检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及医学检测领域，特别涉及检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术：

2019年12月8日湖北省武汉市首例不明原因肺炎患者发病，后发现感染源是一种感染人的新型冠状病毒。患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。目前，该病没有特效治疗方法。该病潜伏期一般为3~7天，最短的潜伏期为一天发病，最长的潜伏期是14天。潜伏期具有传染性。主要通过飞沫传播和接触传播，密闭、不通风场所可能存在气溶胶传播风险，需加强预防和隔离处理。人群普遍易感、老年人及有基础疾病者感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。

冠状病毒为不分节段的单股正链rna病毒，属于巢病毒目（nidovirales）冠状病毒科（coronaviridae）正冠状病毒亚科（orthocoronavirinae）。冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径50～200nm。s蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。n蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。

病毒性肺炎多见于冬春季，可散发或暴发流行，临床主要表现为发热、浑身酸痛、少部分有呼吸困难，肺部浸润影。据统计，90%以上的急性呼吸道感染是由病毒引起。主要包括流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒等，可侵犯上呼吸道的不同部位，引起炎症。

流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。据世界卫生组织（who）的数据显示：在全球范围内，每年流感（季节性甲型流感病毒h1n1、h3n2亚型及乙型流感病毒）流行导致数亿人感染，造成约300万至500万严重病例，约29万至65万例与呼吸道疾病相关的死亡。

呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,rsv）在世界各地均有流行，是引起世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的最常见病毒。呼吸道合胞病毒主要通过飞沫传播或直接接触手、污染物而感染，人群普遍易感。呼吸道合胞病毒己成为上呼吸道感染的主要致病微生物之一。

新型冠状病毒（2019-ncov）自爆发以来，仅一个多月的时间，几千例确诊病例，说明该病毒传播速度快，由于其潜伏期也具有传染性，传播范围广，并且疫情合并春运，给防疫工作带来了巨大的困难。加之，冬春季节，各种呼吸道疾病高发，仅靠发热区别患者，或单指标检测是否为新型冠状病毒（2019-ncov），并不足以满足各级医院对患者的分流，需要更强有力的手段，辅助临床，为临床提供更多信息支持。

目前已获证的用于检测新型冠状病毒的方法主要为荧光pcr法，并且为单指标检测，甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测方法主要有荧光pcr法、pcr毛细电泳片段分析法、免疫层析试纸条法。实时荧光pcr技术虽有高灵敏度、高特异性等特点，但该实验对检测人员要求较高且实验操作步骤需要频繁的进行升温和降温过程，需要昂贵的仪器，光检测耗时至少需要1.5h以上，且多数为单指标检测，通量低；pcr毛细电泳片段分析法同样对检测人员要求较高且实验操作步骤频繁耗时；免疫层析试纸条法虽灵敏度较高，但检测结果可能包括假阳性和假阴性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明选择了新型冠状病毒（2019-ncov）s和n靶基因，以及甲型流感病毒、新型甲型h1n1流感病毒（2009）、甲型h3n2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，开发检测产品。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两者以上：

组合一（2019-ncov-s）：

（1）、上游引物具有如seqidno.1所示的核苷酸序列；和

（2）、下游引物具有如seqidno.2所示的核苷酸序列；和

（3）、荧光探针具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；或

（4）、如（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（5）、与（1）、（2）或（3）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合二（2019-ncov-n）：

（6）、上游引物具有如seqidno.4所示的核苷酸序列；和

（7）、下游引物具有如seqidno.5所示的核苷酸序列；和

（8）、荧光探针具有如seqidno.6所示的核苷酸序列；或

（9）、如（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（10）、与（6）、（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合三（infa）：

（11）、上游引物具有如seqidno.7所示的核苷酸序列；和

（12）、下游引物具有如seqidno.8所示的核苷酸序列；和

（13）、荧光探针具有如seqidno.9所示的核苷酸序列；或

（14）、如（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（15）、与（11）、（12）或（13）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合四（infa_2009h1）：

