一种藏酒洞微生物及其在新酒陈化中的应用的制作方法

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种藏酒洞微生物及其在新酒陈化中的应用。

背景技术：

通常，新酿造出来的酒往往带有辛辣味与刺激性气味，香气寡淡，口感较差，不醇和等特点。故新酒都需要经一定时间贮存，才能使杂味消失，香味增加，酒体醇和绵软，口味协调，这个变化一般称为老熟。这种自然老熟，是优质酒生产的传统方法，主要是由于在贮存过程中发生了氧化和酯化等反应，香味物质不断生成；又由于新酒含有低沸点的醛类和硫化氢等刺激性和臭味物质，经过贮存后大多挥发，酒精分子与水分子发生缔合，因而新酒的刺激味和辛辣味就大为减少。所以说，酒是陈的香。

根据原料和发酵工艺的不同，新酒的陈化时间需要几年到几十年不等。此外，新酒的自然老熟不仅是一个极漫长的过程，还占用了大量的贮存容器和库房或藏酒洞，导致了生产周期长、陈酿车间占地面积多等问题，这样必然会造成资金积压，不利于现代化生产的要求。为此，制酒行业通过采用现代化的科学技术来加速酒的老熟过程。这些技术可分为三大类：物理法、化学法和生物法。物理催陈的方法包括光、电、磁、微波、超声波、离子、高压等众多种外加因素的方法，虽然都有一定的作用，但是这些外加因素的方法，有的很大程度上改变了新酒自然陈化的机理，故有人认为这是将一种生酒变成了另一种“生酒”。而化学催陈是通过向其中添加一些老熟的标志性物质或这些物质的前体物质，但这些外源添加物质的安全性始终不及其自然产生，且不会减少新酒中有害物质的含量。目前，已知微生物特别是乳酸菌对新酒酿造过程中风味物质及有机酸的形成起至关重要的作用，其中较常见的有干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，它们都可以促进新酒风味成熟，增加新酒风味，但它们只在发酵过程中起作用，而在陈化过程中却很难发现它们的存在。

目前，专利cn103255016a公开了一种酶法加速红酒陈化的方法，该方法利用多酚氧化酶促进红酒中原花青素的聚合，使其形成多聚体沉淀物，从而加速红酒的陈化过程，但该方法不仅不能减少醛类和硫化氢等物质的含量，还不利于酯类物质的合成，陈化后得红酒香气不足且辛辣味重。专利cn108841558a公开了一种快速陈化黄酒的方法，该方法以次氯酸钾为氧化剂，在紫外线和催化剂二氧化硅的协同作用下促使氧化还原反应和酯化反应加速进行，但是该方法中次氯酸钾被还原生成氧气，其生成的氧气会造成生菌膜的产生，从而容易引起酒的酸败。专利cn108728323a公开了一种模拟自然醇化的新酒高效陈化装置及其应用方法，该方法设计了一种陈化装置，并使用纳米功能材料作为其栅杆及壳体下部的填料，缩短酒的催陈时间，该方法设备投资大，纳米功能材料昂贵且使用寿命短，投入和收效不成正比。

已有促进白酒老熟的技术主要为物理法、化学法，难以模拟白酒在藏酒洞中的生态储藏环境，无法达到传统洞藏所赋予的白酒老熟效果；另外，虽然藏酒洞对于白酒风味品质提升具有重要作用，但是需要数年乃至数十年的时间积累，才能获得品质上佳的陈年白酒。目前尚缺少对白酒陈酿过程中陶坛表面微生物的分离鉴定及其对白酒储藏过程中风味品质影响的研究，缺少关于利用藏酒洞环境微生物加速白酒老熟的技术应用。

