壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用与流程

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用。

背景技术：

干细胞是一类具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，可以分化为各种组织器官，干细胞已经成为生命科学领域的研究热点。科学家发现多种成体组织中都存在一类原始干细胞群体，它们和造血干细胞、神经干细胞等多能干细胞不同，多能干细胞只能分化为特定胚层的细胞，而这类原始干细胞可分化为不同胚层的组织细胞。这类原始干细胞还区别于胚胎干细胞，在个体生长发育过程中逐渐失去部分分化潜能，并且会出现一些特殊表型或者分子标志，被称为成体亚全能干细胞。亚全能干细胞具有下列特性：可分化为不同胚层的细胞，胚胎期的亚全能干细胞可分化为不同类型的多能干细胞，并在生长发育和新陈代谢中维持平衡；参与机体自我修复和更新，不仅能分化为所在器官的组织特异性细胞，参与器官重塑，还可以在炎症因子或者生长因子的趋化作用下，远处转移修复受损组织。因此，成体亚全能干细胞在参与组织损伤修复和弥补干细胞数量不足上都发挥着重要的作用，能够分离纯化、培养和可有效利用的成体亚全能干细胞具有重要意义。

目前，亚全能干细胞的提取存在一些阻碍，一方面现有的亚全能干细胞大多数是从人胎盘中提取得到，存在一定的伦理问题，另一方面现有的提取方法得到的亚全能干细胞活性低、分化能力有限，限制了亚全能干细胞在临床治疗中的应用。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，该方法提取的壁蜕膜亚全能干细胞的数量多、活性好、分化能力强，为临床治疗提供基础。

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

预处理：清洗壁蜕膜组织，离心，去除上清液；

消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括tryple酶、生理盐水、i型胶原酶和ⅱ型胶原酶，所述tryple酶的体积浓度为40～60％，i型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/ml，ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/ml；

分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。

上述制备方法，使用组织消化液成功从壁蜕膜组织中提取到亚全能干细胞，提取得到的细胞数量多、纯度高、活性好、分化能力强，可应用于临床；本发明的方法提供了一种新的亚全能干细胞提取来源——壁蜕膜组织，壁蜕膜组织来源丰富，不存在伦理争议，具有广阔的应用前景。

在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，离心转速为1000～1500r/min，离心时间为4～6min；所述清洗液包括：生理盐水、体积分数为45～55％的红细胞裂解液、8～12μg/ml的硫酸庆大霉素、8～12μg/ml的两性霉素b。细胞裂解液可以裂解将红细胞，清除血液，减少污染。

在其中一个实施例中，所述消化步骤具体为：将壁蜕膜组织剪碎成0.1～1cm³的碎块，加入0.8～1.5倍体积的组织消化液，混合均匀，在恒温震荡仪中震荡消化1～4h，温度控制为37±0.5℃，震荡转速为180～220r/min，消化完成分离上清液和沉淀，向沉淀中加入生理盐水重悬。

在其中一个实施例中，所述分离步骤具体为：向悬液中加入1.2～1.8倍体积的淋巴细胞分离液，离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，分层后，分离出位于第三层的单个核细胞，继续离心8～12min，离心转速为1000-2000r/min，保留沉淀，加入0.3～0.8倍体积的dmem/f12培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。

在其中一个实施例中，所述分离步骤后还包括培养步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞分离液以2～4×10⁵个/ml的密度进行接种，在温度为37±0.5℃，co2浓度为5±0.5％的培养箱中静置培养，标记为p0代，每隔3～4天更换40～60％含双抗的完全培养液。

在其中一个实施例中，所述培养步骤后还包括储存步骤：待p3代亚全能干细胞融合度达到80～90％时，完全弃掉培养液，清洗，加入消化液消化，离心，加入亚全能干细胞冻存液，放置于液氮中冻存。

在其中一个实施例中，所述储存步骤具体为：待p3代亚全能干细胞融合度达到80～90％时，完全弃掉培养液，用pbs清洗1～3次，加入消化液消化1～10min，加入完全培养液终止消化，500-1000r/min转速下离心5～7min，弃掉上清，向沉淀中加入亚全能干细胞冻存液，细胞浓度为1～6×10⁶个/ml，放置于液氮中冻存。

在其中一个实施例中，所述消化液包括质量百分数为0.2～0.3％的胰蛋白酶和质量百分数为0.003～0.005％的edta。

在其中一个实施例中，所述亚全能干细胞冻存液包括质量百分数为28～32％的甘油、质量百分数为13～17％的维生素c和质量百分数为15～25％的sr无血清培养基。上述亚全能干细胞冻存液可以使亚全能干细胞在长时间的保存过程中依然能保持良好的活性和分化能力，细胞存活率高。

