一种修饰肽的制备及其应用的制作方法

本发明属于新型化合物领域，具体涉及一种新型修饰肽及其制备方法与应用。

背景技术：

伴随着多重耐药性细菌的流行，新型抗生素的研发速度远远赶不上细菌耐药性的发展速度，所以人们急需一种能够代替抗生素的治疗方法。抗菌肽是生物体内分泌的具有抑菌作用的多肽物质，它能有效抑菌但不易使细菌产生抗性突变，因而受到人们的关注。rwrwrw是一种人工合成的阳离子六肽，它能靶向并富集在革兰氏阳性菌病原菌细胞膜内，使参与细胞壁的合成和细胞呼吸作用的膜蛋白离域，最终导致病原体死亡。这种抗菌肽对病原菌的选择性远大于正常哺乳动物细胞，无明显毒性，是一种常用的抗菌先导结构。但rwrwrw的抗菌效果有限，并且只对革兰氏阳性菌有抑制作用，对革兰氏阴性菌的效果有限。

技术实现要素：

本发明提供了一种修饰肽，该化合物同时含有以(rw)3以基础结构的抗菌肽链和光敏剂疏水基团，以及能够提供亲水性和正电荷的赖氨酸序列（k5）。本修饰肽能有效杀灭包括革兰氏阴性菌和耐药菌在内的大多数微生物；其在光照作用下，具有抗菌肽和光敏剂结构的双重抗菌作用，无光状态下能够抑菌，光照状态下杀菌率可达99.999%，效果超过单独使用的抗菌肽或光敏剂分子。基于良好的抗菌活性，本修饰肽具有显著促进伤口愈合的效果。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种修饰肽，所述多肽的氨基酸顺序为(ggg)nkkkkkrwrwrw(其中n=1–3)，且n端通过化学键修饰了光敏剂，所述光敏剂包括酞菁及其衍生物、卟啉及其衍生物和氟硼二吡咯及其衍生物中的任意一种。

述的酞菁及其衍生物为带羧基结构的酞菁及其衍生物；所述的卟啉及其衍生物为带羧基结构的卟啉及其衍生物；所述的氟硼二吡咯及其衍生物为带羧基结构的氟硼二吡咯及其衍生物。

所述光敏剂为β-单羧基取代酞菁染料，其结构式为：

；

结构式中m为金属zn、al、si中的任意一种。

所述光敏剂为β-单羧基取代酞菁锌，其结构式为：

。

一种新型修饰肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）在一定温度下，将含有羧基的光敏剂溶解于羧基激活的溶液中，发生活化反应，加入负载着多肽ggg-kkkkkrwrwrw的wang树脂（上海吉尔生化有限公司，653334），待反应结束后，先用洗涤剂洗去未反应的光敏剂，冲洗至洗涤液为无色后再用甲醇洗涤数次，最后干燥得到负载在wang树脂上的抗菌肽-光敏剂共价化合物。

（2）将步骤（1）得到的负载在wang树脂上的抗菌肽-光敏剂共价化合物放入树脂切割液中，常温搅拌，脱去树脂和侧基保护，加入无水乙醚后沉淀离心得到粗产物。使用反相柱在制备的高效液相色谱上进一步纯化粗产物，最终得到修饰肽。

上述步骤（1）中羧基激活的溶液包括n,n’-羰基二咪唑（cdi）、1-羟基苯并三唑(hobt)、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)和o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸（hbtu）中的一种或多种；活化反应温度为10–120℃，优选25–110℃，进一步优选50–100℃，更优选70–90℃，活化反应时间为1–6h，优选2–5h，更优选3–4h。

上述步骤（1）中反应溶剂和洗涤剂为n,n-二甲基甲酰胺（dmf）或者二甲亚砜（dmso）。

上述步骤（1）中搅拌时间为12–36h，优选20–36h，最优选24h。

上述步骤（2）中树脂切割液为体积比85–95%的三氟乙酸（tfa），包括tfa:水=95:5、tfa:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5、tfa:苯甲硫醚:邻甲酚:苯甲醚=9:1:1:1；切割液的用量为1–50ml/g树脂，优选5–25ml/g树脂，最优选10–15ml/g树脂。

