一种N-乙酰神经氨酸的分离提取方法与流程

本发明属于分离纯化技术领域，更具体地，涉及一种n-乙酰神经氨酸的分离提取方法。

背景技术：

唾液酸是燕窝的主要营养成分，是9-碳单糖的衍生物，名字来自于希腊文，其是一种能使唾液产生光滑感觉的负电荷离子。目前认知是神经节苷脂的传递递质，并且是大脑的组成部分，唾液酸可以阻止病菌入侵，婴儿在幼年期唾液酸含量较高，对其身体发育具有重要意义。

唾液酸的生产方法主要以发酵法、酶合成法、天然产物提取法为主。在现有技术中，有公开一种连续分离唾液酸的方法，需要乙醇进行聚唾液酸沉淀，并通过十六烷基吡啶进行初步纯化后酸解，然后进行阴阳离子交换树脂，洗脱液冻干后在乙醇、水、乙酸乙酯三元体系下进行结晶，整个过程分离成本高且收率只有50％左右。另有文献报道，单纯通过膜过滤后浓缩酸化结晶，实验证明该方法，溶液内含有过多杂质，溶液粘度过大，结晶难以完成，且产品纯度低，产品色素含量大，且整体收率小于70％。

由于大肠杆菌的菌体小，且发酵液粘度大，通过常规的离心、膜过滤和板框过滤等方法进行固液分离难度很大，效率也很低，因此，需要开发一种新的方法以提高分离收率、效率和得到产品的纯度。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种n-乙酰神经氨酸的分离提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种n-乙酰神经氨酸的分离提取方法，其包括如下步骤：

(1)将含有聚唾液酸的溶液酸解，得到酸解液，即为含有单体唾液酸(n-乙酰神经氨酸)的溶液；

(2)将步骤(1)得到的酸解液过第一膜，去除菌体等固体杂质，得到第一透过液；将第一透过液过第二膜，去除蛋白等大分子杂质，得到第二透过液；将第二透过液过第三膜，浓缩除一价盐(二价及以上的盐，纳滤膜不能透过)，收集截留液；

(3)将截留液的ph调节到n-乙酰神经氨酸(唾液酸)等电点，再经电渗析除去多价盐，将去除多价盐的溶液通过阴离子交换树脂吸附洗杂、洗脱，收集流出液，浓缩得到浓缩液；

(4)将步骤(3)所得浓缩液的ph调节到1～3，降温，加入反向溶剂，析出粗晶体，离心，洗涤干燥，即得。

步骤(1)中，所述的含有n-乙酰神经氨酸溶液为含有聚唾液酸的发酵溶液；其中，所述的发酵溶液是将大肠杆菌接种到玉米浆、维生素、无机盐和酵母膏等组成的培养基中进行发酵。

步骤(1)中，所述的酸解为ph1.5～3.5(优选1.9～3.0)，65～90℃(优选70～85℃)下酸解4～8h，其能有效规避了菌体与唾液酸的固相分离过程。

其中，所述ph的调节物为磷酸、硫酸和盐酸中的任意一种或几种组合。

步骤(2)中，所述的第一膜为陶瓷膜；陶瓷膜的孔径为50～500nm；所述的第二膜为聚丙烯类超滤膜，其截留分子量为2000～10000da(优选4000～8000da)；所述的第三膜为聚丙烯类纳滤膜，其截留分子量为100～500da(优选150～300da)。

步骤(2)中，在浓缩洗涤的过程中用水进行洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm。

步骤(3)中，调节ph的物质为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等。

步骤(3)中，所述的唾液酸等电点的ph值为2.5～2.8。

步骤(3)中，由于发酵过程加入镁离子、硫酸根离子等二价离子，这些离子不能选择性透过纳滤膜，造成接下来唾液酸不能被离子交换树脂吸附，达不到分离效果，本发明利用电渗析选择性除盐；的电渗析的运行模式为恒流模式；运行电流为0.1～1a；浓缩室和淡化室的体积比1:1；流速控制在40～100ml/min；其规格型号为gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料为钛涂镣电极板，电渗析中膜的材质为苯乙烯；去除多价盐的溶液后的淡化室(含唾液酸)电导率低于2ms/cm。

步骤(3)中，所述的阴离子交换树脂为阴离子交换树脂ad-1，所述的阴离子交换树脂ad-1的骨架是乙烯-二乙烯苯共聚体，其粒径范围为0.315～1.25mm；含水量：40％～45％；有效交换容量：1.35mmol/g。

步骤(3)中，所述的洗杂，其洗杂剂为水；洗杂的流速为1～2bv/h；洗杂的体积为2～8bv；所述的洗脱，其洗脱液为酸溶液或盐溶液；洗脱的流速为1bv/h；洗脱的体积为3～15bv；洗脱至洗脱液中不含有n-乙酰神经氨酸结束洗脱。

