特异性结合HLEG1蛋白的抗体、杂交瘤细胞以及检测方法与流程

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种特异性结合hleg1蛋白的抗体、杂交瘤细胞以及检测方法。

背景技术：

c6orf58基因是斑马鱼基因leg1在人类基因组中的同源物，是6号染色体上第58个开放阅读框。c6orf58基因简称其为hleg1基因。hleg1基因有两个转录本，一号转录本为1200bp，有六个外显子，编码一个大小为330aa的蛋白hleg1，二号转录本不编码蛋白。hleg1有一个20个氨基酸的信号肽及一个功能未知区域，是一个分泌蛋白，预测大小为38kd。在人的唾液，唾液腺和十二指肠中检测到其表达。经预测(cbspredictionservers)有24位天冬酰胺(n)，69位天冬酰胺(n)两个n连接糖苷化位点。目前对蛋白hleg1的功能研究仍有很大的探索空间。但缺乏检测hleg1蛋白的抗体。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异性结合hleg1蛋白的抗体，该抗体可以特异性结合hleg1蛋白，可以用于检测hleg1蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种杂交瘤细胞，其可以分泌特异性结合hleg1蛋白的抗体，用于制备或检测hleg1蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种检测hleg1蛋白的试剂盒。该试剂盒可检测hleg1蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种制备特异性结合hleg1蛋白的抗体的方法。该方法可以制备出特异性结合hleg1蛋白的抗体

本发明的另一目的在于提供一种检测hleg1蛋白的方法。该方法可以检测出hleg1蛋白。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种特异性结合hleg1蛋白的抗体，所述抗体的重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示，轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的分别如seqidno.4-6所示。其中，各cdr的氨基酸序列如下：

hcdr1(即重链互补决定区1)：gytftdys(seqidno.1)；

hcdr2：intktgep(seqidno.2)；

hcdr3：argaiynygskfsyyamdy(seqidno.3)。

lcdr1(即轻链互补决定区1)：ssvty(seqidno.4)；

lcdr2：ats(seqidno.5)；

lcdr3：qqwnsnpyt(seqidno.6)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7所示。

重链可变区的氨基酸序列如下：

qiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvkqapgkglkwmgwintktgeptyaddfkgrfafsletsastaylqiinlkdedtasyfcargaiynygskfsyyamdy。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.8所示。

轻链可变区的氨基酸序列如下：

qivlsqspailsaspgekvtmtcrasssvtyihwyqqtpgsspkpwiyatsnlasgvparfsgsgsgtsysltisrveaedaatyycqqwnsnpyt。

另一方面，本发明提供了一种特异性结合hleg1蛋白的抗体，其由杂交瘤细胞分泌制得，该杂交瘤细胞的保藏编号为cctccno：c2019254。

该杂交瘤细胞株于2019年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，武汉市武昌珞珈山，分类命名：杂交瘤细胞株1d11-6-4，保藏编号：cctccno：c2019254。

另一方面，本发明提供了一种分泌特异性结合hleg1蛋白的抗体的杂交瘤细胞，其保藏编号为cctccno：c2019254。

另一方面，本发明提供了一种检测hleg1蛋白的试剂盒，其包括如上所述的抗体。

另一方面，本发明提供了一种制备特异性结合hleg1蛋白的抗体的方法，其包括：培养如上所述的杂交瘤细胞。

另一方面，本发明提供了一种检测hleg1蛋白的方法，其包括：将样品与如上所述的抗体混合。

另一方面，本发明提供了一种检测hleg1蛋白的方法，其包括：将样品与如上所述的杂交瘤细胞的培养上清液混合。

另一方面，本发明提供了上述抗体在制备检测hleg1蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的特异性结合hleg1蛋白的抗体，其重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示，轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的分别如seqidno.4-6所示，该抗体也可由杂交瘤细胞分泌制得。该抗体可以特异性结合hleg1蛋白，具有较高的特异性，可以用于检测hleg1蛋白以及用于研究hleg1蛋白功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：制备抗体时免疫的5只小鼠：99#，100#，1#，2#，3#的血清检测其特异性识别抗原能力。wb底物1#和2#为两个供体提供的唾液样品。

图2：选取100#小鼠进行杂交瘤细胞制备并对各杂交瘤细胞系：1a,1c,1b,1d,1b4,1d11,1d6,1d13,1e8,1e11进行效价检测。wb底物为唾液样品。

