强化ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用与流程

本发明属于基因工程菌改造
技术领域：
，尤其是一种强化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用。
背景技术：
：杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其组成氨基酸包括鸟氨酸（orn），d-苯丙氨酸（d-phe），异亮组氨酸（his）,d-天冬氨酸（d-asp）,天冬酰胺（asn）、赖氨酸（lys）,d-谷氨酸（d-glu），半胱氨酸（cys），亮氨酸（leu），异亮氨酸（ile）和缬氨酸（val）11种氨基酸。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，有效抑制革兰氏阳性菌如梭状芽胞杆菌属的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；另外，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄较迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。ppc为一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其在生物体的中心碳代谢中发挥着作用，然而，目前的研究并没有解析出ppc的具体功能。并且，地衣芽胞杆菌自身并无ppc的转录基因—ppc基因。因此，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶ppc在地衣芽胞杆菌中是否会发挥功能并影响杆菌肽合成并不清楚。再加上，细胞内的中心碳代谢、氨基酸代谢具有严格且复杂的调控机制。因此，通过改造ppc基因是否会影响地衣芽胞杆菌中杆菌肽的产量以及ppc的表达水平与杆菌肽产量之间的关系均是不可预知的。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种强化磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc表达的地衣芽胞杆菌（bacilluslicheniformis）的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内插入磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，达到了提高杆菌肽产量的目的。一种强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：（1）以谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组为模板，pcr扩增出ppc基因片段，再在ppc基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的ppc表达元件；（2）同时，以地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna为模板，pcr扩增出ppc基因插入位点的上游同源臂和下游同源臂；（3）将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：插入位点的上游同源臂-ppc表达元件-插入位点的下游同源臂；（4）准备整合型质粒载体，并根据整合型质粒载体上的酶切位点选择能够对该整合型质粒载体进行双酶切的限制性内切酶，再采用该限制性内切酶分别对整合型质粒载体和步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到线性质粒片段和酶切基因片段；（5）将步骤（4）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经dna连接酶进行连接，得到整合质粒；（6）将步骤（5）得到的整合质粒转入地衣芽胞杆菌dw2中，并采用含有筛选标记的培养基进行筛选得到阳性转化子，并对阳性转化子抽质粒进行菌落pcr验证，将验证成功的阳性转化子进行转接培养数次后再次进行菌落pcr检测，得到插入位点的上游同源臂或插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（7）挑选插入位点的上游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株与插入位点的下游同源臂与地衣芽胞杆菌dw2基因组dna产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于30~37℃、不含有筛选标记的培养基中经过数次转接培养，再经pcr法筛选得到整合了ppc基因的地衣芽胞杆菌dw2-ppc（简称：bacilluslicheniformisdw2-ppc）；其中，所述的地衣芽胞杆菌dw2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2011344；所述谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组中的ppc基因序列如sequencelisting中所示。优选的，步骤（1）中启动子选用p43启动子，p43启动子是芽胞杆菌通用的强启动子，普适性较强。在具体实施过程中，所述p43启动子通常通过以枯草芽胞杆菌基因组为模板经pcr扩增得到。优选的，步骤（1）中终止子选用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子为菌种基因改造领域比较通用的终止子。进一步的，所述淀粉酶终止子采用以地衣芽胞杆菌dw2基因组为模板经pcr扩增得到的淀粉酶终止子，此时无需另行购买淀粉酶终止子的来源菌株。优选的，步骤（3）中通过重叠延伸pcr将插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和插入位点的下游同源臂连接到一起。相对于多步酶切酶连的方法相比，具有效率高、速度快、方法简单的优点。