本发明涉及一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉、制备方法及应用。属于生物医药加工
技术领域：
。
背景技术：
：口腔是一个复杂而完整的微生态系统，定植于口腔的微生物主要包括细菌、真菌、支原体、病毒及原虫等，这些微生物在口腔的不同部位共栖、竞争和拮抗，与口腔固有环境共同构成了口腔微生态系统。研究发现，定植于口腔的微生物主要以细菌为主，目前已发现700余种，是人体最复杂的微生物集群之一。目前国内外专家均已认识到调节口腔菌群平衡是预防和治疗各种口腔疾病的关键。口源性口臭主要是口腔内革兰阴性厌氧菌通过消化口腔内滞留的食物残渣、唾液和血液等物质而产生挥发性硫化物(volatilesulfurcompounds，vscs)的结果，而硫化氢(h2s)与甲硫醇(ch3sh)是vscs中最主要的两种，研究表明益生菌在进入口腔环境后，可以通过与口腔病原菌竞争口腔黏膜或上皮细胞表面的结合位点来减少口腔致病菌的黏附。而当益生菌整合到口腔群落中后，益生菌产生的胞外多糖和其较强的聚集能力有助于其在口腔环境中形成生物膜。在生物膜这样复杂的生态结构中，益生菌可以通过分泌过氧化氢和有机酸等抗菌物质来非特异性地抑制包括口腔致病菌在内的其他微生物的生长。同时当细菌存在于生物膜系统中，细菌对外界的环境变化具有较强的抵抗能力，有助于其在复杂的口腔环境中繁殖与生存。此外，益生菌还可以通过调节机体的免疫系统来发挥其益生作用。因此，筛选合适的益生菌用于抑制口源性口臭对于口腔保健是非常有利的。技术实现要素：本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉、制备方法及应用。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：1、一种副干酪乳杆菌，该菌株为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)lpc48，已于2020年2月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.19422。优选的，所述副干酪乳杆菌的16srdna序列，如seqidno.1所示。caggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgtctaaggtgggacaaa，如seqidno.1所示。2、上述一种副干酪乳在制备抑制口源性口臭的口腔保健产品中的应用。优选的，所述口腔保健产品包括日化产品和食品，其中，日化产品选自口腔喷雾剂或漱口水，食品选自口香糖或口腔含片。3、利用上述副干酪乳杆菌制成的一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉。4、上述一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉的制备方法，先在灭菌后的培养基中接入上述副干酪乳杆菌，35～44℃下发酵24～72小时，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，即得所述的一种副干酪乳杆菌冻干粉；其中，所述培养基包含：脱脂奶粉8～15g，酵母膏3～8g，葡萄糖15～25g，k2hpo40.5～2g，caco31～3g，蒸馏水1000ml。优选的，具体步骤如下：(1)培养基的配制：先将配方量的蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、吐温80溶于蒸馏水中，然后在120～125℃下灭菌15～25分钟；(2)发酵：在灭菌后的培养基中接入上述副干酪乳杆菌，使得原始菌数为1.0×104cfu/ml～1.0×105cfu/ml，发酵使得菌数＞1.0×109cfu/ml；(3)菌体收集：收集发酵液，在转速为4000～8000r/min条件下离心4～12分钟，弃上清收集菌体沉淀物；(4)真空冷冻干燥：在步骤(3)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水后，铺盘1～3cm，在-85～-75℃下冷冻12～15小时，用真空冷冻干燥机冷冻干燥18～30小时。进一步优选的，步骤(4)中，以重量百分数计，冻干保护剂、水、沉淀物的组成为：沉淀物85～90％，冻干保护剂1.7～3.5％，余量为水。进一步优选的，步骤(4)中，所述冻干保护剂选自脱脂乳粉、海藻糖、维生素c或果胶中的至少一种。优选的，真空冷冻干燥步骤后还进行粉碎操作，得到粉末，再添加稀释剂后得到冻干粉，灌装即可。进一步优选的，所述稀释剂为麦芽糊精或/和葡萄糖，稀释剂用量占冻干粉重量的70～90％。5、上述一种副干酪乳杆菌冻干粉在制备抑制口源性口臭的口腔保健产品中的应用。优选的，所述口腔保健产品包括日化产品和食品，其中，日化产品选自口腔喷雾剂或漱口水，食品选自口香糖或口腔含片。进一步优选的，在口腔喷雾剂或漱口水中，副干酪乳杆菌冻干粉的重量含量为1～10％。进一步优选的，在口香糖或口腔含片中，副干酪乳杆菌冻干粉的重量含量为1～10％。申请人对本发明的副干酪乳杆菌lpc48与其他乳酸菌对变异链球菌的抑菌效果进行了比较，结果见表1，其中，干酪乳杆菌258、副干酪乳杆菌213、植物乳杆菌lp28、瑞士乳杆菌lhr14、动物双岐杆菌342、嗜热链球菌912，均购自生合生物科技股份有限公司(中国台湾高雄区路竹区北岭六路66号)。表1.