目前，市场上还缺乏用于新酒陈化过程的微生物，也缺乏加速基酒老熟的微生物方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题为：现有市场缺乏用于新酒陈化过程的微生物，也缺乏加速基酒老熟的微生物方法的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种藏酒洞微生物及其在新酒陈化中的应用。该藏酒洞微生物命名为平脐疣孢p-3，保藏编号为cgmccno.18126。保藏时间为：2019年8月26日，保藏地点为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的its序列具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

seqidno:1藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的its核苷酸序列

gacctccaccctttttgtgaaccacctcgttgcctcgggggcgaccctgccgtgctctcgggtgcggtgggagctcccggcggccgcttcataccctgcgtaactgagccgtcggagtttatacaaatcaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttcgggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccacctggtattccggcggacatgcctgtccgagcgtcattacgccaatcgagcctggctcggtgttgcgcgtcgcgggctgcgcagcccgcgcgccttaaagtctcaccggctgagcgacgctcctctaagcgttgtggaaactattcgcggcgacggctggcggcgcggccgttaaataccccatcaaaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaatagccgg。

本发明所述的藏酒洞微生物平脐疣孢p-3是从泸州老窖旅游区纯阳洞的洞壁中分离得到的。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的生长特征为：温度10～28℃，ph值4～7，避光。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的形态特征为：在pda培养基上，其菌落呈球形，表面结构呈颗粒状，孢子为黑色或灰黑色，分生孢子为球形，菌丝无色、无隔膜、偶见分枝，无锁状联合。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3耐乙醇浓度为0～8％。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的稳定性特征为：在pda培养基20℃培养48h，连续传代10代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，生物学性状稳定。

本发明还提供了上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3在新酒陈化中的应用。

进一步的，所述的新酒为：白酒、葡萄酒或黄酒。

本发明还提供了一种上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法，包括以下步骤：

a、在斜面培养基中培养平脐疣孢p-3，20℃培养72～96h至长出浓密孢子；制备孢子悬浮液，并刮下斜面培养基表面生长的孢子，过滤除去菌丝体后加入孢子悬浮液中，制备得到孢子液；

b、将步骤a得到的孢子液稀释至1×10⁵个/ml，接种至种子培养基中，20℃静置培养36～48h，得到平脐疣孢p-3菌株种子液；

c、将步骤b中的平脐疣孢p-3菌株种子液转接至生长培养基中，20℃培养36～48h，离心，弃上清，得到平脐疣孢p-3细胞，加入无菌水制备平脐疣孢p-3细胞悬浮液，使悬浮液中的细胞数量为10⁷～10⁹个/ml；

d、将步骤c中得到的平脐疣孢p-3细胞悬浮液转移至喷雾器中，喷洒至藏酒洞洞壁、贮酒陶坛或贮酒木桶表面。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤a所述的孢子悬浮液的制备方法为：称取0.1gtween80、0.9gnah2po4、5.2gna2hpo4和0.9gnacl溶于100ml重蒸水，充分混匀，于121℃灭菌20min，置于4℃冰箱备用。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤a所述的斜面培养基为pda培养基，步骤b所述的种子培养基为pdb培养基，步骤c所述的生长培养基为含4mg/lmgso4和8mg/lcaso4的pdb培养基。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤d所述的喷洒的浓度为：洞壁10¹⁰～10¹²个细胞/dm²，陶坛10⁶～10⁸个细胞/dm²，橡木桶表面10⁵～10⁷个细胞/dm²。

本发明的有益效果为：

本发明首次从生态藏酒的角度，从藏酒洞中陈年白酒酒坛坛壁和墙壁表面的原生态微生物群落中分离获得了关键微生物菌株，命名为平脐疣孢p-3，其具有减少白酒新酒中高级醇含量、提高白酒滋味和香气或加速新酒老熟的作用，用于白酒老熟时，达到了减少新酒醛类物质相对含量、提高酒中酯类物质相对含量、提高产品风味品质、加速新酒老熟的有益效果。该菌株可促进白酒、葡萄酒及黄酒的陈化作用，缩短陈化时间，并有助于提高酒的口感和品质。

本发明提供的平脐疣孢p-3已于2019年8月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc保藏，保藏编号为cgmccno.18126，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，生物学分类命名为zasmidiumcellare。

附图说明

图1为实施例2所述平脐疣孢p-3在pda培养基上的形态特征。

图2为实施例2所述平脐疣孢p-3在pda培养基上的形态特征。

图3为本发明所述平脐疣孢p-3基于its1rrna基因发育树图。

图4为发明所述平脐疣孢p-3电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种藏酒洞微生物平脐疣孢p-3，保藏编号为cgmccno.18126。保藏时间为：2019年8月26日，保藏地点为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的its序列具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。