（16）、上游引物具有如seqidno.10所示的核苷酸序列；和

（17）、下游引物具有如seqidno.11所示的核苷酸序列；和

（18）、荧光探针具有如seqidno.12所示的核苷酸序列；或

（19）、如（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（20）、与（16）、（17）或（18）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合五（infa_h3）：

（21）、上游引物具有如seqidno.13所示的核苷酸序列；和

（22）、下游引物具有如seqidno.14所示的核苷酸序列；和

（23）、荧光探针具有如seqidno.15所示的核苷酸序列；或

（24）、如（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（25）、与（21）、（22）或（23）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合六（infb）：

（26）、上游引物具有如seqidno.16所示的核苷酸序列；和

（27）、下游引物具有如seqidno.17所示的核苷酸序列；和

（28）、荧光探针具有如seqidno.18所示的核苷酸序列；或

（29）、如（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（30）、与（26）、（27）或（28）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

和/或

组合七（rsv）：

（31）、上游引物具有如seqidno.19所示的核苷酸序列；和

（32）、下游引物具有如seqidno.20所示的核苷酸序列；和

（33）、荧光探针具有如seqidno.21所示的核苷酸序列；或

（34）、如（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（35）、与（31）、（32）或（33）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个或3个。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物探针组合在制备病毒检测的试剂盒中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。在本发明的一些具体实施方案中，所述流感病毒甲型流感病毒h1n1、h3n2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒（2019-ncov）。

在上述研究的基础上，本发明还提供了病毒检测的试剂盒，包括所述的引物探针组合以及常用的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述病毒为呼吸道病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述呼吸道病毒为流感病毒、鼻病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒或冠状病毒中的一种或多种。在本发明的一些具体实施方案中，所述流感病毒甲型流感病毒h1n1、h3n2亚型或乙型流感病毒；所述冠状病毒为新型冠状病毒（2019-ncov）。

在上述研究的基础上，本发明还提供了呼吸道病毒的检测方法，取待测样本与所述的引物探针组合或所述的试剂盒中的引物探针组合混合后扩增，检测。

本发明提供的试剂盒采用nasba（nuclearacidsequence-basedamplification）恒温扩增技术，基于反转录酶和体外转录酶的协同作用在恒温（41℃）条件下进行反应，使用特异性荧光探针进行实时荧光检测。扩增阳性的结果会产生类似实时荧光的“s”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测。

本发明提供的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）采用完全自主知识产权的、国际先进的微流控基因芯片系统。达到了国际先进水平，具有重要的临床应用价值，与其它检测方法相比本产品具有以下优势：

检测速度快、病毒种类多。除新型冠状病毒2019-ncov外，本产品还可在1.5小时内同时检测其它5种呼吸道常见病毒亚型和甲型流感病毒感染情况，达到快速（比已获批产品快一倍）确认新型冠状病毒、同时排查其它引起相似症状的病毒的目的，实现快速鉴别诊断、及时针对性治疗，大幅度降低目前居高不下的疑似病例数量，大大减轻医院无法确诊病例的负担，使紧缺的大医院救治资源合理的用于新型肺炎病人的救治上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示碟式芯片结构图；

图2示引物筛选结果图；其中，图2（a）示2019-ncov-s引物组1结果图；图2（b）示2019-ncov-s引物组2结果图；图2（c）示2019-ncov-s引物组3结果图；图2（d）示2019-ncov-s引物组4结果图；图2（e）示2019-ncov-s引物组5结果图；图2（f）示2019-ncov-n引物组1结果图；图2（g）示2019-ncov-n引物组2结果图；图2（h）示2019-ncov-n引物组3结果图；图2（i）示2019-ncov-n引物组4结果图；图2（j）示2019-ncov-n引物组5结果图。

具体实施方式

本发明公开了检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的引物与探针组合。

在ncbi数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索并下载待检测的6个指标的基因序列。在引物和探针筛选方面，分析6种病毒的序列，比对后，压缩序列，设计覆盖度高的引物和探针，以便能适应rna病毒的高突变率，通过比对多种型别甲型流感病毒，也设计了甲型流感通用检测引物和探针。为了保证新型冠状病毒（2019-ncov）的检出，专门设计了2套引物探针用于检测其s基因和n基因。经过反复的引物筛选和验证，最终得到7套适合的引物和探针组合，用于检测7种指标。

