一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记和方法与流程

本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr的分子标记和方法。

背景技术：

水稻是起源于热带和亚热带地区的农作物，因此对低温胁迫非常敏感，尤其是苗期和孕穗期，这是限制水稻种植区域的一个主要因素。在水稻的种植过程中，由于人工的驯化和选择使粳稻种植区域延伸到年积温较低的温带和寒带地区。

中科院植物研究所种康研研究组与中国水稻研究所钱前研究组以及其他合作者分析了127个不同水稻品种和野生稻中cold1基因序列，发现了7个snp位点，其中粳稻特异的snp2影响了cold1蛋白活性而赋予粳稻耐寒性。研究发现，包含粳稻cold1基因的籼稻近等基因系以及超表达该基因的粳稻材料都显著增强了耐寒性，而功能缺失突变体cold1-1或rnai株系却对低温非常敏感。cold1基因编码一个g-蛋白信号调节因子，定位于细胞质膜和内质网。水稻处于低温胁迫是，cold1蛋白与g-蛋白α亚基rga互作，激活ca2+通道，触发下游耐寒防御反应，使g-蛋白gtp酶活性增强。该成果揭示了通过驯化得到的cold1等位基因和特异snp赋予水稻耐寒性的新机制。粳型cold1等位基因可直接用于对超级杂交稻亲本9311和其它籼粳稻的耐寒性改良，对基于分子辅助育种培育水稻耐寒新品种具有重要的应用前景(may,etal.,cold1conferschillingtoleranceinrice,cell.,2015,160:1-13)。

聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerasechainreaction/ligasedetectionreaction,pcr/ldr)是今年来发展起来的一种核酸检测技术，该方法具有较高灵敏度、准确度，并且该方法能够实现多个遗传位点的同时检测，实现较高通量的基因型检测，在医学广泛的用于疾病的诊断(gibrielaaetal.，advancesinligasechainreactionandligation-basedamplificationsforgenotypingassays:detectionandapplications.mutatres.,2017,773:66-90)。本发明利用pcr/ldr技术，开发了用于鉴定cold1基因型的分子标记方法，可用于快速的鉴定水稻种质资源和育种群体中cold1的基因型，相对于传统的分子标记方法具有经济、高效和高准确率的优势。

技术实现要素：

本发明的技术问题：籼型和粳型cold1基因第四个外显子中的一个单核苷酸多态性位点snp2，在snp2位点，粳稻为一个碱基a,而大多数的籼稻为碱基t。基于此，本发明针对传统基于pcr、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐，不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点，设计了一种基于pcr/ldr技术的分子标记，用于快速、准确的鉴定cold1基因的基因型，为筛选鉴定携带有粳型cold1等位基因水稻种质资源和耐低温胁迫水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。

本发明第一个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对pcr引物和三条ldr探针，其中，所述pcr引物序列为：

正向引物序列：5’-cacacagtgtgctttgatttc-3’；(seqidno.1)

反向引物序列：5’-atgtctccatggattgcatg-3’；(seqidno.2)

所述ldr探针包括一条荧光标记探针probe-fam，一条籼型等位基因特异探针probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针probe-jap：

所述荧光标记探针probe-fam序列如seqidno.3所示：

5’-p-tttcatcaatttccctgtaatttttttttttttttttttt-fam-3’；

所述籼型等位基因特异探针probe-ind序列如seqidno.4所示：

5’-ttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcca-3’；

所述粳型等位基因特异探针probe-jap序列如seqidno.5所示：

5’-tttttttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcct-3’。

优选地，所述荧光标记探针probe-fam由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸t组成，寡聚核苷酸t的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸t的长短来调节ldr产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行fam荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。

优选地，所述籼型等位基因特异探针probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸t和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述粳型等位基因特异探针probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸t和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性snp位点配对。

本发明第二个目的在于提供上述分子标记在水稻育种过程对耐低温基因cold1基因型的鉴定中的应用。

本发明第三个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)水稻植株基因组dna的提取；

(2)利用pcr引物对水稻植株基因组dna进行pcr扩增；所述pcr引物序列为：

正向引物序列：5’-cacacagtgtgctttgatttc-3’；(seqidno.1)反向引物序列：5’-atgtctccatggattgcatg-3’；(seqidno.2)

(3)以pcr扩增产物为模板，用ldr探针进行ldr反应；所述ldr探针包括一条荧光标记探针probe-fam，一条籼型等位基因特异探针probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针probe-jap：

所述荧光标记探针probe-fam序列如seqidno.3所示：

5’-p-tttcatcaatttccctgtaatttttttttttttttttttt-fam-3’

所述籼型等位基因特异探针probe-ind序列如seqidno.4所示：

5’-ttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcca-3’

所述粳型等位基因特异探针probe-jap序列如seqidno.5所示：

5’-tttttttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcct-3’；

(4)ldr反应产物用abi3730测序仪对ldr反应产物测序，根据ldr产物的大小确定检测水稻样品的基因型。

本发明提供的鉴定cold1基因型的方法具体可包括以下步骤：

(1)水稻植株叶片基因组dna的提取：取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×ctab溶液(1.5％ctab，75mmtris-hcl，15mmedta，1.05mnacl，ph8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解dna，放-20℃冰箱备用。

