一种ATAC-seq测序文库的构建方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种atac-seq测序文库的构建方法。
背景技术：
：众所周知，大多数基因组中的染色质是紧密盘绕在细胞核内的，仅有一小部分区域比较松散，这部分无核小体的裸露dna区域称为开放染色质(openchromatin)，dna复制和基因转录往往在这些区域发生。atac-seq(assayfortransposase-accessiblechromatinwithhigh-throughputsequencing，染色质易开放区测序)是利用tn5转座酶切割染色质开放区，并加上测序引物进行高通量测序，通过生物信息分析鉴定转录因子结合位点和核小体区域位置，从而为研究基因调控、dna印记等提供有效的方法。获得处于开放状态的dna序列可用于研究基因表达的调控机制，是表观遗传学研究的热点，atac-seq则是这类研究的最佳利器。目前，大多数atac-seq测序实验对细胞起始量有一定的要求，一般要求的起始量都是50000个细胞，但是不同生物50000个细胞所含有的dna量不尽相同，这就需要对提取的细胞核进行染色并用荧光显微镜进行定量。常用的细胞核染色剂dapi具有致癌性，且荧光显微镜价格昂贵，不是每个实验室都具有的。用荧光显微镜进行计数，对于样本量大的，需要耗费大量的人力成本和时间。中国专利申请cn109897885a公开了一种适用于细胞系和动物组织atac-seq测序技术的文库构建方法，该方法适用于细胞系和动物组织，可以直接通过dna含量进行定量操作，然而，这种方法制得的atac-seq文库仅适用于dna量在100ng-1000ng的条件，且这种方法不适用于植物组织。综上所述，样本量较大时，现有技术中普遍存在耗费大量的人力成本和时间，适用范围窄，对dna质量要求高的缺点。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中普遍存在的缺点，提供一种atac-seq测序文库的构建方法。本发明提供的atac-seq测序文库操作方法简单，适用范围广泛，对细胞样本和动物、植物组织样本均适用，且对dna量无要求。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种atac-seq测序文库的构建方法，包括如下步骤：s1、细胞裂解提取细胞核；s2、转座反应及纯化；s3、pcr富集及纯化；s4、文库质检及上机。优选地，步骤s1中所述细胞裂解细胞核的提取过程为：对于细胞样本，复苏解冻细胞，进行细胞裂解提取细胞核；对于动物、植物组织样本，制备细胞悬液并进行细胞裂解提取细胞核。优选地，步骤s1所述细胞裂解细胞核的具体过程为：对于细胞样本，要将样品置于37℃水浴中进行复苏解冻，500rpm，4℃，离心5min，置冰上，小心吸弃上清，接着加裂解液重悬细胞，500rpm，4℃，离心5min；对于动物、植物组织样本，则取约30-50mg组织液氮下研磨成粉末，置于2mlep管中，迅速加入重悬液，充分重悬粉末，冰上孵育10min；40um细胞筛过滤，吸取滤液1-1.5ml于新的无菌2mlep管中，500rpm，4℃，离心5min，弃上清保留沉淀；重悬沉淀，加碘克沙醇溶液混匀，摆动式离心机1000rpm，4℃，离心20min，弃上清，再加入重悬液，轻轻吹吸混匀即可。优选地，步骤s2中的转座反应的具体操作为：将步骤s1提取的细胞核加入到包含5×ttbl10μl，ttemixv505μl，ddh2o35μl的转座反应体系中，置于pcr仪中，37℃条件下反应30min。优选地，步骤s2中的纯化过程为：加入50μl的dna进行beads纯化，接着用新鲜配制的体积分数为80％的乙醇溶液洗涤2次，最后用ddh2o洗脱。优选地，步骤s3所述的pcr富集的具体操作为：以步骤s2纯化的dna产物为模板，配制50μl的反应体系：5×tab10μl，ppm5μl，n5xx5μl，n7xx5μl，tae1μl，24μl纯化的dna，混匀，按照以下步骤进行扩增：首先，72℃延伸3min，98℃变性30s，接着按照以下参数扩增15个循环：98℃15s，60℃30s，72℃3min；最后，72℃延伸5min，4℃hold。优选地，步骤s3中的纯化是将pcr扩增得到的产物加入磁珠进行0.55x、1x两次分选得到目的大小dna。本发明所述的atac-seq测序文库可以应用于细胞系、动物组织及植物组织。本发明提供的一种适用于细胞、动物、植物组织atac-seq测序的文库构建方法，涉及分子生物学
技术领域：
