1.本发明属于生物技术领域，涉及一种印迹脂肪酶及其应用，特别是印迹脂肪酶在发酵法制备高光学纯度l-乳酸中的应用。
背景技术：
2.乳酸，又称α-羟基丙酸，是自然界中的三大有机酸之一，作为一种重要原料被广泛地应用于食品、药品、化工和材料等领域。近年来，随着温室效应和环境污染的加剧，由乳酸单体聚合制备的聚乳酸(pla)材料广泛受到人们的关注。聚乳酸能够在特定条件下降解为小分子，产生二氧化碳和水，能够缓解白色污染造成的环境压力，改善生态环境。并且聚乳酸安全无毒，抗菌透气，具有良好的力学性能和加工性能，可用于食品包装袋、餐盒、纺织品、工程塑料等。因此，聚乳酸材料已经逐渐成为一项市场广阔的可降解塑料产品。乳酸按照旋光度可以分为l型和d型，乳酸单体的光学纯度决定着聚乳酸的物理性质和使用性能，一般要求单体的光学纯度达到99.5％以上。因此随着生物可降解塑料的推广，高光学纯度l-乳酸的需求量也将逐渐增大。
3.目前，l-乳酸的主流制备方法为发酵法。某些微生物(如乳酸杆菌、芽孢杆菌、米根霉等)在特定的温度和通氧条件下将葡萄糖或淀粉原料转化为乳酸产品。与化学法相比，发酵法具有原料成本低、环保、低污染等优势。但是，微生物在发酵过程中的代谢产物比较复杂，除了l-乳酸之外还有少量d-乳酸，它们会影响乳酸的光学纯度，进而影响聚乳酸的品质和应用性能。通过普通的化工分离单元操作很难将光学异构体分开。
4.手性拆分，是指通过合适的拆分方法来分离光学异构体混合物，得到需要的手性物质的构型的方法。手性拆分方法主要有色谱法、酶法、结晶法、化学拆分法等等，其中酶法拆分是指利用酶的特异性与酶与光学异构体之间能相互识别，先生成不同的衍生化合物，再把异构体相互分开，该方法具有众多的优点：商业酶种类广泛选择多、成本低廉，在有机溶剂中稳定性好、选择性高，催化条件温和、环境污染小，操作简便等。以往的酶法拆分主要是应用天然酶分子，例如用青霉素酰化酶制备(s)-2-氨基丁醇，天然酶分子受限于种类，能够制备的产品种类很少。近年来，随着分子印迹酶技术的快速发展，酶可以“记忆”目标分子的构型，从而制备更多种类构型的分子。生物印迹首先将酶与模板分子共溶于溶液中，使得酶改变构象与配体有机结合，处于激活状态，然后通过冷冻干燥或固定化技术将这种活性构象固定，再将模板洗去。最终得到的生物印记酶可保持这一高活性构象。生物印迹酶的最大优势在于可以“按需设计”其结构，可根据目标产物的需求，对印迹模板进行筛选，从而得到具有更高特异选择性的印迹酶。
技术实现要素：
5.本发明主要解决的技术问题是现有的乳酸发酵产品中l-乳酸光学纯度较低(一般只有98％)，杂质含量多，分离困难的问题。
6.为解决上述技术问题，本发明提供一种制备印迹脂肪酶的方法，包括以高光学纯
度l-乳酸作为印迹模板对脂肪酶进行生物印迹的步骤；
7.所述高光学纯度l-乳酸的光学纯度为99.5％以上。
8.在一个实施方案中，上述方法中，所述生物印迹包括将所述脂肪酶溶解在缓冲液中，加入所述高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，混匀，冷冻后冻干，再加入碳原子数为1-4的醇洗涤除去印迹模板，同时沉淀得到印迹脂肪酶的步骤。
9.在一个实施方案中，上述方法中，所述脂肪酶与所述高光学纯度l-乳酸的质量比为1:5-3:1。
10.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述脂肪酶与所述缓冲液的质量体积比为10mg:1ml-50mg:1ml。
11.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述碳原子数为1-4的醇与所述缓冲液的体积比为5:1-10:1。
12.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述脂肪酶为天然来源的脂肪酶，优选为南极假丝酵母脂肪酶b、猪胰腺脂肪酶或黑曲霉脂肪酶。
13.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述缓冲液为磷酸缓冲液，优选为ph7.0,10mm的磷酸缓冲液。
14.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述碳原子数为1-4的醇为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇，优选为异丙醇。
15.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，所述混匀条件为4℃、300-500rpm混匀20-40min。
16.在一个实施方案中，上述任一所述的方法中，在沉淀得到印迹脂肪酶后还包括将酶液进行干燥的步骤。
17.为解决上述技术问题，本发明还提供根据上述任一所述的方法制备得到的印迹脂肪酶。
18.为解决上述技术问题，本发明还提供一种将上述印迹脂肪酶进行固定的方法，该方法采用交联酶聚体技术对印迹脂肪酶进行固定，包括在所述印迹脂肪酶的溶液中加入交联剂，混匀，离心得到沉淀分子印迹化交联酶聚体的步骤；
19.优选地，所述交联剂为smcc(含有n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂)。
20.在一个实施方案中，上述固定方法中，所述印迹脂肪酶的溶液为印迹脂肪酶的异丙醇溶液。
21.在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述smcc的添加量为0.05-0.1g/100ml异丙醇。
22.在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述混匀的条件为300-500rpm混匀20-40min。
23.在一个实施方案中，上述任一所述的固定方法中，所述离心得到沉淀之后还有用有机溶剂(优选为异丙醇)离心洗涤沉淀的步骤。
24.为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法制备得到的分子印迹化交联酶聚体；所述分子印迹化交联酶聚体的酶活为20-100u。
25.为解决上述技术问题，本发明还提供一种用发酵法制备高光学纯度l-乳酸的方
法，包括将产乳酸的菌种进行发酵，在无氧发酵过程中加入上述分子印迹化交联酶聚体和乙醇，使得所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶特异性催化发酵液中的l-乳酸与乙醇反应得到l-乳酸乙酯，发酵结束后将发酵液中的菌体去除，再将去除菌体后的发酵液通过溶剂萃取提取l-乳酸乙酯，通过反应精馏水解l-乳酸乙酯得到高光学纯度l-乳酸；所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶不催化d-乳酸与乙醇反应。
26.在一个实施方案中，上述发酵方法中，所述菌种为乳酸杆菌(lactobacillus)属的嗜热乳杆菌(lactobacillus thermophilus)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，大肠杆菌(escherichia coli)，乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)或粪肠球菌(enterococcus faecalis)。
27.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，基于发酵液的体积，所述分子印迹化交联酶聚体的添加量为0.5-5g/100ml。
28.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，所述发酵采用先有氧扩增，再无氧产酸的方式，即包括先有氧发酵之后再无氧发酵的步骤；