其中，所述的酸溶液为盐酸、硫酸、甲酸和醋酸中的任意一种或几种组合；所述的盐溶液为氯化钠水溶液、氯化钾水溶液和氯化镁水溶中的任意一种或几种组合；所述酸溶液和盐溶液的浓度均为0.05～1mol/l；上酸与盐的阴离子基团与阴离子交换树脂的结合能力大于唾液酸与阴离子交换树脂的结合能力。

步骤(3)中，其经过三重膜处理后，除去菌体、大分子化合物以及盐类小分子等化合物，在经过电渗析作用获得电导率小于2ms/cm的唾液酸溶液。

步骤(3)中，当流出液的浓度小于150g/l，可以在中性左右的条件下进行纳滤浓缩、mvr或旋转蒸发浓缩，获得浓缩液，所述的浓缩液中n-乙酰神经氨酸的浓度为150～500g/l(优选250～400g/l)。结晶的推动力是浓度梯度，只有保证一定的初始浓度，才能在不断降温的过程中产生过饱和度，以此来推动晶体的生长，加入丙醇、丙酮或异丙醇后结晶可以在2小时内完成。

步骤(4)中，所述调节ph的物质为盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等。

步骤(4)中，所述的降温为降温至20～35℃

步骤(4)中，所述的反向溶剂为丙酮、丙醇和异丙醇中的任意一种或几种组合；反向溶剂与调节ph后浓缩液的体积比为0.8～2：1。

优选地，在加入反应溶剂的同时可以加入晶种，并进一步荣光搅拌+梯度降温的方式将温度缓慢降下来，具体为将调节ph后浓缩液的温度降到20～35℃，加入晶种和反向溶剂，50～800rpm的转速下不断搅拌0.5h进行晶型转换，获得晶核，然后在1.5h内将温度降低到0～10度(优选2～5℃)，优选2～5度，晶核不断生长为晶体。

优选地，为提高晶体的纯度，减少结晶母液内杂质的影响，在0～8℃的低温条件下用浓度为20％～100％的乙醇水溶液对晶体进行洗涤，离心或抽滤收集晶体。

步骤(4)中，收集晶体的方式为离心收集粗晶体，所述离心的速度为4000～10000rpm(优选3000～7000rpm)，离心的时间为10～30min。

步骤(4)中，所述的干燥为鼓风干燥或真空干燥，干燥温度为40～100℃，优选50～80℃，干燥时间为2～8h。

其中，所述的真空干燥，其真空度为0～200mbar，优选10～100mbar。

通过上述方法制备提取到的提取得到的n-乙酰神经氨酸，其纯度≥99％，收率≥90％。

本发明创新采用发酵液直接酸解，并采用三套膜系统进行粗分离去除菌体和大分子杂质，经电渗析除多价盐后，并通过实验室合成的ad-1阴离子交换树脂进行一步法精细化色谱分离，洗脱液经浓缩后，加入反溶剂，降温结晶，晶体经洗涤干燥后获得。整个分离收率在90％以上和纯度高高于99％，优于现有技术的收率小于70％，纯度97％，且本发明过程简单易操作，分离成本低。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)本发明的唾液酸，采用直接酸解法，省去了唾液酸发酵液的固液分离流程。

(2)本发明的唾液酸分离，分离获得的唾液酸收率90％以上，远高于现有唾液酸分离技术。

(3)本发明首创电渗析与离子交换的结合，并应用于唾液酸的分离，令阴离子交换树脂吸附量提高了10倍以上，减少了10倍的树脂用量，间接节省了酸碱用量和操作时间。

(4)通过反溶剂的加入，可以令结晶过程缩短到2h以内完成获得含有两个结晶水的亮白色晶体，一次结晶收率大于90％，同时晶体的纯度大于99％，产品质量高于现有技术(现有技术生产的唾液酸为淡黄色粉末的非晶体形态，不含结晶水，纯度在97％左右)。

附图说明

图1为唾液酸结晶产品。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1)含有聚唾液酸的发酵液(聚酸解液(8.1g/l))2000ml使用磷酸将ph调至1.5在65℃下进行酸解3h，得到酸解液2050ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.9g/l；酸解液中除唾液酸外，其成分主要为糖、核酸、盐、色素、氨基酸、蛋白、有机酸等。

其中，所述的含有唾液酸的发酵液为大肠杆菌对葡萄糖，玉米浆，维生素，无机盐，酵母膏等进行转化，形成聚唾液酸。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经2000da的超滤膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用甲酸调节ph到2.7后通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.6a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：60ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂3倍床层体积，然后用0.1mol/l的氯化钠溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：10bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为350g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断100rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h，即得14.72g唾液酸晶体。

干燥后的晶体纯度为99.2％，收率为90.2％。

对比例1：不通过ad-1阴离子交换树脂

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚酸解液(8.1g/l))2000ml使用磷酸将ph调至1.5在65℃下进行酸解3h，得到酸解液2050ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.9g/l；

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经2000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用甲酸调节ph到2.7通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.6a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：60ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，不通过ad-1阴离子交换树脂。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为350g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断100rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体29.7g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为49.2％，收率为90.2％。