表1本发明所提供的引物与探针

续表

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所述探针中所有碱基使用2'-o-methyl修饰碱基，探针中t被修饰后变成u；探针的5’端标记有荧光报告集团可以为fam、tet、hex、joe、cy3、cy5、rox、texas、red等，探针的3’端标记有荧光猝灭集团tamara、bhq1、bhq2、cy5等。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的检测方法。其特征是使用上述的nasba引物组与探针组进行恒温扩增。

所述nasba引物组与探针的比例为：1μm上游引物、1μm下游引物、0.1μm探针混合后固定在微流控碟式芯片反应池中。

所述检测方法中还可含有恒温扩增缓冲液、恒温扩增酶溶液和核苷酸混合液。恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：40mm的tris-hcl（ph8.0）、12mm的mgcl2、70mm的kcl、15%的dmso(v/v)、315mm的sorbitol

所述恒温扩增酶溶液的溶剂为50%甘油，溶质及浓度如下：amv逆转录酶0.32u/μl，t7rna聚合酶1.6u/μl，核糖核酸酶h0.008u/μl，rna酶抑制剂0.5u/μl，bsa0.2µg/μl。

所述核苷酸混合液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.15%的peg8000、5mm的dtt、1mm的dntpmix、2mm的rntpmix。

上述nasba扩增反应条件为41℃，40min。

上述的nasba检测方法中，可以在恒温扩增微流控芯片核酸分析仪（rtisochip-a/rtisochip-w）上通过出峰时间以及扩增曲线判定检测结果。

本发明的第三个目的是提供一种用于检测六项呼吸道病毒的检测试剂盒。

本发明所述的检测试剂盒包含预包埋引物和探针的微流控碟式芯片、恒温扩增缓冲液、恒温扩增酶溶液、核苷酸混合液和阳性对照品。

所述预包埋引物和探针的微流控碟式芯片如图1所示，每张芯片上设有24个反应池，逆时针依次编号，其中进出样口1对应的为1号反应池。每张芯片在特定反应池包埋固定1套引物，用于1种核酸靶序列的扩增与检测。微流控碟式芯片反应池中预包埋的nasba引物组与探针的比例为：1μm上游引物、1μm下游引物、0.1μm探针。

所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：40mm的tris-hcl（ph8.0）、12mm的mgcl2、70mm的kcl、15%的dmso(v/v)、315mm的sorbitol

所述恒温扩增酶溶液的溶剂为50%甘油，溶质及浓度如下：amv逆转录酶0.32u/μl，t7rna聚合酶1.6u/μl，核糖核酸酶h0.008u/μl，rna酶抑制剂0.5u/μl，bsa0.2µg/μl。

所述核苷酸混合液的溶剂为水，溶质及浓度如下：0.15%的peg8000、5mm的dtt、1mm的dntpmix、2mm的rntpmix。

所述阳性对照品为：含甲型流感病毒目的片段的病毒样颗粒和新型冠状病毒（2019-ncov）s靶基因核酸。

本发明的优点在于检测速度快、病毒种类多。除新型冠状病毒2019-ncov外，本产品还可在1.5小时内同时检测其它5种呼吸道常见病毒亚型和甲型流感病毒感染情况，达到快速（比已获批产品快一倍）确认新型冠状病毒、同时排查其它引起相似症状的病毒的目的，实现快速鉴别诊断、及时针对性治疗，大幅度降低目前居高不下的疑似病例数量，大大减轻医院无法确诊病例的负担，使紧缺的大医院救治资源合理的用于新型肺炎病人的救治上。

本发明提供的检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用中所用试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、引物和探针组的筛选与制备

检测引物和探针的性能决定了试剂盒检测效果的优劣。本发明针对每个检测指标筛选了多组引物探针组合，最终筛选到一组最优的引物探针组合。本实施例以2019-ncov检测指标为例，说明引物筛选过程。

引物设计：

针对2019-ncov病毒的s基因和n基因分别设计引物和探针（表2），通过试验筛选出引物与探针组合检测效果最优的一组，所用引物和探针序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2用于检测2019-ncov病毒的引物和探针序列