29.所述有氧发酵和无氧发酵的发酵培养基的组成为：葡萄糖50-200g/l，酵母浸粉0.5-5g/l，磷酸二氢钾2-10g/l，磷酸氢二铵2-10g/l，硫酸镁0.2-0.8g/l，氯化钙0.1-0.8g/l，氯化锌0.01-0.02g/l，余量为水；
30.所述有氧发酵过程中，培养温度为30℃，通风量为1.0-5.0vvm，搅拌速率为200-250rpm，发酵时间为12-20小时。
31.在一个实施方案中，上述发酵方法中，所述无氧发酵过程中关闭通风，向发酵体系中加入终浓度为50-200g/l的葡萄糖，加入所述分子印迹化交联酶聚体，采用流加葡萄糖溶液的方式进行碳源补料，并向发酵液中同时流加无水乙醇，使得所述分子印迹化交联酶聚体中的印迹脂肪酶特异性催化发酵液中的l-乳酸与乙醇反应得到l-乳酸乙酯；
32.所述流加葡萄糖溶液为以3g/h-5g/h流加40g/100m的葡萄糖溶液；
33.所述无水乙醇的流加速率为葡萄糖溶液流加速率的90％。
34.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，在无氧发酵中流加葡萄糖溶液和无水乙醇16-32h后，停止流加葡萄糖溶液，进行后发酵，直至葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
35.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，在有氧发酵之前，还具有种子培养的步骤，种子液以2-10％的接种量接入有氧发酵的发酵培养基中；
36.所述种子培养中的种子培养基的组成可以为：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁0.8g/l，余量为水；
37.所述种子培养的培养温度为30℃，搅拌速率为250rpm，培养时间为14-20小时。
38.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，所述菌体去除是采用板框过滤，板框过滤机的滤布孔径为0.05-0.2μm，过滤压力0.3-1.0mpa。
39.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，所述溶剂萃取提取l-乳酸乙酯中使用的萃取剂为正己烷，正己烷与发酵液的体积比为0.1:10-3:10。
40.在一个实施方案中，上述任一所述的发酵方法中，所述反应精馏填料为强酸性离子吸附树脂，优选为强酸性d001离子吸附树脂，反应精馏过程的回流比为1:1-10:1；精馏塔
塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇，塔底采出高光学纯度l-乳酸，其中乙醇可以回用于发酵阶段；最终得到的l-乳酸光学纯度为99.5-99.9％。
41.为解决上述技术问题，本发明还提供上述印迹脂肪酶和/或上述分子印迹化交联酶聚体在制备l-乳酸中的应用；尤其是在发酵法制备高光学纯度l-乳酸中的应用。
42.本发明利用生物印迹酶的手性拆分技术拆分发酵过程中生成的l-乳酸和d-乳酸，来制备高光学纯度l-乳酸。首先选用高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，对脂肪酶进行改造，并且结合交联酶聚体技术对酶进行固定，得到高活性的分子印迹化交联酶聚体。乳酸发酵过程中，外加无水乙醇，在分子印迹化交联酶聚体的作用下，l-乳酸与乙醇分子发生反应生成l-乳酸乙酯，而d-乳酸无法被分子印迹化交联酶聚体识别，则不发生酯化反应。发酵结束后，通过萃取法提纯l-乳酸乙酯，进一步通过反应精馏的方式能够将l-乳酸乙酯水解，得到高光学纯度l-乳酸，水解得到的乙醇可回用于发酵阶段。
43.本发明制备的分子印迹化交联酶聚体的酶活高，同时本发明的采用该交联酶聚体的发酵制备l-乳酸的方法得到的l-乳酸光学纯度高，并且不需要对菌株进行改造，操作简便，成本低廉，能够适用于高光学纯度l-乳酸的工业化生产。
具体实施方式
44.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
45.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
47.高光学纯度l-乳酸(光学纯度＞99.5％)为sigma公司产品，货号为l1750。
48.南极假丝酵母脂肪酶b为诺维信公司产品，货号为novocor b，酶活为30单位/毫克蛋白。
49.猪胰腺脂肪酶为sigma公司产品，货号为l3126，酶活为50单位/毫克蛋白。
50.黑曲霉脂肪酶为杭州创科生物科技有限公司产品，酶活为50单位/毫克蛋白。
51.凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cicc 23843。
52.smcc为大连美仑生物技术有限公司产品，货号为mb0442，smcc是一类含有n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂。
53.强酸性d001离子吸附树脂为上海华震科技有限公司产品，货号为d001。
54.分子印迹化交联酶聚体的酶活检测：
55.采用转酯反应来检测分子印迹化交联酶聚体的酶活。酶活力定义为：在30℃下，每小时单位质量的分子印迹化交联酶聚体催化乳酸甲酯和乙醇转酯化合成乳酸乙酯的微摩尔数，u。将200mg分子印迹化交联酶聚体溶于4ml水中，并分别加入40μl乳酸甲酯和100μl乙醇，在30℃水浴条件下反应，搅拌速率为250rpm，反应时间为1小时。用高效液相色谱检测乳酸乙酯的生成量。酶活计算公式为：
56.u＝(反应生成的乳酸乙酯的摩尔浓度
×
4ml)/(0.02g
×
1h)
57.高效液相色谱检测乳酸乙酯的检测条件如下：安捷伦c18反相色谱柱5μm(4.6mm
×
250mm)；流动相为5mm的稀硫酸与甲醇的混合液(体积比为95:5)，流速为0.7ml/min；柱温35
℃；采用紫外检测，检测波长为214nm。采用外标法计算得到乳酸乙酯的摩尔浓度。
58.高效液相色谱检测l-乳酸的检测条件如下：chiracel od-h手性色谱柱(5μm，4.6mm
×
250mm，日本diacel公司)；柱温30℃；流动相为正己烷和异丙醇的混合液(体积比96:4)，流速为0.7ml/min；采用紫外检测，检测波长为254nm。
59.l-乳酸光学纯度采用面积归一化法定量，计算公式如下：
60.l-乳酸的光学纯度＝[a
l
/(a
l
+a
d
)]
×
100％
[0061]
其中：a
l
为试样中l-乳酸的峰面积值；a
d
为试样中d-乳酸的峰面积值。
[0062]
实施例1
[0063]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0064]
称取100mg南极假丝酵母脂肪酶b溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0，10mm)中，加入500mg高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、400rpm条件下混匀20min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入50ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.05g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。400rpm条件下混匀20min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉淀中加入50ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0065]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为70u。