本发明一方面还提供一种采用上述制备方法得到的壁蜕膜亚全能干细胞。该壁蜕膜亚全能干细胞纯度高、数量多、活性好、分化能力强，可应用于临床治疗。

本发明一方面还提供一种采用上述制备方法得到的壁蜕膜亚全能干细胞在制备成骨细胞和子宫内膜上皮细胞中的应用。

本发明一方面还提供一种上述壁蜕膜亚全能干细胞分化为成骨细胞的方法，包括以下步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞按照1～3×10⁴/ml的浓度接种，每3～4天更换一次成骨细胞分化诱导培养基，成骨细胞诱导培养基的成分为：dmem为基底液，血清替代物8～12vt％，地塞米松8～12nm/ml，β-磷酸甘油8～12m/ml，抗生素0.5～1.5wt％，细胞因子il-β20～30ng/ml，抗坏血酸100～110mm/ml，异黄酮8～12μg/ml。采用该成骨细胞分化诱导培养基可以有效诱导壁蜕膜亚全能干细胞分化为成骨细胞。

本发明一方面还提供一种上述壁蜕膜亚全能干细胞分化为子宫内膜上皮细胞的方法，包括以下步骤：将壁蜕膜亚全能干细胞按照1～2×10⁵/ml的浓度接种，每3～4天更换一次子宫内膜上皮细胞分化诱导培养基，子宫内膜上皮细胞诱导培养基的成分为：dmem培养基为基底液，血清替代品3～7vt％，维生素c0.5～1.5wt％，地塞米松10～20nm/ml，非必需氨基酸0.5～1.5wt％，tgf-β115～25ng/ml，egf15～25ng/ml，pdgf-bb15～25ng/ml，雌二醇25～35ng/ml。采用该子宫内膜上皮细胞分化诱导培养基可以有效诱导壁蜕膜亚全能干细胞分化为子宫内膜上皮细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的制备方法，使用组织消化液成功从壁蜕膜组织中提取到亚全能干细胞，提取得到的细胞数量多、纯度高、活性好、分化能力强，可应用于临床；本发明的方法提供了一种新的亚全能干细胞提取来源——壁蜕膜组织，壁蜕膜组织来源丰富，不存在伦理争议，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例中p3代亚全能干细胞形态图；

图2为实施例中p3代亚全能干细胞的流式检测结果图；

图3为实施例中p3代亚全能干细胞定向分化成子宫内膜上皮细胞结果图；

图4为实施例中p3代亚全能干细胞定向分化成子宫内膜上皮细胞的免疫荧光检测图；

图5为实施例中p3代亚全能干细胞细胞增殖能力图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)预处理：将壁蜕膜组织从采集袋中取出，用组织清洗液清洗，直至清洗无血液残留，然后将清洗干净的胎盘组织放入50ml无菌离心管中，1200rpm转速离心5min，去除上清液；其中，清洗液包括：生理盐水、体积分数为50％的红细胞裂解液、10μg/ml的硫酸庆大霉素、10μg/ml的两性霉素b。

(2)消化：将清洗干净的壁蜕膜组织用无菌直剪剪成0.1-1cm³的碎块，加入等体积预热为37℃的组织消化液，混合均匀，在37℃恒温震荡仪中震荡消化2h，转速为200r/min，消化完后快速瞬时离心，收集上清液，向沉淀中加入生理盐水重悬，再次快速瞬时离心，收集上清液，保留沉淀；其中，组织消化液的配方为：tryple酶50％、15ml含双抗的生理盐水、10mgi型胶原酶、10mgⅱ型胶原酶。

(3)分离：将收集的上清液合并，用100μm筛网过滤，1500rpm转速下离心10min，合并沉淀，向沉淀中加入1.5倍体积的生理盐水重悬，得到细胞悬液，再缓慢加入1.5倍体积的淋巴细胞分离液，1500rpm转速下离心10min，待出现分层，取出第三层的单个核细胞于无菌离心管中，1500rpm转速下离心10min，保留沉淀，加入0.5倍细胞悬液体积的dmem/f12培养液，混匀，得到亚全能干细胞分离液。

(4)培养：取微量(约1-20μl)亚全能干细胞进行细胞计数，按照3×10⁵个/ml密度进行接种，接种两个t75瓶，分别接种10ml，在37℃、5％co2的培养箱中静置培养，标记为p0代，每隔3～4天半量更换一次含双抗的完全培养液，弃掉未贴壁的细胞。

(5)传代培养及检测：培养至14天，细胞融合度达到约80～90％，完全弃掉培养液，用pbs清洗两次，加入2-10ml消化液进行消化，消化液中含有0.25wt％的胰蛋白酶和0.004wt％的edta，消化1-10min后加入完全培养液终止消化，分装到两个t75培养瓶中，每3天待细胞融合度达到70-80％时传代一次，传至p3代。p3代细胞形态如图1所示，细胞形态正常。通过流式检测p3代亚全能干细胞表面标记物，结果如图2所示。