上述步骤（2）中切割树脂的时间为1–12h，优选为2–8h，最优选为

2.5–6h。

上述步骤（2）中高效液相色谱的洗脱液为n,n-二甲基甲酰胺（dmf）或者二甲亚砜（dmso）:water在30min内以5ml/min的流速在0.01%tfa中以50%-100%的线性梯度洗脱。

进一步地，将上述修饰肽应用于抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中。

进一步地，将上述修饰肽应用于杀灭抗生素耐药性细菌中。

进一步地，将上述修饰肽应用于制备预防伤口感染或促进伤口的愈合药物中。

进一步地，将上述修饰肽应用于制备治疗局部或全身性细菌感染药物中。

与现有技术相比，本发明的优点是：

（1）本发明的制备方法简便，适合工业化生产，其中光敏剂通过羧基共价连接在抗菌肽上。由于抗菌肽链与光敏剂结构的疏水性，制备得到的修饰肽化合物对细菌有一定的抑制作用；在吸收特定波长的光后，其光动力反应所产生的活性氧可以直接迅速地杀死包括耐药细菌在内的大部分病原菌，大大增强了抗菌肽本身抗菌活性。这种修饰肽能通过抗菌肽组分迅速定位并富集在病原菌细胞膜，再通过抗菌肽-光敏剂的双重抗菌作用快速杀死细菌，抗菌作用谱广泛，有光杀菌，无光抑菌。

（2）由上述制备方法制得的修饰肽，产率高且成分单一，抗菌肽与光敏剂分子的共价连接十分牢固，且具有双重抗菌活性，可用于制备抗菌试剂和抗菌药物等产品。

（3）本发明修饰肽在低浓度下（10µmol/l左右）对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌50%的抑制率；在一定波长(660–685nm)的可见光光照后，所述的修饰肽对革兰氏阳性菌的杀伤率可达到99.999%，对革兰氏阴性菌的杀伤率可达到99.9%，对抗生素耐药性细菌同样有杀灭作用，光照后的杀伤率可达99.999%（附图3）；其以最小抑菌浓度（8.1µmol/l）用于小鼠伤口愈合模型，可以预防伤口感染并促进伤口的愈合。

附图说明

图1是修饰肽系列化合物的示意图；

图2是修饰肽制备路线图；

图3是修饰肽在光照下的抗菌效果统计图；

图4是修饰肽的小鼠伤口愈合实验示意图；

图5是修饰肽的促进伤口愈合效果；（a）为修饰肽与对照组对小鼠伤口感染区域愈合效果图；（b）为修饰肽与对照组对小鼠伤口愈合率的影响；（c）为修饰肽与对照组对小鼠体重的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行详细阐述，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

实施例1：单羧基酞菁锌-抗菌肽共价化合物的制备

1、将β-单羧基取代酞菁锌溶解于n,n-二甲基甲酰胺（dmf）溶剂中，浓度为5–15mmol/l，加入两倍摩尔当量的o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（hbtu）和总体积比0.5%的n,n-二异丙基乙胺（diea），在室温下活化反应0.5h，再加入1.2倍摩尔当量的负载有抗菌肽的wang树脂（上海吉尔生化有限公司，653334），室温下震荡反应24h后，用dmf洗去未反应的β-单羧基取代酞菁锌，干燥得到负载在wang树脂上的酞菁锌-抗菌肽共价化合物固体。

2、按照10–15ml/g固体体积比例配置的树脂切割液（tfa:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5），将第一步得到固体放入切割液中室温搅拌反应4h，将过滤后得到的溶液浓缩，再加入10–20倍体积的无水乙醚，离心沉淀，干燥后得到共价化合物的粗产物。将粗产物溶于n,n-甲基甲酰胺（dmf）溶剂中，使用反相柱在制备的高效液相色谱上进一步纯化，在30min内以5ml/min的流速在0.01%的tfa中以50%-100%的线性梯度洗脱。最终得到单羧基酞菁锌-抗菌肽共价化合物。

3、将不同氨基酸序列的抗菌肽的wang树脂，和β-单羧基取代酞菁锌共价结合，得到一系列酞菁锌-抗菌肽共价化合物（图1，化合物1–5），以供后续筛选。其中znpc(rw)3水溶性很差，在生理环境下很难发挥抗菌效果。