本发明所述的藏酒洞微生物平脐疣孢p-3是从泸州老窖旅游区纯阳洞的洞壁中分离得到的。

本发明还提供了上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3在新酒陈化中的应用。

进一步的，所述的新酒为：白酒、葡萄酒或黄酒。

本发明还提供了一种上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法，包括以下步骤：

a、在斜面培养基中培养平脐疣孢p-3，20℃培养72～96h至长出浓密孢子；制备孢子悬浮液，并刮下斜面培养基表面生长的孢子，过滤除去菌丝体后加入孢子悬浮液中，制备得到孢子液；

b、将步骤a得到的孢子液稀释至1×10⁵个/ml，接种至种子培养基中，20℃静置培养36～48h，得到平脐疣孢p-3菌株种子液；

c、将步骤b中的平脐疣孢p-3菌株种子液转接至生长培养基中，20℃培养36～48h，离心，弃上清，得到平脐疣孢p-3细胞，加入无菌水制备平脐疣孢p-3细胞悬浮液，使悬浮液中的细胞数量为10⁷～10⁹个/ml；

d、将步骤c中得到的平脐疣孢p-3细胞悬浮液转移至喷雾器中，喷洒至藏酒洞洞壁、贮酒陶坛或贮酒木桶表面。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤a所述的孢子悬浮液的制备方法为：称取0.1gtween80、0.9gnah2po4、5.2gna2hpo4和0.9gnacl溶于100ml重蒸水，充分混匀，于121℃灭菌20min，置于4℃冰箱备用。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤a所述的斜面培养基为pda培养基，步骤b所述的种子培养基为pdb培养基，步骤c所述的生长培养基为含4mg/lmgso4和8mg/lcaso4的pdb培养基。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤d所述的喷洒的浓度为：洞壁10¹⁰～10¹²个细胞/dm²，陶坛10⁶～10⁸个细胞/dm²，橡木桶表面10⁵～10⁷个细胞/dm²。

其中，上述藏酒洞微生物平脐疣孢p-3的应用方法中，步骤a所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)，成分(g/l)：马铃薯粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g。

步骤b所述的种子培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(pdb培养基)，成分(g/l)：马铃薯浸粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，氯化钠5g，步骤c所述的生长培养基为含8mg/lnah2po4的pdb培养基，成分(g/l)：马铃薯浸粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，氯化钠5g，nah2po48mg。

步骤c所述的生长培养基为含8mg/lk2hpo4的pdb培养基。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1本发明平脐疣孢p-3的分离

于泸州老窖旅游区纯阳洞的洞壁上刮取10g壁样，迅速加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，加入灭菌的玻璃珠，在涡旋振荡器上充分振荡10min，使样品充分散开。将上清液进行10倍梯度稀释，稀释度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，用移液枪吸取0.2ml样液，采用平板涂布法，将样液均匀涂布于pda筛选培养基上，将制备好的平板倒置于20℃恒温培养箱中培养72～120h，且利用加湿器恒温培养箱提供不同溶度的乙醇(以空气中乙醇溶度计)。用平板划线分离出高乙醇耐受菌株。挑取能够在含5～8％乙醇溶度的培养基上生长良好的菌株通过多次划线分离培养分离出单个菌落，然后将其接种到pda斜面培养基上，4℃条件下保藏于冰箱备用。

实施例2本发明平脐疣孢p-3的鉴定

步骤1：酒窖平脐疣孢p-3的形态学鉴定

对分离得到的菌株，按照《真菌鉴定手册》(魏景超主编，上海科学技术出版社，1979)的方法，采用pda平板和显微镜对菌落、菌丝、孢子等结构进行观察。结果显示，菌株在pda培养基上20℃培养48h，菌落呈球形，表面结构呈颗粒状，孢子为黑色或灰黑色，分生孢子为球形，菌丝无色、无隔膜、偶见分枝，无锁状联合。参照《真菌鉴定手册》，筛选菌株初步认为是酒窖平脐疣孢(zasmidiumcellare)

