氨苯砜药物超敏反应性T细胞受体及其用途的制作方法

本发明涉及氨苯砜药物超敏反应性t细胞受体及其用途。
背景技术：
：麻风病是由麻风杆菌引起的慢性传染性疾病。麻风杆菌主要侵犯皮肤和神经，造成肢体的畸残，不仅导致患者的劳动力丧失，而且引起社会对患者的恐惧和歧视，造成患者个人、家庭等社会问题。20世纪80年代，世界卫生组织推荐联合化疗(mdt)的方案，随着该方案的全球范围内推广应用，大多数国家和地区的麻风病发病率明显降低，我国亦然。氨苯砜(4,4’-diamonodiphenylsulfone,dds)是mdt方案中必需的药物。然而氨苯砜可导致部分患者罹患严重的药物过敏---氨苯砜超敏综合征，该综合征在临床上常表现为：发热、淋巴结肿大、剥脱性皮炎、溶血和肝炎等，严重可导致患者死亡。我们研究显示：我国麻风患者中氨苯砜综合征的发病率约为2％，而死亡率可高达12.5％，该病已成为导致我国麻风病患者死亡的最主要的原因之一。另外，dds在其他皮肤病的治疗中也有较好的疗效，如疱疹样天疱疮、类天疱疮、聚合性痤疮等；但同样因其具有可引起患者罹患氨苯砜超敏综合征的风险，而致其在临床应用上受阻。近来本课题组采用直接基因测序分型法对罹患氨苯砜超敏综合征的麻风患者、dds耐受的麻风患者和正常健康人的主要组织相容性抗原(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)，又称人类白细胞分化抗原(hla)和相关药物代谢酶(nat2和cyp2c9)进行分析，首次发现了氨苯砜超敏综合征(ddsdress)与hla-b*1301高度相关。从而将氨苯砜超敏综合征进一步定位为具有遗传背景下的变态反应疾病，氨苯砜超敏综合征具有hla-b*1301限制性致使dds超敏征的发生。因此我们对hla-b*1301分子在氨苯砜超敏综合征中反应性tcr进行筛选、鉴定并进行应用检测对该疾病的预警有着很重要的意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供两种t细胞受体tcr1和tcr2。本发明要解决的另外一个技术问题是提供用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的引物对。本发明还要解决的一个技术问题是提供一种用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的试剂盒。本发明还要解决的一个技术问题是提供一种t细胞受体tcr1和tcr2的检测方法。对于t细胞受体tcr1和tcr2，本发明采用的技术方案是，t细胞受体tcr1，其α链包含如seqidno.1所示核苷酸序列，其β链包含如seqidno.2所示核苷酸序列；t细胞受体tcr2，其α链包含如seqidno.3所示核苷酸序列，其β链如seqidno.4所示核苷酸序列。作为优选，t细胞受体tcr1或tcr2具有hla-b*1301限制性致使氨苯砜药物超敏综合症的发生。对于用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的引物对，本发明采用的技术方案是，用于检测t细胞受体tcr1的引物对的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示，用于检测t细胞受体tcr2的引物对的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12所示。作为优选，本发明还包括上述用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的引物对在制备诊断麻风病患者氨苯砜过敏综合症制剂中的应用。对于用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的试剂盒，本发明采用的技术方案是，试剂盒包括：用于检测t细胞受体tcr1的引物对seqidno.5和seqidno.6、引物对seqidno.7和seqidno.8；用于检测t细胞受体tcr2的引物对seqidno.9和seqidno.10、引物对seqidno.11和seqidno.12。