应性最强的一个种，但是甜菜属于自交不亲和物种，不能通过常规的杂交手段来改良品质；而且以种子繁殖的其他甜菜属植物，从种子苗到开花至少需要2-3年，杂交育种周期很长。因此，甜菜转基因技术体系的建立，不仅是甜菜改良的必由之路，而且对于其他甜菜属植物的改良也具有高效优势，能够大大缩短育种进程。尽管甜菜组织培养及快繁技术已经成熟，愈伤组织诱导也有报道，但关于甜菜的转基因方法尚未见报道，而且甜菜属中也尚未有关于转基因方法的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用农杆菌介导法培育的高糖品种甜菜转基因体系的建立方法。

本发明的技术解决方案是：

一种高糖品种甜菜转基因体系的建立方法，其特征是：包括下列步骤：

a.甜菜种子萌发：

选取当年收获的甜菜种子60颗，置于250ml锥形瓶中加入自来水浸没，放在37℃摇床中培养24h，流水冲洗24h后，播种于含有湿润纱布的培养瓶中，放置在22℃，光照时长为“昼16h/夜8h”的培养室中培养；

b.甜菜幼苗的生长：

待甜菜种子萌发出小芽时，开始记生长天数，生长10d时用于实验用；

c.农杆菌侵染：

a.农杆菌的扩大培养

1）配含有卡那霉素的lb固体及液体培养基；卡那霉素的使用浓度为50mg/l；

2）在工作台中，将保存的菌种用接种环在含卡那霉素的lb固体培养基划板，28℃暗中培养48h；

3）取出菌板，用灭过菌的枪头挑取单菌落置于20ml含卡那霉素的lb液体培养基中，28℃，220rpm摇菌24h；

4）将摇好的菌液倒入200ml的含卡那霉素的lb液体培养基中，28℃，220rpm，摇8~12h；体积比：v培养基:v菌液=100:1；

b.农杆菌侵染甜菜

1）将已长出子叶的甜菜幼苗，用手术刀将一片子叶及顶芽切除，将切好的甜菜倒置于烧杯中；

2）将保存浓度为0.5mol/l的as取一定的量加入上述步骤a4）摇好的菌液中，使得as的终浓度为0.1mmol/l，然后将菌液倒入烧杯中，一般100ml菌液+20ulas，摇匀；

3）将所述烧杯放入真空瓶中，抽20min真空；

4）准备一个盒子，底部铺上一层用水浸透的滤纸；

5）步骤3）真空处理后，取出烧杯中的甜菜幼苗放入铺有滤纸的盒子内，然后用纸将根部遮蔽；

6）用保鲜膜封住盒子，然后用黑色袋完全遮蔽盒子，在25℃培养箱中，暗中培养1天；

c.浸染后的甜菜移栽

1）将按质量比为1：1比例混合的营养土和蛭石高压灭菌，之后装入盘中，倒入水浸透；

2）将暗中培养的甜菜幼苗种入营养土中，子叶露出；

3）封上保鲜膜，放入温室中，培养3天，三天后揭膜；

d.基因鉴定或抗性筛选

揭膜后，待新的子叶长出后进行鉴定；使用载体为含有绿色荧光的重组载体，鉴定时取叶片进行荧光观察并且进行pcr鉴定；此外，还通过将外植体消毒放置在含有卡那霉素的抗性愈伤培养基上，观察其愈伤组织生长情况。

e.转基因甜菜的pcr检测

获得的转基因甜菜植株，提取dna，设计gfp基因引物扩增，电泳检测，鉴别转基因植株。

步骤c中用于浸染的农杆菌可为任意一种根癌农杆菌，如eha105。

本发明采用转基因甜菜的方法，为提高甜菜重要生物碱含量、改良甜菜观赏品质及经济价值相关依赖于转基因技术的基础研究提供技术支撑，同时对于甜菜属其他植物转基因方法的建立具有重要的借鉴意义。

本发明将产生以下积极效果：(1)加速优良外源基因向甜菜的转移；(2)为改良甜菜重要生物碱的含量，含糖量，以及生态环境价值的提高提供快速有效的方法；(3)为甜菜重要生物碱的生产提供新的思路。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是甜菜种子的萌发示意图。