[0066]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0067]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养16小时后，得到种子液。
[0068]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖150g/l、酵母浸粉3g/l、磷酸二氢钾6g/l、磷酸氢二铵2g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化钙0.6g/l、氯化锌0.01g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以10％(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中进行有氧发酵，培养温度30℃，通风量为1.0vvm，搅拌速率为200rpm，发酵时间为18小时。
[0069]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为150g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照0.5g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速4.5g/h流加40g/100ml的葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速4.05g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续20小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
[0070]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0071]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.1μm，过滤压力为0.5mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为1:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。将该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为7:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可
回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0072]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.9％。
[0073]
实施例2
[0074]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0075]
称取200mg南极假丝酵母脂肪酶b溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0,10mm)中，加入300mg高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、300rpm条件下混匀25min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入80ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.07g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。300rpm条件下混匀25min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉淀中再次加入80ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0076]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为90u。
[0077]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0078]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养20小时后，得到种子液。
[0079]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖200g/l、酵母浸粉2.5g/l、磷酸二氢钾2g/l、磷酸氢二铵4g/l、硫酸镁0.2g/l、氯化钙0.1g/l、氯化锌0.02g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以6％(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中进行有氧发酵，培养温度30℃，通风量为3.0vvm，搅拌速率为250rpm，发酵时间为16小时。
[0080]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为200g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照2g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速5g/h流加40g/100ml葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速4.5g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续32小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
[0081]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0082]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.05μm，过滤压力为1mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为0.1:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。将该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为5:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0083]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.5％。
[0084]
实施例3
[0085]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0086]
称取400mg猪胰腺脂肪酶溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0，10mm)中，加入900mg高光