图3：使用1d11细胞上清检测并验证hleg1的两个n糖苷化修饰位点：24n和69n。

图4：以原核表达的hleg1-re为底物通过wb建立测量hleg1含量的标准曲线。

图5：wb检测样品中hleg1含量示例。样品为不同供体提供的唾液样品。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1制备特异性结合hleg1蛋白的抗体

从公司(北京唯尚立德生物科技有限公司)的cdna文库购买c6orf58，测序发现公司购买的序列n端缺少180bp碱基，从人类基因组dna中将该部分序列克隆出来并构成完整的hleg1基因序列并克隆至pcs2+。随后将全长hleg1基因克隆进pet30a+质粒，验证诱导表达成功后由杭州华安生物进行小鼠单抗制备及检验。

hleg1基因编码的hleg1蛋白的氨基酸序列如下：

maflpswvcvlvgsfsaslagtsnlsetepplwkespgqlsdyrvensmyiinpwvylermgmykiilnqtaryfakfapdneqnilwglplqygwqyrtgrladptrrtncgyesgdhmcisvdswwadlnyflsslpflaavdsgvmgissdqvrllpppknerkfcydvsscrssfpetmnkwntfyqylqspfskfddllkylwaahtstladniksfedrydyyskaeahferswvlavdhlaavlfpttlirsykfqkgmpprillntdvapfisdftafqnvvlvllnmldnvdksigylcteksnvyrdhsesssrsygnnsle。

2单抗的制备

(1)小鼠免疫方案：

实验步骤

1)、动物挑选：小鼠采用balb/c，体重18-22g左右，周龄在7-10w左右。动物选择毛色要光泽，活动自如的健康动物。

2)、实验前准备：动物标记。

3)、免疫原准备：

(a)在bl21大肠杆菌中表达hleg1作为抗原并保存在-20冰箱，将抗原从-20度冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。注射器标记，写上项目号和动物号。

(b)抽取抗原(抗原完全混匀)，首免抗原浓度为1mg/ml,小鼠免疫剂量为0.1ml/只。二免-四免抗原浓度为0.5mg/ml，小鼠免疫剂量为0.1ml/只。

(c)抽取佐剂，佐剂和抗原为1:1抽取。首免采用弗氏完全佐剂，二-四免采用弗氏不完全佐剂。佐剂要混合均匀后再抽入注射器。

(4)乳化：二个注射器用橡皮管对接后进行完全乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37度水中不分散为合格。

4)、免疫小鼠：小鼠为皮下、腹腔多点注射。操作时间：首免后第21天进行二免，二免到三免，三免到四免间隔时间为14天。小鼠四免后第7天眼眶采血检测。

5)、血清离心：小鼠四免后第7天眼眶采血检测，每分钟10000转5-10分钟，取上清。

(2)小鼠脾脏免疫：

实验步骤

1)、准备工作：小心吸取适量的抗原，备用。注意一般小鼠脾免的用量0.05ml～0.1ml，过多的剂量容易导致小鼠死亡，过少的剂量导致免疫效果不佳。

2)、小鼠麻醉：镊子夹住棉花，伸入乙醚的瓶子中蘸少许乙醚，迅速置于倒置的烧杯中，同时拎起小鼠，置于烧杯中麻醉。触动小鼠的四肢，无神经反射，麻醉结束。注意如若注射麻醉剂，需要严格控制麻醉剂剂量。