步骤2：酒窖平脐疣孢p-3的分子生物学鉴定

使用真菌基因组试剂盒(购自takara，codeno.9765)提取酒窖平脐疣孢p-3(zasmidiumcellarep-3)的基因组dna。采用真菌itsrrna基因通用引物进行pcr扩增，引物序列如seqidno：2和seqidno：3所示。

seqidno：2真菌its1rrna通用引物核苷酸序列：

tccgtaggtgaacctgcgg。

seqidno：3真菌its4rrna通用引物核苷酸序列：

tcctccgcttattgatatgc。

pcr反应体系为：步骤2所得的模板dna10ng，pcrpremix12.5μl，its1rrna通用引物(20pmol/μl)1.0μl，its4rrna通用引物(20pmol/μl)1.0μl，ddh2o补足总体积25μl。

pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，取出产物。

序列测定工作由扩增后的pcr产物送样测序，测序由上海生工生物科技有限公司完成。

根据其形态特征、生理生化指标以及its1rdna基因序列在ncbi中blast比对结果显示它与zasmidiumcellare有99.37％的相似度，故可鉴定菌株p-3为酒窖平脐疣孢(zasmidiumcellare)。

实施例3本发明酒窖平脐疣孢p-3在白酒陈化中的应用

(1)将刚蒸馏出的白酒转移至洁净的陶坛中，其白酒的贮存量为陶坛体积(v/v)的4/5，之后用不透气的帆布密封陶坛的开口处且在帆布周围用泥头封头，并用拖车将装有白酒的陶坛运至藏酒洞进行自然老熟；

(2)在pda斜面培养基中培养酒窖平脐疣孢p-3，20℃培养96h至长出浓密孢子，加入孢子悬浮液，刮下pda斜面培养基表面生长的孢子，用无菌的滤纸过滤除去菌丝体；

(3)将步骤(2)中得到的孢子液用无菌水稀释至1×10⁵个/ml，接种至pdb种子培养基中，20℃静置培养48h，得到酒窖平脐疣孢p-3菌株种子液；

(4)取步骤(3)中酒窖平脐疣孢p-3种子液转接至含4mg/lmgso4和8mg/lcaso4的pdb生长培养基中，20℃培养48h，将培养基离心，弃去上清液，获得相应的酒窖平脐疣孢p-3细胞，加入无菌水以制备酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液，使其悬浮液中的细胞数量可达10⁹个/ml；

(5)将步骤(4)中得到的酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液转移至喷雾器中，并将其喷洒至藏酒洞的洞壁和贮藏酒的陶坛的表面，其喷洒于洞壁的细胞数量为10¹²个/m²，陶坛表面的细胞数量为10⁸个/dm²；

(6)三个月后取出步骤(5)中置于藏酒洞的陶坛，将其中的白酒分装至已灭菌的酒瓶中，瓶中的白酒即为加速陈化后得到的陈酒。

实施例4本发明酒窖平脐疣孢p-3在葡萄酒陈化中的应用

(1)将刚酿造出的葡萄酒转移至洁净的橡木桶中，其葡萄酒的贮存量为橡木桶体积(v/v)的4/5，之后用橡木板把橡木桶的开口密封，并用拖车将装有葡萄酒的橡木桶运至地窖进行自然老熟；

(2)在pda斜面培养基中培养酒窖平脐疣孢p-3，20℃培养96h至长出浓密孢子，加入孢子悬浮液，刮下pda斜面培养基表面生长的孢子，用无菌的滤纸过滤除去菌丝体；

(3)将步骤(2)中得到的孢子液用无菌水稀释至1×10⁵个/ml，接种至pdb种子培养基中，20℃静置培养36h，得到酒窖平脐疣孢p-3菌株种子液；

(4)取步骤(3)中酒窖平脐疣孢p-3种子液转接至含4mg/lmgso4和8mg/lcaso4的pdb生长培养基中，20℃培养36h，将培养基离心，弃去上清液，获得相应的酒窖平脐疣孢p-3细胞，加入无菌水以制备酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液，使其悬浮液中的细胞数量可达10⁷个/ml；

(5)将步骤(4)中得到的酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液转移至喷雾器中，并将其喷洒至橡木桶的表面，其喷洒于橡木桶的细胞数量为10⁷个/dm²。