学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、500rpm条件下混匀35min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入90ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.09g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。500rpm条件下混匀35min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉淀中加入90ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0087]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为100u。
[0088]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0089]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养16小时后，得到种子液。
[0090]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖100g/l、酵母浸粉0.5g/l、磷酸二氢钾10g/l、磷酸氢二铵8g/l、硫酸镁0.4g/l、氯化钙0.8g/l、氯化锌0.015g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以4％(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中发酵培养，培养温度30℃，通风量为3.0vvm，搅拌速率为250rpm，发酵时间为16小时。
[0091]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为100g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照3g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速3g/h流加40g/100ml的葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速2.7g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续28小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
[0092]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0093]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.2μm，过滤压力为0.8mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为2:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。将该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为8:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0094]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.7％。
[0095]
实施例4
[0096]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0097]
称取300mg黑曲霉脂肪酶溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0，10mm)中，加入700mg高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、400rpm条件下混匀40min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入100ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.10g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。400rpm条件下混匀40min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉
淀中加入100ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0098]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为40u。
[0099]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0100]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养14小时后，得到种子液。
[0101]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖120g/l、酵母浸粉4g/l、磷酸二氢钾8g/l、磷酸氢二铵6g/l、硫酸镁0.6g/l、氯化钙0.8g/l、氯化锌0.015g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以6％(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中进行有氧发酵，培养温度30℃，通风量为4.0vvm，搅拌速率为200rpm，发酵时间为12小时。
[0102]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为120g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照1g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速3.5g/h流加40g/100ml的葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速3.15g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续24小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量将至0.5g/l以下结束发酵。
[0103]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0104]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.05μm，过滤压力为0.7mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为0.5:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。将该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为10:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0105]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.5％。