优选的，步骤（4）中整合型质粒载体选用t2(2)-ori，采用xbai和noti限制性内切酶对整合型质粒载体和目的基因片段进行双酶切，步骤（6）中将整合质粒转入地衣芽胞杆菌dw2中后，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并将验证成功的阳性转化子在40~45℃条件下转接培养数次后，进行菌落pcr检测，得到阳性单交换结合子菌株。t2(2)-ori为本申请人所在研究课题组已有的质粒载体，该质粒载体为常用的基因敲除/插入载体，容易获得，并且该质粒为温敏性质粒，易于筛选；当选用t2(2)-ori时，通过对该整合型质粒载体的基因组进行分析可知：其上存在xbai和noti限制性内切酶切位点，进而确定双酶切步骤采用xbai和noti限制性内切酶；与此同时，t2(2)-ori质粒载体的基因组中还含有卡那青霉素抗性基因，因此，在步骤（7）中可采用卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并且，t2(2)-ori质粒载体适宜在40~45℃条件生长，因此，将验证成功的阳性转化子在40~45℃条件下进行转接培养，以得到阳性单交换结合子菌株。本发明人首次尝试构建强化ppc基因表达的地衣芽胞杆菌dw2-ppc，与地衣芽胞杆菌dw2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌dw2–ppc的杆菌肽产量提高了12%以上。本发明的研究结果表明：强化表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。本发明的目的之二在于提供根据上述的强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2-ppc。本发明的目的之三在于提供地衣芽胞杆菌dw2-ppc在杆菌肽生产中的应用，所述地衣芽胞杆菌dw2-ppc为根据上述的强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2-ppc。进一步的，所述应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：6-10g/l蛋白胨，2-6g/l酵母浸出粉，6-10g/l氯化钠，ph7.0~7.2；生产发酵的培养基配方为：60-100g/l豆粕；15-40g/l玉米淀粉；4-8g/lcaco3和0.5-2g/l(nh4)2so4。附图说明图1为实施例1~14的步骤（1）中得到的ppc基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为ppc基因片段；图2为实施例1~14的步骤（3）中得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为目的基因片段；图3为实施例1~14的步骤（5）中得到的阳性转化子进行菌落pcr验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道m为dnamarker，泳道1为菌落pcr验证条带；其中，上述dnamarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式现根据附图具体阐述本发明的实施方式：一种强化ppc表达的地衣芽胞杆菌的构建方法的具体操作步骤为：1、步骤（1）的具体操作步骤为：根据谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna序列中的ppc基因的基因序列，设计ppc基因的上游引物（ppc-f）和下游引物（ppc-r）；并以谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组dna为模板，分别以ppc基因的上游引物、下游引物进行pcr扩增得到ppc基因片段（2760bp，如图1所示）；其中，ppc-f和ppc-r的序列为：ppc-f：taagagaggaatgtacacatgactgattttttacgcgatga、ppc-r：tccgtcctctctgctcttctagccggagttgcgcagcgca；再以枯草芽胞杆菌168的基因组dna经pcr扩增得到p43启动子（所用引物为p43-f和p43-r），同时以地衣芽胞杆菌dw2基因组dna为模板经pcr扩增得到淀粉酶终止子（所用引物为tamyl-f和tamyl-r），随后将p43启动子、ppc基因片段和淀粉酶终止子通过重叠延伸pcr（简称“soe-pcr”）连到一起（所用引物为p43-f和tamyl-r），得到ppc基因片段上游连接有p43启动子、同时下游连接有淀粉酶终止子的基因片段，此基因片段即为完整的ppc表达元件（3561bp）；其中，p43-f、p43-r、tamyl-f、tamyl-r的序列为：p43-f：gacagcagcccgcaagttttctgaaccgtctggatg、p43-r：ttctgcatgtctttctccatgtgtacattcctctcttacct、tamyl-f：cggccaaacgtccgcttcttaaaagagcagagaggacggatt、tamyl-r：gcacatcggtcagaacagaataatcgtattccacgctttc；2、步骤（2）的具体操作步骤为：根据地衣芽胞杆菌dw2中用于ppc插入位点的基因，设计ppc基因插入位点的上、下游序列，及其上游同源臂引物（a-f和a-r）、下游同源臂引物（b-f和b-r）；并以地衣芽胞杆菌dw2的基因组dna为模板，分别以既定整合位点上游同源臂引物、下游同源臂引物进行pcr扩增得到ppc基因既定整合位点的上游同源臂（584bp）和下游同源臂（536bp）；其中，a-f、a-r、b-f、b-r的序列为：a-f：cgggatcccagacactttttcaaggatgagcgg、a-r：catccagacggttcagaaaacttgcgggctgctgtc、b-f：gaaagcgtggaatacgattattctgttctgaccgatgtgc、b-r：gctctagatgtccaatcggtctcagcagccttt；3、步骤（3）的具体操作步骤为：通过重叠延伸pcr将ppc基因插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和ppc基因插入位点的下游同源臂连接到一起（所用引物为a-f和b-r），构成目的基因片段（4681bp），该目的基因片段的排列顺序为：插入位点的上游同源臂-ppc表达元件-插入位点的下游同源臂；其中，ppc基因插入位点的上游同源臂、ppc表达元件和ppc基因插入位点的下游同源臂连接到一起也可采用现有的多步酶切酶连法进行。