对比例2：不通过电渗析

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚酸解液8.1g/l)2000ml使用磷酸将ph调至1.5在65℃下进行酸解3h，得到酸解液2050ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.9g/l。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经2000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用甲酸调节ph到2.7，不通过电渗析，直接通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂3倍床层体积，然后用0.1mol/l的氯化钠溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：10bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为350g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断100rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体6.08g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为99.2％，收率为37.2％。

对比例3

1)将含有聚唾液酸(聚酸解液(8.1g/l))的发酵液2000ml，首先离心去除固含物，然后使用磷酸将ph调至1.5在65℃下进行酸解3h，得到酸解液2050ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为6.5g/l；

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集第一透过液和第一洗涤液。

3)将步骤2)的第一透过液和第一洗涤液经然后经2000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液

4)将步骤3)的第二透过液和第二洗涤液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用甲酸调节ph到2.7通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.6a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：60ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂3倍床层体积，然后用0.1mol/l的氯化钠溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：10bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为350g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断100rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体11.37g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为99.2％，收率为69.6％。

对比例4

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚酸解液(8.1g/l)

2))2000ml使用磷酸将ph调至1.5在65℃下进行酸解3h，得到酸解液2050ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.9g/l。

其中，所述的含有唾液酸的发酵液为大肠杆菌对葡萄糖，玉米浆，维生素，无机盐，酵母膏等进行转化，形成聚唾液酸。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经2000da的超滤膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用甲酸调节ph到2.7后通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.6a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：60ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过2000gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂3倍床层体积，然后用0.1mol/l的氯化钠溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：10bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为350g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断100rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h，即得14.72g唾液酸晶体。

干燥后的晶体纯度为99.2％，收率为90.2％。

实施例2

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚唾液酸解液8.1g/l)2000ml使用磷酸将ph调至2.5在80℃下进行酸解5h，得到酸解液2040ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.94g/l。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经5000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用硫酸调节ph到2.6通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：1a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：100ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1.5bv/h的流速用去离子水洗杂6倍床层体积，然后用0.2mol/l的甲酸溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h；洗脱浓度为：0.2mol/l，洗脱体积：5bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为400g/l，用甲酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，300rpm不断搅拌1h，将温度缓慢降温到4℃，析出晶体。

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体14.72g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为99.02％，收率为90.07％。

实施例3

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚唾液酸解液8.1g/l)2000ml使用磷酸将ph调至2.0在85℃下进行酸解3.5h，得到酸解液2049ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.9g/l。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的陶瓷膜透过液经然后经4000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液即可。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经200da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用磷酸调节ph到2.8通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.6a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：120ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂5倍床层体积，然后用0.5mol/l的乙酸溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：7bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为280g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断以350rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体。

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体14.80g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为99.1％，收率为90.6％。

实施例4

1)将含有聚唾液酸的发酵液(聚唾液酸解液8.1g/l)2000ml使用硫酸将ph调至3.0在90℃下进行酸解3.5h，得到酸解液2052ml；其中酸解液中唾液酸的浓度为7.89g/l。

2)将步骤1)的酸解液经50nm的陶瓷膜，收集透过液，并用自来水洗涤截留液，直到截留液内不含有唾液酸，收集陶瓷膜透过液。

3)将步骤2)的收集陶瓷膜透过液经10000da的膜，去除蛋白、核酸等大分子杂质，并不断洗涤截留液至不含唾液酸为止，收集超滤膜透过液。

4)将步骤3)的超滤膜透过液经100da的膜浓缩除盐，并用去离子水不断洗涤，直至透过液的电导率小于500us/cm，收集截留液。

5)将步骤4)的截留液用盐酸调节ph在2.5，通过电渗析(规格型号：gjbmed-90*210-5，单张膜有效膜面积：90*210mm²，膜堆重复单元20，膜堆构型c-a-c电极材料：钛涂镣电极板，运行模式：恒流模式；运行电流：0.1a；浓缩室和淡化室采用1:1的体积比；流速：40ml/min)除盐后，唾液酸电导率小于2ms/cm，再通过200gad-1阴离子交换树脂后，以1bv/h的流速用去离子水洗杂3倍床层体积，然后用0.5mol/l的乙酸溶液进行洗脱(洗脱流速：1bv/h，洗脱体积：7bv，到洗脱液体点样不含唾液酸)，收集洗脱液。

6)将步骤5)的洗脱液浓缩得到唾液酸浓度为250g/l，用盐酸将ph调节到1，降温到20℃，加入晶种和0.8倍体积丙酮，不断以350rpm搅拌1h，将温度缓慢降温到1℃，析出晶体；

7)将步骤6)晶体抽滤，去除母液，并加入20vt％的乙醇水溶液进行洗涤两次，抽滤获得晶体15.15g。

8)将步骤7)的晶体放到40℃真空干燥箱，10mbar下干燥24h。

干燥后的晶体纯度为99.1％，收率为92.7％。

本发明提供了一种n-乙酰神经氨酸的分离提取方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。