3)、将小鼠固定在小鼠固定架上，左腹部朝上，快速剃去左腹部的鼠毛。

4)、用酒精棉擦拭后，可见黝黑色组织块即小鼠脾脏。顺着小鼠脾脏部位剪开外膜，拎起内膜，剪开内膜，注意内膜不应剪开过大，以脾的宽度大小最好。

5)、用镊子小心拎出脾脏些许，一手用镊子固定住脾脏，另一手往脾内注射抗原，随着抗原的注入，脾脏缓慢泛白。

6)、小心抽出注射器针头，将脾脏放回小鼠体内。

7)、按顺序用镊子拎起内膜和外膜，用缝合针将伤口缝合，一般内膜缝一针，外膜缝三针即可。

8)、将小鼠从固定架上取下(此时小鼠应已苏醒)，放回鼠笼继续饲养，直至取脾融合。

9)、将剪刀、镊子、止血钳和缝合针用酒精棉擦净，备用。

(3)细胞融合及筛选方法

1)脾细胞制备：

(a)取iv后第四天的小鼠。

(b)核对小鼠编号和项目编号。

(c)抓住小鼠尾巴，拉紧小鼠颈部皮肤保持其头部无法自由转动的同时，使其眼珠向外突出。

(d)用弯头镊子将突出的眼球摘下后，收集从眼眶中留出血液。将血液37℃处理30min后，4℃冰浴1h，10000rpm离心10min，收集上层血清备用。

(d)待血流完后，断颈处死小鼠，并放入盛有75％酒精的烧杯中消毒。

(e)将烧杯连同小鼠和酒精一并带入无菌室内。

(f)用大镊子将小鼠从酒精中取出，沥干酒精后，放入超净台上的肾形盘中。

(g)用大镊子将小鼠腹部毛皮层提起，用无菌眼科剪剪出一个倒三角的切口后，用止血钳将其腹部毛皮层撕开，露出腹腔。注：该步骤需小心，不要剪破腹腔膜。

(h)用无菌小镊子提起小鼠腹腔膜，用另一无菌眼科剪剪开腹腔膜，直至整个腹腔暴露出来。

(i)在腹腔右上方，找出脾脏，小心取出后，放入盛有预热的imdm培养液的玻璃平皿中，换三个皿，洗涤三遍。

(j)用镊子在脾脏一端先造成一个小洞，然后用两把镊子将脾脏中的脾细胞挤压出来，然后用1ml的枪将脾细胞吹散，收集至50ml离心管，1500rpm离心3min。

(k)弃去上清，沉淀敲散后加入30mlimdm培养液，1500rpm离心3min。

(l)重复操作步骤(k)1次，混匀计数备用。

2)细胞融合步骤：

(a)将生长状态良好的sp2/0细胞，吹打下来后，1500rpm离心3min。

(b)弃去上清，用30ml预热的imdm培养液重悬细胞。

(c)1500rpm离心3min。

(d)重复步骤(b)和(c)1次。

(e)弃去上清，加入适量预热的imdm培养液重悬细胞。

(f)取50μl细胞悬液与150μl台盼蓝混匀后，于显微镜下检活计数。

(g)按照小鼠脾细胞与sp2/0细胞10:1的比例各取好相应细胞量，在进口的50ml离心管中混合均匀后，1500rpm离心3min。

(h)用抽液泵抽干上清。

(i)沿着离心管底部的管壁，缓慢加入1ml预热的peg(1500)，需在60s内加完。

(j)将37℃水浴静置1min。

(k)沿管壁缓慢滴加5ml预热的imdm培养液，再逐渐加快速度，加入15ml预热的imdm培养液，最终加至40ml。

(l)1200rpm离心5min。

(m)弃去上清，加入25ml预热的sp2/0骨髓瘤细胞培养液，用10ml移液管小心重悬细胞。

(n)100μl/孔的量将融合后的杂交瘤细胞悬液铺到96孔细胞培养板上。

(o)过4-6h，加入2×hat培养液，100μl/孔。

2)细胞筛选过程：

融合后细胞生长7天检测阳性，挑取阳性细胞，阳性细胞孔中细胞吹匀后取200个细胞铺到96孔板中进行sub筛选，挑选单克隆抗体，sub板细胞一般生长8-10天后取上清检测，挑选阳性细胞株。若未挑选到阳性细胞株不是单克隆细胞株的话，重新再进行sub，直至挑选到单克隆阳性细胞株为止。挑选到单克隆细胞株后，扩大培养，收集细胞上清液并冻存细胞。

3)pri、sub后阳性筛选使用方法：

实验方法：间接法elisa

(a)包板：用包被缓冲液将抗原稀释至1μg/ml，elsia板的96孔板中加50μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次，拍干。

(b)封闭：每孔加60μl的1％bsa进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。

(c)加样：加细胞上清液，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性(免疫后小鼠血清1:500稀释)和阴性对照孔(加1％bsa)。置37℃孵育30min，拍干，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次，拍干。

(d)加酶标抗体：加稀释的羊抗鼠二抗-hrp(1:3000稀释，用1％bsa进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育30min，之后弃液，用1xtbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次，拍干。