4、步骤（4）的具体操作步骤为：准备质粒t2(2)-ori，采用xbai和noti限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段（4679bp）；同时，也采用xbai和noti限制性内切酶对质粒t2(2)-ori（其中，质粒t2(2)-ori的构建方法为：将来自pe194质粒的194-ori、来自于pdg780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pbluescriptiisk(+)-x52328的puc-ori通过pcr反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，puc-ori的顺序连接。此构建方法参考下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报［j］，第7期第3卷，224-229页和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报［j］，第18期第4卷:438-441页）进行双酶切得到线性质粒片段（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶xbai和noti限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；5、步骤（5）的具体操作步骤为：将步骤（4）得到的酶切基因片段和线性质粒片段经dna连接酶（市售的dna连接酶均可，通常为t4dna连接酶）进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌dh5α，在30-37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基（常用的细菌性培养基均可，通常为lb培养基）进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r）。若转化子的pcr验证结果为：在4968bp处出现电泳条带（如图3所示)，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：整合表达载体t2(2)-ppc）；6、步骤（6）的具体操作步骤为：将整合表达载体t2(2)-ppc电转化至地衣芽胞杆菌dw2中，在30-37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落pcr验证（所用引物为：t2-f和t2-r）。若转化子的pcr验证结果为：在4968bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体t2(2)-ppc成功转入地衣芽胞杆菌dw2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了整合表达载体t2(2)-ppc的地衣芽胞杆菌dw2）。接着，将得到的阳性转化子在40-45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以t2-f和ppc-kyr为引物（或以t2-r与ppc-kyf为引物）进行菌落pcr检测单交换菌株，扩增出3848bp或6088bp长度的条带，即证明为单交换菌株；其中，ppc-kyf和ppc-kyr的序列为:ppc-kyf：agcttcaatgctacccaagcagc、ppc-kyr：gccttgtctgaaatacatata；7、步骤（7）的具体操作步骤为：将步骤（6）得到的pcr检测出现3848bp条带的单交换菌株和步骤（6）得到的pcr检测出现6088bp条带的单交换菌株混合接种培养，在30-37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落pcr验证（引物为ppc-kyf和ppc-kyr）。若转化子的pcr验证结果为：在1444bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌dw2；在4976bp处出现电泳条带时，说明ppc基因成功整合到地衣芽胞杆菌dw2的基因组上，该转化子为阳性转化子。本发明的转化子的菌落pcr验证结果为：在4976bp处出现电泳条带，证明该转化子为阳性转化子（如图3所示）。随后针对阳性转化子进行dna测序进一步验证，得到双交换成功的ppc整合菌株（即地衣芽胞杆菌dw2-ppc）；上述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc公布于美国国立生物技术信息中心—ncbi的基因库中；所述的地衣芽胞杆菌dw2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2011344；所述的谷氨酸棒杆菌atcc13032基因组中的ppc基因序列如sequencelisting中所示；其中，本发明的实施例1中所用到的谷氨酸棒杆菌atcc13032，其保藏于美国模式培养物集存库（简称“atcc”）、保藏编号为13032。本发明还保护根据上述强化ppc表达的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2-ppc。本发明人还保护该地衣芽胞杆菌dw2-ppc在杆菌肽生产中的应用。进一步的，所述应用步骤包括：a种子发酵，b生产发酵，其中种子发酵的培养基配方为：6-10g/l蛋白胨，2-6g/l酵母浸出粉，6-10g/l氯化钠，ph7.0~7.2；生产发酵的培养基配方为：60-100g/l豆粕；15-40g/l玉米淀粉；4-8g/lcaco3和0.5-2g/l(nh4)2so4。