(2)pcr扩增体系：25μl的pcr反应体系包括50ng水稻基因组dna，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mmtris-hcl(ph＝8.8),1.5mmmgcl2,50mmkcl,0.8％(v/v)np-40,datp、dgtp、dctp和dttp200μm，以及5uoftaqdna聚合酶。pcr反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。

(3)ldr反应体系：10μl的ldr反应体系包括50mmtris-hcl(ph7.5)；10mmmgcl2；10mmdtt；1mmnad⁺；3条ldr探针各ldr0.2pmol；2u的taqdna连接酶；4μl的pcr产物。ldr反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。反应结束后的ldr产物用abi3730dna测序仪分析，根据fam荧光峰值的位置确定检测样品的cold1基因型。若fam荧光峰值在81个碱基的位置，则对应样品的cold1基因型为籼型。若fam荧光峰值在86个碱基的位置；则对应样品的cold1基因型为粳型；若存在81和86两个峰，则对应样品的cold1基因型为杂合型。

本发明与现有技术相比，其有效效果为：

本发明提供的一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的分子标记方法，采用pcr关联ldr方法(聚合链式酶反应关联连接酶检测反应)进行检测，本发明提供的方法能够方便的实现水稻耐低温cold1基因的分型，得到的结果具有可靠、稳定、操作简便、快速的特点，适用于较多样品的高通量检测，在水稻种质资源耐低温基因cold1的基因型鉴定，和耐低温水稻新品种的分子辅助育种中有较大的应用价值。

附图说明

图1为申繁14和9311中cold1基因的snp2位点测序结果。

图2为实施例1的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

1、水稻材料

申繁14是三系杂交粳稻花优14的恢复系，9311是超级杂交稻亲本籼稻品种，我国在2002年完成了9311的全基因组草图，通过测序发现申繁14和931中cold1基因的snp2位点分别为a和t,表明申繁14和9311分别携带粳型和籼型的cold1基因(图1)，所使用的f1来源于申繁14与9311的杂交。

2、水稻基因组dna提取：

申繁14、9311及其杂交f1代水稻植株各取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×ctab溶液(1.5％ctab，75mmtris-hcl，15mmedta，1.05mnacl，ph8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解dna，放-20℃冰箱备用。

3、pcr扩增：

pcr引物序列为：

正向引物序列：5’-cacacagtgtgctttgatttc-3’；(seqidno.1)

反向引物序列：5’-atgtctccatggattgcatg-3’；(seqidno.2)；

申繁14、9311及其杂交f1代水稻基因组dna，进行pcr扩增，所用pcr正向引物如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。pcr扩增体系：25μl的pcr反应体系包括50ng水稻基因组dna，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mmtris-hcl(ph＝8.8),1.5mmmgcl2,50mmkcl,0.8％(v/v)np-40,datp、dgtp、dctp和dttp200μm，以及5uoftaqdna聚合酶。pcr反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。

4、对pcr扩增产物进行ldr反应：

ldr探针包括一条荧光标记探针probe-fam，一条籼型等位基因特异探针probe-ind，和一条粳型等位基因特异探针probe-jap：

荧光标记探针probe-fam序列如seqidno.3所示：

5’-p-tttcatcaatttccctgtaatttttttttttttttttttt-fam-3’

籼型等位基因特异探针probe-ind序列如seqidno.4所示：

5’-ttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcca-3’

粳型等位基因特异探针probe-jap序列如seqidno.5所示：

5’-tttttttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcct-3’；

ldr反应体系：10μl的ldr反应体系包括50mmtris-hcl(ph7.5)；10mmmgcl2；10mmdtt；1mmnad⁺；3条ldr探针各ldr0.2pmol；2u的taqdna连接酶；4μl的pcr产物。ldr反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。

ldr反应产物的检测：

反应结束后的ldr产物用abi3730dna测序仪分析，根据fam荧光峰值的位置确定检测样品的cold1基因的基因型。若fam荧光峰值在81个碱基的位置，则对应样品的cold1基因型为籼型。若fam荧光峰值在86个碱基的位置，则对应样品的cold1基因型为粳型；若存在81和86两个峰，则对应样品的cold1基因型为杂合型。申繁14、9311及其杂交f1三个样品的检测结果表明申繁14携带粳型cold1基因，9311携带籼型cold1基因，f1则为杂合型(图2)。

实施例2

实施例2中所用水稻样品为申繁14和9311杂交f2代群体的48个株系，其他检测的步骤和方法与实施例1相同。检测结果见表1。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，同样落于本发明所要求的保护范围之内。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cacacagtgtgctttgatttc21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgtctccatggattgcatg20

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tttcatcaatttccctgtaatttttttttttttttttttt40

<210>4

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcca41

<210>5

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tttttttttttttttttttttttcctttccaatgttttgatgtcct46