(e)加底物液显色：于各反应孔中加入配制的tmb底物溶液100μl(a液与b液以1:1配制，现配现用)，置37℃反应5min。

(f)终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸100μl，终止反应。

(g)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数，保存数据，进行分析。

亚型检测：

1d11为igg2b,轻链为κ型。

检测99#，100#，1#，2#，3#五只小鼠血清(见图1)，选取100#小鼠进行杂交瘤细胞培养并对细胞上清进行检测(见图2中a,b)。由wb结果，我们选取了1d11细胞株进行腹水注射和收集并将该细胞系冻存。

获得了一株可分泌hleg1特异性单抗的杂交瘤细胞株(命名为1d11细胞株)，其能够在人的唾液样品中检测到hleg1的表达并测定其含量。该杂交瘤细胞株于2019年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，武汉市武昌珞珈山，分类命名：杂交瘤细胞株1d11-6-4，保藏编号：cctccno：c2019254。

3.1d11单克隆抗体可变区域克隆及分析

1d11杂交瘤细胞轻、重链可变区基因测序

(1)杂交瘤细胞的复苏

从液氮冻存罐中取出冻存管，迅速在37℃水浴锅中晃动解冻细胞，立即将细胞转移至含30mlimdm基础培养基的50ml无菌离心管中；1500rpm，离心3min；倒干离心管中的培养基，离心管底部轻敲手背的方式敲散细胞；加入1ml杂交瘤培养基，重悬细胞；将含细胞的悬液转移至25cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中，补加9ml杂交瘤培养基；置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。

(2)杂交瘤细胞的传代

用10ml移液管吹悬细胞，随后将含细胞的培养液转移至50ml无菌离心管中；1500rpm，离心3min；倒干离心管中的培养基，离心管底部轻敲手背的方式敲散细胞；加入1ml杂交瘤培养基，重悬细胞；将含细胞的悬液转移至25cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中，补加9ml杂交瘤培养基；置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。

(3)杂交瘤细胞的冻存

待25cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中的细胞长至底部的80％～90％时，用手小心拍打培养瓶中长满细胞的一侧；将细胞悬液转移至75cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中，补加30ml杂交瘤培养基；置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。待75cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中的细胞长至底部的80％～90％时，用手小心拍打培养瓶中长满细胞的一侧；将细胞悬液转移至50ml无菌离心管中；1500rpm，离心3min；倒干离心管中的培养基，离心管底部轻敲手背的方式敲散细胞；每个大瓶中加入2ml细胞冻存液(10％dmso，90％胎牛血清)，每个大瓶中的细胞冻存两管；先置于-80℃放置1天，之后转移至液氮罐中长期保存。

(4)trizol法提取1d11杂交瘤细胞总rna

取处于对数生长期中生长状态良好的细胞，900rpm离心5min弃上清收集细胞。加1mltrizol试剂，在冰上充分吹打混匀以完全裂解细胞。室温静置5min,加0.2ml氯仿，剧烈震荡30s,室温放置5min。4℃12000g离心15min，样品出现明显分层，rna在上层水相中。小心吸取上层水相转移到新管中，加0.5ml异丙醇室温放置10min沉淀rna。4℃12000g离心10min，离心后在管底出现胶状沉淀。弃去上清，加1ml75％乙醇，弹ep管震碎沉淀，充分洗涤rna，4℃7500g离心5min，弃上清。55℃放置干燥rna沉淀，加50μldepc水充分溶解rna，nanodrop测rna浓度和纯度。

(5)逆转录反应获得cdna

(a)以2μgrna为模板，加1.5μloligo(dt)primer(0.5mg/ml),1μl10mmdntp，用depc水补足体系至12μl。

(b)65℃加热5min，迅速在冰上冷却。加入4μl5×first-standbuffer,2μl0.1mdtt,1μlm-mlvrt,混匀，37℃孵育50min后70℃加热15min使逆转录酶失活。

(c)分装，置-20℃保存cdna。

(6)pcr扩增1d11单克隆抗体可变区基因：

(a)扩增1d11单克隆抗体可变区基因引物，如下：

vl5’：

ggggtcgacctcaccatggattttcaagtgcagattttcag。

vl3’：

cccaagcttactggatggtgggaaatgga。

vh5’：

atgaggrcccctgctcagwttyttggiwtctt。

vh3’：

cccaagcttactggatggtgggaaatgga。

(b)反应体系

pcr反应条件：95℃反应5min；(95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s)×34次循环，72℃延伸10min。