(6)三个月后取出步骤(5)中置于地窖的橡木桶，将其中的葡萄糖酒分装至已灭菌的酒瓶中，瓶中的葡萄糖酒即为加速陈化后得到的陈酒。

实施例5本发明酒窖平脐疣孢p-3在黄酒陈化中的应用

(1)将刚酿造出的黄酒转移至洁净的陶坛中，其陶坛的贮存量为橡木桶体积(v/v)的4/5，之后用不透气的帆布密封陶坛的开口处且在帆布周围用泥头封头，并用拖车将装有黄酒的陶坛运至贮藏库进行自然老熟；

(2)在pda斜面培养基中培养酒窖平脐疣孢p-3，20℃培养72h至长出浓密孢子，加入孢子悬浮液，刮下pda斜面培养基表面生长的孢子，用无菌的滤纸过滤除去菌丝体；

(3)将步骤(2)中得到的孢子液用无菌水稀释至1×10⁵个/ml，接种至pdb种子培养基中，20℃静置培养40h，得到酒窖平脐疣孢p-3菌株种子液；

(4)取步骤(3)中酒窖平脐疣孢p-3种子液转接至含4mg/lmgso4和8mg/lcaso4的pdb生长培养基中，20℃培养40h，将培养基离心，弃去上清液，获得相应的酒窖平脐疣孢p-3细胞，加入无菌水以制备酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液，使其悬浮液中的细胞数量可达10⁸个/ml；

(5)将步骤(4)中得到的酒窖平脐疣孢p-3细胞悬浮液转移至喷雾器中，并将其喷洒至陶坛的表面，其喷洒于陶坛的细胞数量为10⁹个/dm²。

(6)三个月后取出步骤(5)中置于贮藏库的陶坛，将其中的黄酒分装至已灭菌的酒瓶中，瓶中的黄酒即为加速陈化后得到的陈酒。

对比例1

该对比例仅在实施例3中的步骤(5)中不将酒窖平脐疣孢p-3喷洒至藏酒洞的洞壁及陶坛的表面。

对比例2

该对比例仅在实施例4中的步骤(5)中不将酒窖平脐疣孢p-3喷洒至橡木桶的表面。

对比例3

该对比例仅在实施例5中的步骤(5)中不将酒窖平脐疣孢p-3喷洒至陶坛的表面。

实施例3-5与对比例1-3老熟后的酒中，酯类、醛类、醇类化合物含量如下表1所示。检测方法采用气相色谱质谱(gcms)内标法(泸型酒蒸馏前后酒醅中挥发性物质的差异性分析.食品与发酵工业,2015,41:34-37)。

表1不同方法老熟的酒中挥发性化合物含量

*1醇类化合物包括乙醇、异戊醇、己醇、辛醇、2,3-丁二醇、糠醇、苯乙醇。

*2醛类化合物包括糠醛、壬醛、苯甲醛。

*3总酯风味物质包括己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯。

实施例3-5与对比例1-3老熟后的酒中，感官指标如下表2所示。

表2白酒感官品评标准

记分标准采用100分为满分，其中色泽10分，香气25分，口味50分，风格15分。

表3不同老熟方法得到的酒感官指标

由实施例和对比例可知，本发明分离鉴定了一种微生物酒窖平脐疣孢p-3，其可有效用于白酒、葡萄酒和黄酒的新酒老熟过程中，能够促进醇类、醛类物质的降解，减少新酒醇类、醛类物质相对含量、提高酒中酯类物质相对含量、提高产品风味品质、加速新酒老熟，为基酒老熟提供了一种全新的方法，适宜推广使用。

序列表

<110>泸州老窖股份有限公司

江南大学

泸州品创科技有限公司

<120>一种藏酒洞微生物及其在新酒陈化中的应用

<130>a200097k（序）

<141>2020-03-11

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>497

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gacctccaccctttttgtgaaccacctcgttgcctcgggggcgaccctgccgtgctctcg60

ggtgcggtgggagctcccggcggccgcttcataccctgcgtaactgagccgtcggagttt120

atacaaatcaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttcgggcatcgatgaagaacg180

cagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaac240

gcacattgcgccacctggtattccggcggacatgcctgtccgagcgtcattacgccaatc300

gagcctggctcggtgttgcgcgtcgcgggctgcgcagcccgcgcgccttaaagtctcacc360

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