[0106]
实施例5
[0107]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0108]
称取500mg黑曲霉脂肪酶溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0，10mm)中，加入800mg高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、500rpm条件下混匀30min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入60ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.08g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。500rpm条件下混匀30min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉淀中加入60ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0109]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为20u。
[0110]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0111]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸
二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养20小时后，得到种子液。
[0112]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖150g/l、酵母浸粉5g/l、磷酸二氢钾4g/l、磷酸氢二铵2g/l、硫酸镁0.2g/l、氯化钙0.2g/l、氯化锌0.02g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以2％(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中进行有氧发酵，培养温度30℃，通风量为3.0vvm，搅拌速率为250rpm，发酵时间为16小时。
[0113]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为150g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照5g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速4.5g/h流加40g/100ml的葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速4.05g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续30小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
[0114]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0115]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.1μm，过滤压力为0.3mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为3:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。将该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为3:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0116]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.8％。
[0117]
实施例6
[0118]
一、分子印迹化交联酶聚体的制备
[0119]
称取300mg猪胰腺脂肪酶溶解在10ml磷酸缓冲液(ph7.0，10mm)中，加入100mg高光学纯度l-乳酸作为印迹模板，于4℃、300rpm条件下混匀20min，然后加入液氮或放入超低温冰箱中冷冻过夜，随后移入真空冷冻干燥机冻干。向冻干后的酶粉中加入100ml异丙醇试剂，得到异丙醇酶液，其中异丙醇试剂作为沉淀剂沉淀酶蛋白分子，同时作为洗涤剂除去印迹模板。再向异丙醇酶溶液中加入0.10g/100ml(以异丙醇的体积计)的smcc作为交联剂进行交联。300rpm条件下混匀20min后，于4℃、6000rpm条件下冷冻离心20min。弃去上清，在沉淀中加入100ml异丙醇试剂，4℃、8000rpm离心洗涤3次。最后将洗涤后的样品真空干燥，即得到分子印迹化交联酶聚体。
[0120]
经过酶活检测，制备得到的分子印迹化交联酶聚体的酶活为80u。
[0121]
二、凝结芽孢杆菌的发酵
[0122]
种子培养：种子培养基的配方为：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾2g/l、硫酸镁0.8g/l，余量为水。将种子培养基在121℃高温灭菌20min后，将凝结芽孢杆菌从甘油菌接种至种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养18小时后，得到种子液。
[0123]
有氧阶段培养：配制一定量的发酵培养基于发酵罐中，发酵培养基的配方为：葡萄糖50g/l、酵母浸粉2g/l、磷酸二氢钾6g/l、磷酸氢二铵10g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化钙0.4g/l、氯化锌0.01g/l，余量为水。将发酵培养基121℃高温灭菌30min，将制备的种子液以8％
(体积比)的接种量于无菌条件下加入发酵培养基中进行有氧发酵，培养温度30℃，通风量为5.0vvm，搅拌速率为200rpm，发酵时间为20小时。
[0124]
无氧阶段培养：有氧阶段培养结束后，关闭空气压缩机，关闭发酵罐的进风管和出风管，向发酵体系中加入终浓度为50g/l的葡萄糖，并且向发酵液中按照4g/100ml加入步骤一制备的分子印迹化交联酶聚体，使得在进行无氧发酵产生乳酸的同时，在分子印迹化交联酶聚体的作用下将l-乳酸和乙醇转化为l-乳酸乙酯。在无氧发酵过程中恒速4g/h流加40g/100ml的葡萄糖溶液(已经115℃灭菌30min)，同时恒速3.6g/h流加无水乙醇，葡萄糖溶液和无水乙醇的流加补料持续16小时后停止葡萄糖，再进行后发酵一段时间，直到葡萄糖含量降至0.5g/l以下结束发酵。
[0125]
三、高光学纯度l-乳酸的精制
[0126]
发酵结束后，用板框过滤机去除菌体，滤布的滤径为0.2μm，过滤压力为0.9mpa。去除菌体后的发酵液进入萃取塔，加入正己烷(正己烷与发酵液的体积比为2:10)进行萃取，得到的萃取相即为l-乳酸乙酯的正己烷溶液。该溶液进入装有强酸性d001离子吸附树脂填料的精馏塔中进行反应精馏精制，回流比为1:1，塔顶采出正己烷，侧线采出乙醇(乙醇可回用于发酵阶段)，塔底采出高光学纯度l-乳酸。
[0127]
经光学纯度检测，最终得到的l-乳酸光学纯度为99.9％。