图2是甜菜幼苗的生长示意图。

图3是转基因甜菜转染后的培养示意图。

图4是转基因植株幼苗的荧光观察示意图。

图5是转基因甜菜的pcr扩增检测结果示意图。

具体实施方式

实施例1：甜菜种子的萌发与生长

1）选取当年收获的甜菜种子60颗，置于250ml锥形瓶中加入自来水浸没，放在37℃摇床中培养16h，流水冲洗24h后播种于含有湿润纱布的培养瓶中，放置在22℃，光照时长为16h/8h的培养室中培养，见图1。

2）待甜菜种子萌发出小芽时，开始记生长天数，生长10左右时可以用于实验用。

见图2。

实施例2：转基因甜菜的转化

a.农杆菌的扩大培养

①配含有卡那霉素的lb固体及液体培养基；卡那霉素的使用浓度为50mg/l；

②在工作台中，将保存的菌种用接种环在含卡那霉素的固体培养基划板，28℃暗中培养48h；

③取出菌板，用灭过菌的黄色枪头挑取单菌落置于20ml含卡那霉素的lb液体培养基中，28℃，220rpm摇菌24h；

④将摇好的菌液倒入200ml含卡那霉素的lb液体培养基中，28℃，220rpm，摇8-12h（注：体积比：v培养基:v菌液=100:1）；

b.农杆菌浸染甜菜

①将已长出子叶的甜菜幼苗，用手术刀将一片子叶及顶芽切除，将切好的甜菜倒置于烧杯中；

②将保存浓度为0.5mol/l的as（乙酰丁香酮）取一定的量加入摇好的农杆菌中，使得as的终浓度为0.1mmol/l，然后将菌液倒入烧杯中，一般100ml菌液+20ulas，摇匀；

③将烧杯放入真空瓶中，抽20min真空

④准备一个盒子，底部铺上一层用水浸透的滤纸，

⑤20min真空后，取出被浸染的甜菜幼苗放入铺有滤纸的盒子内，然后用纸将根部遮蔽；

⑥用保鲜膜封住盒子，然后用黑色袋完全遮蔽盒子，25℃培养箱，暗中培养1天；

c.浸染后的甜菜移栽

①将按质量比1：1比例混合的营养土和蛭石高压灭菌，之后装入盘中，倒入适当的水浸透；

②将暗中培养的甜菜幼苗种入营养土中，子叶露出；

③封上保鲜膜，放入温室中，培养3天，三天后揭膜；

基因鉴定或抗性筛选

揭膜后，待新的子叶长出后进行鉴定。本实验中所用载体为含有绿色荧光的重组载体，故鉴定时可取叶片进行荧光观察并且进行pcr鉴定。此外还可以通过将外植体消毒放置在还有卡纳抗性的抗性愈伤培养基上，观察其愈伤组织生长情况

实施3：转基因甜菜检测

1、转基因甜菜幼嫩叶片的荧光检测

对实施例2中获得的新长出的新鲜叶片进行荧光检测，荧光检测步骤如下：取新鲜叶片叶背表皮组织置于载玻片上，滴无菌水压片进行荧光检测。

2、转基因甜菜的pcr检测

对新鲜叶片用pcr方法进行检测，根据载体上携带的gfp基因序列设计引物，理论扩增产物大小为516bp，引物序列如下：

引物1(上游引物)：5’-atcccgccgggaatggtgattaccga

引物2(下游引物)：5’-gtcgtgcaccatcagcacgttatcga

采用sds法提取甜菜新鲜叶片的总dna，并以此为模板，在引物1和引物2的引导下，对转基因植株的dna进行pcr扩增，pcr反应条件为：94℃，5min,—94℃，30s—58℃，30s—72℃，30s—30个循环—72℃，10min。

反应结束后，对pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道m：dnamarkerdl2000，泳道1-4：不同待测植株，泳道5：未转基因对照，泳道6：阴性对照)，可扩增出大小为516bpdna片段的为阳性转基因植株。