对于用于检测t细胞受体tcr1和tcr2的鉴定方法，本发明采用的技术方案是，包括以下步骤：一、t细胞受体的筛选1)复苏患者和健康人单一核细胞用10％1640完全培养基(90ml1640+10mlfbs+双抗)稀释，加入每孔2x10*5；2)50ug/ml氨苯砜加入上述细胞中，37℃二氧化碳孵箱培养一周；3)50gy辐照患者和健康人单一核细胞；4)将辐照后的细胞加之步骤1)中；5)同时加入30ug/mlcd3，30ug/mlcd2837℃二氧化碳孵箱培养过夜；6)第二天加入200uil2，每隔两天补液一次；7)待t细胞克隆长出；二、t细胞受体的鉴定8)将上述克隆加至96孔板中；9)同时加入apc细胞，分别加入dapson和溶媒组dmso，反应24h；10)取出已经加入的anti-humanifn-relisa板中；11)将步骤9)中细胞1000g离心20min，吸取上清100ul，37度孵育1.5小时；12)pbst洗4遍，pbs100:1稀释生物素连接humanifn-r，加入elisa孔板中，每孔100ul；37℃孵育1小时；pbst两洗4遍；13)pbs100:1稀释生物素连接链霉素-hrp，加入elisa孔板中，每孔100ul；37℃孵育半小时；pbst洗4遍；14)加100ul底物反应，37℃孵育20分钟，加入100ul终止液，od450读数；15)阳性t细胞克隆完成tcr测序，筛选反应性t细胞受体；其中，t细胞受体tcr1的α链名称为trav12-3，其核苷酸序列如下：t细胞受体tcr1的β链名称为trbv28，其核苷酸序列如下：其中，t细胞受体tcr2的α链名称为trav13-1，其核苷酸序列如下：t细胞受体tcr2的β链名称为trbv30，其核苷酸序列如下：16)上述测序获取的反应性tcr位点，ncbiprimer中设计特异性引物如下：引物名称引物序列trav12-3f5’-caggatcctggaccactcag-3'trav12-3r5’-gctgtaaaccttccatcttc-3’trbv28f5’-agaccacgtagaactttcct-3’trbv28r5’-tcgaaagaggttccgaggat-3’trav13-1f5’-catactccgattccgcctcc-3’trav13-1r5’-ctgtgatgtgcaggctgaagt-3’trbv30f5’-cactgtggagggaacatcaa-3’trbv30r5’-tggaggctgagagattctgg-3’17)选择dapsondresshla-b1301患者,dapsonsjshla-b1301患者,dapsondresshla-b5801患者,dapsondresshla-b1502患者及正常人全血样本，利用qiagen全血rnakit提取rna样本；18)qiagencdna逆转kit将步骤17)中rna逆转录；19)qiagen荧光定量pcr体系：酶10ul，引物各2ul，cdna2ul，depc水6ul；反应条件：95℃5min；95℃0.5min，60℃1min，40cycle。本发明的有益效果是：本发明所提供的t细胞受体可有效检测氨苯砜引起dresshla-b1301患者机体反应性tcr免疫特性，如麻风病、疱疹样天疱疮、类天疱疮、聚合性痤疮等具有可引起患者罹患氨苯砜超敏综合征的风险疾病的机体t细胞免疫进行检测；适于治疗hla-b*1301限制性氨苯砜药物超敏征患者的免疫治疗，为后续特异性tcr单克隆抗体治疗提供理论依据。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例的qpcr检测反应性tcr表达图。具体实施方式一、实验材料1、2015年-2019年中国医学科学院皮肤病医院门诊收集麻风病氨苯砜超敏综合征病例共20例，每例患者需取血液标本单一核细胞，液氮保存待用，并提取均签署知情同意书。2、选取10例氨苯砜超敏综合征病人、10例健康人单一核细胞。3、氨苯砜(dapsone)药物购自sigma。4、氨苯砜药物超敏反应性tcr检测试剂盒中引物：引物名称引物序列trav12-3f5’-caggatcctggaccactcag-3'trav12-3r5’-gctgtaaaccttccatcttc-3’trbv28f5’-agaccacgtagaactttcct-3’trbv28r5’-tcgaaagaggttccgaggat-3’trav13-1f5’-catactccgattccgcctcc-3’trav13-1r5’-ctgtgatgtgcaggctgaagt-3’trbv30f5’-cactgtggagggaacatcaa-3’trbv30r5’-tggaggctgagagattctgg-3’二、实验1、氨苯砜药物超敏反应性tcr的筛选1)复苏10例患者和10例健康人单一核细胞用10％1640完全培养基(90ml1640+10mlfbs+双抗)稀释，加入每孔2x10*5；2)50ug/ml氨苯砜加入上述细胞中，37℃二氧化碳孵箱培养一周；3)50gy辐照10例患者和10例健康人单一核细胞；4)将辐照后的细胞加之步骤1)中；5)同时加入30ug/mlcd3，30ug/mlcd2837℃二氧化碳孵箱培养过夜；6)第二天加入200uil2，每隔两天补液一次7)待t细胞克隆长出。2、氨苯砜超敏综合征反应性tcr的鉴定1)将上述克隆加至96孔板中；2)同时加入apc细胞，分别加入dapson和溶媒组dmso，反应24h；3)取出已经加入的anti-humanifn-relisa板中；4)将步骤2)中细胞1000g离心20min，吸取上清100ul，37℃孵育1.5小时；5)pbst洗4遍，pbs100:1稀释生物素连接humanifn-r，加入elisa孔板中，每孔100ul；37℃孵育1小时；pbst两洗4遍；6)pbs100:1稀释生物素连接链霉素-hrp(1:100)，加入elisa孔板中，每孔100ul；37℃孵育半小时。