实施例2：修饰肽的抗菌性能

实验菌株分别选用革兰氏阳性的金黄葡萄球菌（s.aurues,atcc6358）、革兰氏阴性的大肠杆菌（e.coli,atcc8739）与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa,atcc33591），具体步骤如下：

（1）将酞菁锌-抗菌肽共价化合物溶解在dmso中作为储备液（1mmol/l），用含1%tween20的pbs溶液将储备液2倍梯度稀释成不同浓度（0.1–100µmol/l），再加入96孔透明板中，每个浓度加三个孔作为平行组，每孔加20μl，另设加相同体积pbs的一组为对照组。

（2）实验组分为两组，分别为光照组和无光组，无光组实验全程避光。

（3）吸取200μl菌液（10⁶cfu/ml）到各孔中，波长670nm、功率600mw的光源照射5min（照射1min，冷却3min，以防止光热效应对实验的影响，重复5次，总光剂量为22.5j/cm²），之后在37℃培养箱中孵育1h，随后使用无菌pbs分别将各组稀释成不同浓度梯度（稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍），取100μl涂抹于预先配置好的细菌培养板中，培养12–24h后，做活菌落计数。

（4）试验重复3次，按下式计算抑菌率：x＝(a–b)/a×100%；式中：x——抑菌率（％）；a——对照样品平均菌落数；b——被试样品平均菌落数。

（5）结果显示了修饰肽系列化合物对两种细菌在光照或无光条件下的半数抑制浓度（ic50），如表1所示。在光照与无光条件下修饰肽对菌株的ic50分别为纳摩尔与微摩尔数量级，并且对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制效果无太大差别。其中，修饰肽znpcg3k5(rw)3（化合物4）表现出最佳的综合抗菌效果。

（6）低浓度的（2μmol/l）修饰肽znpcg3k5(rw)3在光照后对金黄色葡萄球菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀灭率可达到5-log（99.999%），对大肠杆菌的杀灭率也能达到3-log（99.9%），如图3所示，同时证明znpcg3k5(rw)3对抗生素耐药性菌株（mrsa）同样有效果。

表1修饰肽系列化合物的抗菌效果比较

实施例3：修饰肽的促进伤口愈合实验

实验菌株选用革兰氏阳性的金黄葡萄球菌（s.aurues,atcc6358），4周龄的昆明鼠，按照动物保护和使用委员会（iacuc）的建议进行饲养和处理至体重达到25±2g。实验的大体示意图如图4所示，具体步骤如下：

（1）将小鼠分为三组：两组分别在无光与光照条件下，用金黄色葡萄球菌（s.aureus）与znpcg3k5(rw)3先后处理，其中，光照组用znpcg3k5(rw)3和细菌处理后，用680nm波长的光（12.0j/cm²）一次性照射。另一组仅用金黄色葡萄球菌（s.aureus）处理，无光照，每组6只小鼠。在整个实验过程中，所有实验组小鼠可以获得充足的水和食物。

（2）每只小鼠用消毒剪刀在背部表面切取深度为2.0mm，面积10×10mm的伤口，没有明显出血。然后将50μl对数期的金黄色葡萄球菌（10⁸cfu/ml）接种到小鼠的每个伤口上，再加入50μlznpcg3k5(rw)3（终浓度为8.1μmol/l）。每天测量小鼠的伤口面积和体重，持续10天。

（3）实验后第3天，无修饰肽处理的伤口出现轻微感染和溃疡，感染1-2天后痊愈，感染区有明显的结痂。在施加znpcg3k5(rw)3的小鼠中未出现感染症状，并且实验后第二天愈合，说明znpcg3k5(rw)3有预防伤口感染作用且促进愈合的作用，如图5(a)所示（箭头为感染区域）。

（4）如图5(b)所示，相比对照组，znpcg3k5(rw)3处理过的小鼠表现出更快的伤口愈合速度。其中，光照组在实验后的前三天表现出比无光组更强的促进愈合效果，但两者在第三天后趋于一致。结果表明，低剂量的光照在znpcg3k5(rw)3促进伤口愈合治疗中不是必需，但仍然是提高临床疗效的一种额外方法。

（5）znpcg3k5(rw)3对伤口的治疗过程并没有影响小鼠体重的正常增长，如图5(c)所示，表明znpcg3k5(rw)3没有明显的生物毒性。

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<110>福州大学

<120>一种修饰肽的制备及其应用

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