续表

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上述的引物与探针组合中，各单链dna均各自独立包装。

实验样本：

本单位自制并经过测序验证的2019-ncov病毒s基因和n基因rna裸核酸作为检测样本。

实验设计：

以2019-ncov病毒s基因和n基因rna裸核酸(1×10⁴copies/μl)为模板，分别采用制备的引物与探针组对模板进nasba等温扩增检测，每组引物进行3次重复。

试验仪器：

超净工作台

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯rtisochip^tm-a或rtisochip^tmw

加热离心机：mini-smartcentrifuge

漩涡振荡器

离心机：minispin

实验步骤：

扩增反应体系如表3：

表3

用移液器吸取55μl配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。

取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40min，配套软件同时完成实时荧光扫描。

实验结果：

引物筛选结果如图2所示，图2（a）~图2（j）每张图中的三条扩增曲线为三次重复实验的结果。结果显示，2019-ncov-s引物组1和2019-ncov-n引物组2与其它引物组相比：三次重复实验扩增曲线为典型的s型，且出峰时间最早，三次重复结果最好。

实施例2、试剂盒准确性和特异性分析

实验样本：

为了验证试剂盒的准确性和特异性，选取了部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品（表4）、2019-ncov核酸检测试剂国家参考品（表5）以及sars质粒载体（来源于广州医科大学呼吸疾病国家重点实验室），对试剂盒进行检测。

表4流感病毒国家标准品

表52019-ncov核酸检测试剂国家参考品

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实验设计：

采用部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品和2019-ncov核酸检测试剂国家参考品对六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）检测各指标的准确性和特异性。

试验仪器：

超净工作台

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯rtisochip^tm-a或rtisochip^tmw

加热离心机：mini-smartcentrifuge

漩涡振荡器

离心机：minispin

实验步骤：

扩增反应体系如表6：

表6

用移液器吸取55μl配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。

取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40min，配套软件同时完成实时荧光扫描。

实验结果：

本试剂盒对流感国家参考品阳性参考品pc01、pc02、pc04~pc09和阴性参考品nc01~nc10检测结果均与理论结果相符，详细结果见表7和表8。本试剂盒对2019-ncov核酸检测试剂国家参考品中的阳性参考品和阴性参考品检测，p1~p5正确检出。p7为质粒dna，不适用于nasba技术。n1-n22参考品检测结果均与预期符合，详细结果见表9至表11。以上检测结果表明本试剂盒无交叉反应性，准确性和特异性良好。

表7第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果

（pc01、pc02、pc04-pc09）

表8第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果

（nc01-nc10）

表92019-ncov新型冠状病毒国家参考品检测结果（p1-p7）

表102019-ncov新型冠状病毒国家参考品检测结果（n1-n11）

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表112019-ncov新型冠状病毒国家参考品检测结果（n12-n22）

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实施例3、试剂盒最低检测限分析

实验样本：

为了验证试剂盒的最低检测限，以本单位自制并经过测序验证的6种呼吸道病毒裸核酸作为检测样本，因甲型流感为通用指标，因此新型甲型h1n1流感病毒（2009）裸核酸和甲型h3n2流感病毒裸核酸均能检测到甲型流感病毒，样本信息如表12。

表12试剂盒最低检测限样品信息

实验设计：

最低检测限浓度的确定方法：将6种呼吸道病毒裸核酸参考品（rp1～rp6），分别稀释至250copies/μl、25copies/μl、10copies/μl，并对以上浓度的裸核酸参考品进行检测。每个浓度做1个重复，将所有的指标阳性检出率均能达到为100%的最低浓度确定为本试剂盒的最低检测限。

试验仪器：

超净工作台

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯rtisochip^tm-a或rtisochip^tmw