pbst洗4遍；7)加100ul底物反应，37℃孵育20分钟，加入100ul终止液，od450读数；8)阳性t细胞克隆完成tcr测序，筛选得到氨苯砜药物超敏反应性tcr位点trav12-3，trbv28，trav13-1以及trbv30。其中，氨苯砜超敏综合征反应性tcr1的α链名称为trav12-3，核苷酸序列如下：氨苯砜超敏综合征反应性tcr1的β链名称为trbv28，其核苷酸序列如下：氨苯砜超敏综合征反应性tcr2的α链为trav13-1，其核苷酸序列如下：氨苯砜超敏综合征反应性tcr2的β链为trbv30，其核苷酸序列如下：9)上述测序获取的反应性tcr位点，ncbiprimer中设计特异性引物如下：引物名称引物序列trav12-3f5’-caggatcctggaccactcag-3'trav12-3r5’-gctgtaaaccttccatcttc-3’trbv28f5’-agaccacgtagaactttcct-3’trbv28r5’-tcgaaagaggttccgaggat-3’trav13-1f5’-catactccgattccgcctcc-3’trav13-1r5’-ctgtgatgtgcaggctgaagt-3’trbv30f5’-cactgtggagggaacatcaa-3’trbv30r5’-tggaggctgagagattctgg-3’10)选择20例dapsondresshla-b1301患者,20例dapsonsjshla-b1301患者,20例dapsondresshla-b5801患者,20例dapsondresshla-b1502患者及20例正常人全血样本，利用qiagen全血rnakit提取rna样本；11)qiagencdna逆转kit将步骤2)中rna逆转录；12)qiagen荧光定量pcr体系：酶10ul，引物各2ul，cdna2ul，depc水6ul；反应条件：95℃5min；95℃0.5min，60℃1min，40cycle。三、结果与讨论我们选取10例dapsondresshla-b1301病人及10例健康人单一核细胞，在相同药物浓度、相同培养时间及相同培养温度条件下，10例病人及10例健康人在氨苯砜刺激及共孵育14-18天，比较与氨苯砜共孵育t细胞免疫反应，挑选出阳性克隆完成tcr免疫组库测序。对筛选出20例dapsondresshla-b1301患者,20例dapsonsjshla-b1301患者,20例dapsondresshla-b5801患者,20例dapsondresshla-b1502患者及20例正常人全血样本氨苯砜超敏综合征病人含hla-b1301位点在本试剂盒检测下能灵敏的监测反应性tcr位点trav12-3，trav13-1，trbv28以及trbv30。从图1看出，麻风病dapsondresshla-b1301患者中，tcr受体trav12-3，trav13-1，trbv28以及trbv30在dapsondresshla-b1301较dapsonsjshla-b1301、dapsondresshla-b5801患者、dapsondresshla-b1502患者以及正常人均表达显著，因此该4个位点为麻风病dapsondresshla-b1301患者氨苯砜药物超敏反应性tcr。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。序列表<110>中国医学科学院皮肤病研究所<120>氨苯砜药物超敏反应性t细胞受体及其用途<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>334<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>1cagaaggaggtggagcaggatcctggaccactcagtgttccagagggagccattgtttct60ctcaactgcacttacagcaacagtgcttttcaatacttcatgtggtacagacagtattcc120agaaaaggccctgagttgctgatgtacacatactccagtggtaacaaagaagatggaagg180tttacagcacaggtcgataaatccagcaagtatatctccttgttcatcagagactcacag240cccagtgattcagccacctacctctgtgcaataggtgctggcaacaaccgtaagctgatt300tggggattgggaacaagcctggcagtaaatccga334<210>2