本发明人根据上述地衣芽胞杆菌dw2-ppc在抗菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。表1其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的地衣芽胞杆菌dw2-ppc菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mllb培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基（实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基（即液体培养基）的配方的基础上加琼脂15~18g/l即可）后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500ml三角瓶中装入25～150ml的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。本发明人采用高效液相色谱(hplc)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用agilent1200液相色谱仪检测；色谱柱为hypersilbdsc18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为a:b＝35:65(a相：100mlph6.0磷酸盐缓冲液到300ml水中混合均匀；b相：520ml甲醇与40ml乙腈混合均匀)；流速：1.0ml/min；柱温30°c；紫外检测器波长：254nm；进样量20μl。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。表2从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌dw2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌dw2-ppc的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高12%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。本申请人还进行了实施例15和实施例16，实施例15和实施例16的具体实施方案如下：实施例15实施例15与实施例14的不同之处在于：在步骤（1）中以枯草芽胞杆菌基因组dna经pcr扩增得到pppc启动子，同时以地衣芽胞杆菌dw2基因组dna为模板经pcr扩增得到淀粉酶终止子，随后将pppc启动子、ppc基因片段和淀粉酶终止子通过重叠延伸pcr连到一起，得到ppc基因片段上游连接有pppc启动子、同时下游连接有淀粉酶终止子的基因片段，即为完整的ppc表达元件，其余步骤均与实施例14相同，最终得到双交换成功ppc整合菌株，命名为：地衣芽胞杆菌dw2-ppc-1；实施例16实施例16与实施例14的不同之处在于：在步骤（1）中以枯草芽胞杆菌基因组dna经pcr扩增得到p43启动子，同时以枯草芽胞杆菌基因组dna经pcr扩增得到tppc终止子，随后将p43启动子、ppc基因片段和tppc终止子通过重叠延伸pcr连到一起，得到ppc基因片段上游连接有p43启动子、同时下游连接有tppc终止子的基因片段，即为完整的ppc表达元件，其余步骤均与实施例14相同，最终得到双交换成功ppc整合菌株，命名为：地衣芽胞杆菌dw2-ppc-2。实施例15和实施例16所构建得到的地衣芽胞杆菌dw2-ppc-1、地衣芽胞杆菌dw2-ppc-2分别进行种子、生产培养后发酵液中杆菌肽效价测试数据如下表3所示。表3菌株杆菌肽效价与地衣芽胞杆菌dw2相比，dw2-ppc杆菌肽产量的提高百分比（%）实施例15dw2-ppc-1908.4311.98实施例16dw2-ppc-2910.1812.19另外，本发明的启动子并不限于实施例1中的p43启动子和实施例15中的pppc启动子，其也可以为其他常见的、在本发明中能够成功启动转录的启动子，例如：pylb、pykza、pgsib等。同时，本发明的淀粉酶终止子也不限于上述实施例1中的淀粉酶终止子和实施例16中的tppc终止子，其也可以其他常见的、在本发明中能够成功终止转录的终止子均可。本发明的淀粉酶终止子的来源菌株除了地衣芽孢杆菌dw2外，也可以为地衣芽胞杆菌14580、9945a、wx-0等。本发明的双酶切所用的内切酶也不限于上述具体实施例中的xbai和noti两种限制性内切酶的组合，其也可以采用其他内切酶，这主要是由整合型质粒载体本身所具有的酶切位点决定的，需要根据整合型质粒载体进行基因序列分析后确定。双酶切所用内切酶的确定属于现有基因敲除/插入技术中的常规技术。本发明的整合型质粒载体也并不限于上述具体实施例中的t2(2)-ori，t2(2)-ori质粒载体为本申请人所在研究课题组已有的质粒载体，该质粒载体为常用的基因敲除/插入载体，容易获得；但是，本发明也可以是其他常用的基因敲除/插入的整合型质粒载体均可，例如：pax01等。序列表<110>绿康生化股份有限公司<120>强化ppc表达的地衣芽胞杆菌及制备方法和应用<130>ds-p20065<141>2020-02-27<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2760<212>dna<213>谷氨酸棒杆菌atcc13032(corynebacteriumglutamicum)<400>1atgactgattttttacgcgatgacatcaggttcctcggtcaaatcctcggtgaggtaatt60gcggaacaagaaggccaggaggtttatgaactggtcgaacaagcgcgcctgacttctttt120gatatcgccaagggcaacgccgaaatggatagcctggttcaggttttcgacggcattact180ccagccaaggcaacaccgattgctcgcgcattttcccacttcgctctgctggctaacctg240gcggaagacctctacgatgaagagcttcgtgaacaggctctcgatgcaggcgacacccct300ccggacagcactcttgatgccacctggctgaaactcaatgagggcaatgttggcgcagaa360gctgtggccgatgtgctgcgcaatgctgaggtggcgccggttctgactgcgcacccaact420gagactcgccgccgcactgtttttgatgcgcaaaagtggatcaccacccacatgcgtgaa480cgccacgctttgcagtctgcggagcctaccgctcgtacgcaaagcaagttggatgagatc540gagaagaacatccgccgtcgcatcaccattttgtggcagaccgcgttgattcgtgtggcc600cgcccacgtatcgaggacgagatcgaagtagggctgcgctactacaagctgagccttttg660gaagagattccacgtatcaaccgtgatgtggctgttgagcttcgtgagcgtttcggcgag720ggtgttcctttgaagcccgtggtcaagccaggttcctggattggtggagaccacgacggt780aacccttatgtcaccgcggaaacagttgagtattccactcaccgcgctgcggaaaccgtg840ctcaagtactatgcacgccagctgcattccctcgagcatgagctcagcctgtcggaccgc900atgaataaggtcaccccgcagctgcttgcgctggcagatgcagggcacaacgacgtgcca960agccgcgtggatgagccttatcgacgcgccgtccatggcgttcgcggacgtatcctcgcg1020acgacggccgagctgatcggcgaggacgccgttgagggcgtgtggttcaaggtctttact1080ccatacgcatctccggaagaattcttaaacgatgcgttgaccattgatcattctctgcgt1140gaatccaaggacgttctcattgccgatgatcgtttgtctgtgctgatttctgccatcgag1200agctttggattcaacctttacgcactggatctgcgccaaaactccgaaagctacgaggac1260gtcctcaccgagcttttcgaacgcgcccaagtcaccgcaaactaccgcgagctgtctgaa1320gcagagaagcttgaggtgctgctgaaggaactgcgcagccctcgtccgctgatcccgcac1380ggttcagatgaatacagcgaggtcaccgaccgcgagctcggcatcttccgcaccgcgtcg1440gaggctgttaagaaattcgggccacggatggtgcctcactgcatcatctccatggcatca1500tcggtcaccgatgtgctcgagccgatggtgttgctcaaggaattcggactcatcgcagcc1560aacggcgacaacccacgcggcaccgtcgatgtcatcccactgttcgaaaccatcgaagat1620ctccaggccggcgccggaatcctcgacgaactgtggaaaattgatctctaccgcaactac1680ctcctgcagcgcgacaacgtccaggaagtcatgctcggttactccgattccaacaaggat1740ggcggatatttctccgcaaactgggcgctttacgacgcggaactgcagctcgtcgaacta1800tgccgatcagccggggtcaagcttcgcctgttccacggccgtggtggcaccgtcggccgc1860ggtggcggaccttcctacgacgcgattcttgcccagcccaggggggctgtccaaggttcc1920gtgcgcatcaccgagcagggcgagatcatctccgctaagtacggcaaccccgaaaccgcg1980cgccgaaacctcgaagccctggtctcagccacgcttgaggcatcgcttctcgacgtctcc2040gaactcaccgatcaccaacgcgcgtacgacatcatgagtgagatctctgagctcagcttg2100aagaagtacgcctccttggtgcacgaggatcaaggcttcatcgattacttcacccagtcc2160acgccgctgcaggagattggatccctcaacatcggatccaggccttcctcacgcaagcag2220acctcctcggtggaagatttgcgagccatcccatgggtgctcagctggtcacagtctcgt2280gtcatgctgccaggctggtttggtgtcggaaccgcattagagcagtggattggcgaaggg2340gagcaggccacccaacgcattgccgagctgcaaacactcaatgagtcctggccatttttc2400acctcagtgttggataacatggctcaggtgatgtccaaggcagagctgcgtttggcaaag2460ctctacgcagacctgatcccagatacggaagtagccgagcgagtctattccgtcatccgc2520gaggagtacttcctgaccaagaagatgttctgcgtaatcaccggctctgatgatctgctt2580gatgacaacccacttctcgcacgctctgtccagcgccgatacccctacctgcttccactc2640aacgtgatccaggtagagatgatgcgacgctaccgaaaaggcgaccaaagcgagcaagtg2700tcccgcaacattcagctgaccatgaacggtctttccactgcgctgcgcaactccggctag2760当前第1页12