，本方法针对细胞及动物、植物组织样本，进行了细胞裂解及细胞核提取、转座反应及纯化、pcr富集及纯化、文库质检及上机，得到满足要求的测序片段进行高通量测序，可以全面获得全基因组染色质开放程度，得到全基因组范围内蛋白质可能结合的位点信息。与现有技术相比，本发明提供的atac-seq测序文库具有如下优点：(1)该方法操作简单方便，前期处理不需要对细胞或者动物、植物组织进行精确称量，采用是转座反应，所需的细胞数量少且处理样本通量高；(2)该方法在对于动物、植物组织样本时，使用碘克沙醇溶液从组织样本中分离纯化得到动、植物细胞核，提高分离效率和细胞核纯度，且对人体无毒害；(3)该方法在pcr扩增后采用的是两次磁珠分选纯化，这样纯化效率更高，自动化程度更好，省时省力，分选出所需的dna片段的长度范围更精确，为文库构建成功奠定了基础；(4)该方法适用范围广泛，对细胞样本和动物、植物组织样本均适用。附图说明图1为通过本发明的方法获得的细胞样本dna的文库质检图；图2为通过本发明的方法获得的动物或植物组织样本dna的文库质检图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。实施例1细胞样本atac-seq测序的文库构建方法所述细胞样本atac-seq测序的文库构建方法，包括如下步骤：s1、细胞裂解提取细胞核：(1)细胞解冻复苏：将样品置入37℃水浴锅中轻轻晃动，让细胞快速融解；(2)500rpm，4℃，离心5min，置冰上，小心吸弃上清；(3)加入裂解液重悬细胞，500rpm，4℃，离心5min，即得细胞核沉淀；所述裂解液由10mmtris-cl，ph7.4；10mmnacl；3mmmgcl2；0.1％(v/v)igepalca-630组成。s2、转座反应及纯化：转座反应：配制50μl的反应体系：5×ttbl10μl，ttemixv505μl，ddh2o35μl，然后置于pcr仪中，于37℃的条件下反应30min，得无核酸酶水；纯化：加入100μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸弃上清，用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤磁珠2次，待磁珠晾干，加入26μl的无核酸酶水，混匀，室温静置5min，上架5min，吸取24μl，待用。s3、pcr富集及纯化：pcr富集：配制50μl的pcr体系如下表1所示。表1pcr富集体系配制组分体积s2所得无核酸酶水24μl5×tab10μlppm5μln5xx5μln7xx5μltae1μltotal50μl置于pcr仪中进行反应，反应条件为：72℃3min，98℃30s，(98℃15s，60℃30s，72℃3min)15个循环，72℃5min，4℃保存。纯化过程：加入27.5μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸取上清72ul加入到新的无菌ep管中，加入50μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸弃上清，用80％乙醇洗涤磁珠2次，待磁珠晾干，加入17μl的无核酸酶水，混匀，室温静置5min，上架5min，吸取15μl，待用。s4、文库质检及上机：使用agilent2100生物分析仪进行文库质检，结果如图1所示，文库片段大小范围200-700bp，主峰约200bp、500bp、700bp，呈锯齿峰形状。实施例2植物或动物组织atac-seq测序的文库构建方法所述植物或动物组织atac-seq测序的文库构建方法，包括如下步骤：s1、细胞裂解提取细胞核：(1)取约30-50mg组织液氮下研磨成粉末，置于2mlep管；(2)迅速加入重悬液，充分重悬粉末，冰上孵育10min；(3)40μm细胞筛过滤步骤2的样品，吸取滤液约1ml于新的无菌2mlep管中；(4)1000rpm，4℃，离心5min，小心弃上清，保留沉淀；(5)加入pbs作为重悬液，小心重悬沉淀；(6)加入碘克沙醇溶液，吹吸混匀；(7)摆动式离心机，10000rpm，4℃，离心20min；(8)弃上清，留下层液体；(9)加入重悬液，轻轻吹吸混匀，即得细胞核沉淀。s2、转座反应及纯化：转座反应：配制50μl的反应体系：5×ttbl10μl，ttemixv505μl，ddh2o35μl，然后置于pcr仪中，于37℃的条件下反应30min，得无核酸酶水；纯化过程：加入100μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸弃上清，用体积分数为80％的乙醇溶液洗涤磁珠2次，待磁珠晾干，加入26μl的无核酸酶水，混匀，室温静置5min，上架5min，吸取24μl，待用。s3、pcr富集与纯化pcr富集过程：配制50μl的pcr体系如下表1所示。表1pcr富集体系配制置于pcr仪中进行反应，反应条件为：72℃3min，98℃30s，(98℃15s，60℃30s，72℃3min)15循环，72℃5min，4℃保存。纯化过程：加入27.5μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸取上清72ul加入到新的无菌ep管中，加入50μldnabeads，混匀，室温静置5min，上磁力架，静置5min，小心吸弃上清，用80％乙醇洗涤磁珠2次，待磁珠晾干，加入17μl的无核酸酶水，混匀，室温静置5min，上架5min，吸取15μl，待用。s4、文库质检及上机：使用agilent2100生物分析仪进行文库质检，结果如图2所示，文库片段大小范围200-700bp，主峰约200bp、500bp、700bp，呈锯齿峰形状。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12