<211>522<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>2gaggacctgcgcaacgtcaccccaccaaaggtcagtttgtttgagccatcaaaggcggag60atcgccaacaaacagaaagctacgctcgtgtgtttggctcggggcttcttcccagaccac120gtagaactttcctggtgggtcaatggaaaggaggttcattccggagtgtccactgatccc180caagcgtacaaggaatccaactatagctactgtctctcatctcggctccgggtgagtgcg240acattctggcataatcctcggaaccactttcgatgccaagtgcagtttcatgggttgagc300gaggaagacaagtggcccgagggcagtcctaaaccagtcactcaaaacataagcgccgag360gcatggggtagagccgattgtgggattactagcgcttcataccaacaaggggtattgagc420gctacaattctttacgaaattctcctcggcaaggcgacgctctacgccgtactggtgtct480actctcgtggttatggcaatggtgaaacggaaaaacagctaa522<210>3<211>390<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>3atgacaagcatcagagccgtgttcatcttcctgtggctgcagctggatctggtgaatggc60gagaatgtggagcagcaccccagcaccctgagcgtgcaggagggcgacagcgccgtgatc120aagtgcacatactccgattccgcctccaactacttcccttggtacaagcaggagctgggc180aagggccctcagctgatcatcgatatcaggagcaatgtgggcgagaagaaggatcagaga240atcgccgtgaccctgaacaagacagccaagcacttcagcctgcacatcacagagacccag300cctgaggactccgccgtgtacttctgcgccgccagcagaggcagctacatccccaccttc360ggcaggggcacaagcctgatcgtgcacccc390<210>4<211>331<212>dna<213>人类(homosapiens)<400>4tctcagactattcatcaatggccagcgaccctggtgcagcctgtgggcagcccgctctct60ctggagtgcactgtggagggaacatcaaaccccaacctatactggtaccgacaggctgca120ggcaggggcctccagctgctcttctactccgttggtattggccagatcagctctgaggtg180ccccagaatctctcagcctccagaccccaggaccggcagttcatcctgagttctaagaag240ctccttctcagtgactctggcttctatctctgtgcctggatgaccgggtggctggctttc300tttggacaaggcaccagactcacagttgtag331<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caggatcctggaccactcag20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gctgtaaaccttccatcttc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7agaccacgtagaactttcct20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tcgaaagaggttccgaggat20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9catactccgattccgcctcc20<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ctgtgatgtgcaggctgaagt21<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cactgtggagggaacatcaa20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tggaggctgagagattctgg20当前第1页12