(6)储存：待p3代亚全能干细胞融合度达到80～90％时，完全弃掉培养液，用pbs清洗细胞两次，加入2-10ml消化液进行消化，消化液中含有0.25wt％的胰蛋白酶和0.004wt％的edta，消化1-10min后加入完全培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打培养瓶底部，使细胞完全脱落后收集入无菌离心管中，700rpm转速下离心6min，弃掉上清，向沉淀中加入亚全能干细胞冻存液，亚全能干细胞冻存液中含有质量百分数为30％的甘油、质量百分数为15％的维生素c和质量百分数为20％的sr无血清培养基，轻轻混匀，加入冻存管，储存浓度为1～6×10⁶个/ml。将冻存管放入程序降温仪中后，放入-80℃低温冰箱24h后取出，放入-196℃液氮中冻存。

对比例1

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(2)中组织消化液的配方为：tryple酶50％、15ml含双抗的生理盐水、20mgⅱ型胶原酶。

对比例2

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(2)中组织消化液的配方为：tryple酶50％、15ml含双抗的生理盐水、20mgⅰ型胶原酶。

对比例3

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(2)中组织消化液的配方为：tryple酶50％、15ml含双抗的生理盐水。

实验例1

对实施例和对比例所得的p0代细胞和p3代细胞计数，结果如表1所示：

表1壁蜕膜亚全能干细胞计数表

实验例2

成骨细胞分化能力鉴定：

将实施例1中的p3代亚全能干细胞按照2×10⁴/ml的浓度接种在24孔板中，每孔1ml，每3天更换一次成骨细胞分化诱导培养基，成骨细胞诱导培养基的成分为：dmem为基底液、血清替代物10vt％，地塞米松10nm/ml，β-磷酸甘油10m/ml，抗生素1wt％，细胞因子il-β25ng/ml，抗坏血酸105mm/ml，异黄酮10μg/ml。培养至第14天，弃掉培养基，用pbs清洗2次，用4％的多聚甲醛固定20min，用茜素红进行染色，染色20min后，用生理盐水清洗两次，观察钙结节形成明显，表明实施例1的亚全能干细胞能有效分化为成骨细胞。

实验例3

子宫内膜上皮细胞分化能力鉴定：

将实施例1中的p3代亚全能干细胞按照1×10⁵/ml的浓度，接种在12孔板中，每孔2ml，每3天更换一次子宫内膜上皮细胞分化诱导培养基，诱导培养基的成分为：dmem培养基为基底液，血清替代品5vt％，维生素c1wt％，地塞米松15nm/ml，非必需氨基酸1wt％，tgf-β120ng/ml，egf20ng/ml，pdgf-bb20ng/ml，雌二醇30ng/ml。

培养至第14天，处理前观察诱导得到的子宫内膜上皮细胞，如图3所示。弃掉培养基，用pbs清洗2次，用4％的多聚甲醛室温固定20min，用pbs清洗3次，每次5min。向清洗后的细胞中加入500μl2％的triton裂解液，裂解20min，用pbs清洗3次，每次5min，使用一抗4℃孵育12h后清洗，清洗后添加与一抗相对应的荧光二抗，避光室温孵育2h，用pbs清洗3次，每次3min。清洗后避光复染细胞核，室温复染5-10min，用pbs清洗3次，每次5min。清洗后用吸水纸吸干残留的pbs封片镜检，镜检结果如图4所示(图4中背景为黑色，绿色显示为灰色，红色显示为白色，蓝色显示为黑色)，绿色荧光标记为蛋白ck18，红色荧光标记为蛋白ck7，结果表明本发明和亚全能干细胞可以成功分化成具有活性的子宫内膜上皮细胞。

实验例4

亚全能干细胞增殖能力的鉴定

取实施例1中p3代亚全能干细胞，按照每孔2×10⁴个细胞数将亚全能干细胞接种在96孔板，分3组，每组5个复孔。每孔补充dmem培养基至100μl/孔，并设置加入单纯细胞培养液的空白对照孔。置于5％co2，37℃恒温培养箱中培养24h待其完全贴壁。每24h后只向当天用的每孔加入10μlcck-8反应剂，放于37℃中孵育2.5h。将孵育后的培养板放置在酶标仪中，测定450nm波长处的吸光度od450，记录结果。重复7天，按照吸光度od值绘制曲线。

再取冻存60d的p3代亚全能干细胞，复苏，按上述方法进行细胞增殖，绘制吸光度曲线。

未冻存和冻存复苏后的亚全能干细胞增殖能力结果如图5所示，可以看出冻存复苏后的细胞数量在第七天与未冻存的细胞基本相同，说明本发明的储存方法可以有效保持细胞的增值能力或活性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。