加热离心机：mini-smartcentrifuge

漩涡振荡器

离心机：minispin

实验步骤：

扩增反应体系如表13：

表13

用移液器吸取55μl配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。

取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40min，配套软件同时完成实时荧光扫描。

实验结果：

试剂盒检测结果分别见表14，统计试剂盒对6种呼吸道病毒裸核酸3个浓度的检测结果可以看出：试剂盒对部分指标的裸核酸rna的最低正确检出浓度可达10copies/μl，对其余指标的最低正确检出浓度为25copies/μl。为了保证本试剂盒的有效性，我们在统计时取所有最低正确检出浓度值中的最大值，即认为本试剂盒对呼吸道病毒裸核酸的最低检测限为25copies/μl。对于本试剂盒的芯片，每个反应池中大约能进入1μl的样品，所以最低检测限也可以定义为25copies/反应。

表14试剂盒对呼吸道病毒最低检测参考品限检测结果

续表

实施例4、试剂盒精密度分析

实验样本：

使用流感病毒国家精密性参考品cv1和cv2以及本单位自制并经过测序验证的新型冠状病毒2019-ncov-s基因rna裸核酸和n基因rna裸核酸混合参考品（浓度为5×10³copies/ml）进行试剂盒精密度检测。

实验设计：

采用部分第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家精密性参考品和新型冠状病毒2019-ncov-s基因rna裸核酸和n基因rna裸核酸混合参考品对六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）检测各指标的精密性进行评估。

试验仪器：

超净工作台

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：晶芯rtisochip^tm-a或rtisochip^tmw

加热离心机：mini-smartcentrifuge

漩涡振荡器

离心机：minispin

实验步骤：

扩增反应体系如表15：

表15

用移液器吸取55μl配制好的上述核酸扩增反应体系，从进样口1匀速注入到芯片主通道中，待其充满芯片主通道（此时出样口有液体溢出）后，即停止加样，用无尘纸拭去多余液体。

取1张封口膜，覆盖于进出样口上，并用洁净吸头（倒置）向一个方向按压封口膜至贴合紧密。将上述加样后的芯片置于芯片加热离心机中离心后，迅速置于微流控芯片核酸分析仪仓盒中进行扩增。设置41℃，恒温扩增反应40min，配套软件同时完成实时荧光扫描。

实验结果：

本试剂盒对流感病毒国家参考品cv1和cv2分别重复检测10次，10次重复均能正确检出，cv1检测10次的cv值为5.19%，cv2检测10次的cv值为：甲型流感病毒（6.43%）、新型甲型h1n1流感病毒（2009）（5.79%）、甲型h3n2流感病毒（6.02%），具体见表16和表17。

表16第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果

（cv1）

续表

表17第二代甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品检测结果

（cv2）

续表

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本试剂盒对新型冠状病毒2019-ncov-s基因rna裸核酸和n基因rna裸核酸混合参考品重复检测10次，结果与预期一致，重复性实验扩增tp值见表18。该实施例结果表明，试剂盒重复性良好。

表18新型冠状病毒（2019-ncov）s基因和n基因重复性实验扩增tp值结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>博奥生物集团有限公司

<120>检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用

<130>mp2003990

<160>45

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caaatacttctaaccaggttgctg24

<210>2

<211>52

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aattctaatacgactcactatagggagaacacgccaagtaggagtaagttga52

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cccgtcagaagtccctgttgctattcatgcacggg35

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aattctaatacgactcactatagggagaatggcagctgtgtaggtcaacc50

<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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cgcgtttgagggtctcccaatagagcatcacgcg34

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ccaaaactgtttcacccatt20

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<212>dna

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aattctaatacgactcactatagggagaacaataaacagagaggtatc48

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tttatdatyccacgattttt20

<210>20

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

aattctaatacgactcactatagggagaatgaacagtttracattacc48

<210>21

<211>38

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<213>人工序列(artificialsequence)

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cccgtgagctgcttayrtctgtttttgadgtcaacggg38

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<212>dna

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ggggctgaacatgtcaacaactc23

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aattctaatacgactcactatagggagagccagcatctgcaagtgtcac49

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<212>dna

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<210>34

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tcttggttcaccgctctcact21

<210>35

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aattctaatacgactcactatagggagatggtcatctggactgctattgg50

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gcatcatatgggttgcaactg21

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<213>人工序列(artificialsequence)

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aattctaatacgactcactatagggagacacgattgcagcattgttagc49

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<400>44

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<213>人工序列(artificialsequence)

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