(c)电泳检测连接产物并将产物连接进t载体测序，结果如下：

重链可变区氨基酸序列如下：

qiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftdysmhwvkqapgkglkwmgwintktgeptyaddfkgrfafsletsastaylqiinlkdedtasyfcargaiynygskfsyyamdy(seqidno.7)。

重链可变区的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别如下：

hcdr1：gytftdys(seqidno.1)；

hcdr2：intktgep(seqidno.2)；

hcdr3：argaiynygskfsyyamdy(seqidno.3)。

轻链可变区氨基酸序列如下：

qivlsqspailsaspgekvtmtcrasssvtyihwyqqtpgsspkpwiyatsnlasgvparfsgsgsgtsysltisrveaedaatyycqqwnsnpyt(seqidno.8)。

轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列分别如下：

lcdr1：ssvty(seqidno.4)；

lcdr2：ats(seqidno.5)；

lcdr3：qqwnsnpyt(seqidno.6)。

实施例2

验证hleg1糖苷化修饰位点

将hleg1构建到pcs2+中，将24位、69位及24位和69位天冬酰胺(n)突变为丙氨酸(a)并获得了三种糖苷化修饰缺失突变：24n2a,69n2a,bothn2a。将三种质粒由polyjet将三种质粒转染到293t中在48h分别收取293t上清和细胞裂解液样品进行wb分析。使用实施例1的从杂交瘤细胞分泌的抗体样品做一抗。

由图3可知：1)hleg1，24n2a，69n2a，bothn2a都是分泌蛋白，可以分泌到上清中。2)24asn和69asn处的修饰缺失会导致蛋白变小。24位和69位两个点都缺失后蛋白大小与用糖苷酶处理后的唾液样品中检测到的hleg1大小一致。

实施例3

检测人唾液中hleg1蛋白表达及含量

将hleg1构建在pet30a+中，在大肠杆菌中纯化表达hleg1蛋白，简称为hleg1-re。对hleg1-re进行稀释获得终浓度为0.25ng/μl,0.5ng/μl,1ng/μl,2ng/μl,4ng/μl的样品，使用实施例1得到的抗体，并进行wb实验，利用imagej测量其iod。hleg1-re浓度和iod呈现线性正相关。由此我们利用hleg1-re建立了一条标准曲线。

在分析人唾液中hleg1蛋白表达含量时，使用salivettecortisol唾液收集管收集不同人来源的唾液样品，与浓度为0.25ng/μl,0.5ng/μl,1ng/μl,2ng/μl,4ng/μl的hleg1-re样品一起进行wb。利用梯度稀释的hleg1-re建立标准曲线并计算出唾液样品中的hleg1含量。

标准曲线的结果见图4和wb分析结果见图5。

根据标准曲线计算出的图5中不同唾液样品(1-8)的hleg1浓度见下表1。

表1

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>浙江大学

<120>特异性结合hleg1蛋白的抗体、杂交瘤细胞以及检测方法

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glytyrthrphethrasptyrser

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

ileasnthrlysthrglyglupro

15

<210>3

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

alaargglyalailetyrasntyrglyserlysphesertyrtyrala

151015

metasptyr

<210>4

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

serservalthrtyr

15

<210>5

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<400>5

alathrser

1

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>6

glnglntrpasnserasnprotyrthr

15

<210>7

<211>115

<212>prt

<213>人工序列

<400>7

glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu

151015

thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

sermethistrpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmet

354045

glytrpileasnthrlysthrglygluprothrtyralaaspaspphe

505560

lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr

65707580

leuglnileileasnleulysaspgluaspthralasertyrphecys

859095

alaargglyalailetyrasntyrglyserlysphesertyrtyrala

100105110

metasptyr

115

<210>8

<211>96

<212>prt

<213>人工序列

<400>8

glnilevalleuserglnserproalaileleuseralaserprogly

151015

glulysvalthrmetthrcysargalaserserservalthrtyrile

202530

histrptyrglnglnthrproglyserserprolysprotrpiletyr

354045

alathrserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyser

505560

glyserglythrsertyrserleuthrileserargvalglualaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpasnserasnprotyrthr

859095