对变异链球菌的抑菌效果比较菌株号变异链球菌的抑菌效果干酪乳杆菌258++副干酪乳杆菌lpc48+++副干酪乳杆菌213++植物乳杆菌lp28++瑞士乳杆菌lhr14+动物双歧杆菌342-嗜热链球菌912-注：－:无抑制；+:抑菌圈直径7～10mm(弱)；++:抑菌圈直径10～13mm(良)；+++:抑菌圈直径＞13mm(强)本发明的有益效果：申请人筛选获得了一种副干酪乳杆菌lpc48，该菌株对变异链球菌具有较强的抑制作用，具有较强的口腔定植能力，同时具有较强的抑制口源性口臭的能力，可用于口腔保健，大大拓展了益生菌的应用领域。保藏信息分类命名：副干酪乳杆菌拉丁文学名：lactobacillusparacasei保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2020年2月17日具体实施方式下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。参考实施例本发明的副干酪乳杆菌lpc48从乳制品分离，并通过如下方法分离得到：(1)制备mrs培养基mrs培养基的具体成分如下：制备方法：将上述成分加入到1000ml蒸馏水中，加热溶解，调节ph，分装后121℃高压灭菌15min～20min。(2)从酸奶中分离得到副干酪乳杆菌lpc48；分离方法如下：将酸奶的样品在灭菌的生理盐水中稀释到一定的梯度，以0.1ml置于mrs琼脂平板，使用l形棒进行表面涂布，37℃，厌氧培养48h；用接种环挑取平板上的特征菌落。于新的mrs琼脂平板划线分离后获得。上述方法得到的副干酪乳杆菌lpc48的特性如下：革兰氏阳性、不抗酸、不形成孢子、不运动的专性厌氧细菌，发酵葡萄糖主要产生乙酸和l(+)乳酸，摩尔比为3:2，还产生少量的甲酸和琥珀酸，不产生co2、丙酸和丁酸。过氧化氢酶阴性，联苯胺反应和吲哚反应阴性，不还原硝酸盐。g+c的摩尔含量在57.2％～64.5％之间。得到的副干酪乳杆菌lpc48的16srdna序列具有seqidno.1所示的序列结构，所述seqidno.1的具体结构如下：caggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgtctaaggtgggacaaa。实施例1：(1)培养基的配制：将脱脂奶粉15g，酵母膏3g，葡萄糖25g，k2hpo42g，caco33g溶于1000ml蒸馏水，在125℃下灭菌25分钟；(2)乳酸菌高密度发酵：在灭菌后的培养基中接入参考实施例所得副干酪乳杆菌lpc48，使得原始菌数为1.0×104cfu/ml，在35℃下发酵72h，使菌数＞1.0×109cfu/ml；(3)菌体收集：收集乳酸菌发酵液，在转速为800r/min条件下离心12分钟，弃上清收集菌体沉淀物；(4)在步骤(3)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水，以重量百分数计，菌泥90％，vc0.3％，大豆磷脂0.8％，水8.9％，(5)菌泥冷冻干燥：在步骤(4)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水后，铺盘3cm，在冷阱温度-75℃下冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冷冻干燥30h，真空度1pa；(6)粉碎混合：将步骤(5)所得冻干粉半成品粉碎成粉末，添加一定量的稀释剂后罐装制得成品；以重量百分数计，冻干粉半成品20％，麦芽糊精1.5％，葡萄糖78.5％。(7)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口香糖、片剂等食品中的应用，其用量为口香糖总量的10％。实施例2：(1)培养基的配制：将脱脂奶粉15g，酵母膏3g，葡萄糖25g，k2hpo40.5g，caco33g溶于1000ml蒸馏水，在125℃下灭菌25分钟；(2)乳酸菌高密度发酵：在灭菌后的培养基中接入副干酪乳杆菌lpc48，使得原始菌数为1.0×104cfu/ml，在35℃下发酵24h，使菌数＞1.0×109cfu/ml；(3)菌体收集：收集乳酸菌发酵液，在转速为800r/min条件下离心4分钟，弃上清收集菌体沉淀物；(4)在步骤(3)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水，菌泥90％，vc0.3％，大豆磷脂0.8％，水8.9％，(5)菌泥冷冻干燥：在步骤(4)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水后，铺盘1.0～3cm，在-85～-75℃下冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冷冻干燥18～30h。冷阱温度-50℃，真空度1pa；(6)粉碎混合：将步骤(5)所得冻干粉半成品粉碎成粉末，添加一定量的稀释剂后罐装制得成品；冻干粉半成品20％，山梨醇1.5％，葡萄糖78.5％。(7)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口香糖、片剂等食品中的应用，其用量为口香糖总量的1％。(8)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口腔用的漱口水等日化产品中的应用，其用量为脂肪类食品总量的1％。实施例3：(1)培养基的配制：将脱脂奶粉8g，酵母膏8g，葡萄糖15g，k2hpo42g，caco31g溶于1000ml蒸馏水，在125℃下灭菌15分钟；(2)乳酸菌高密度发酵：在灭菌后的培养基中接入副干酪乳杆菌lpc48，使得原始菌数为1.0×105cfu/ml，在35℃下发酵72h，使菌数＞1.0×109cfu/ml；(3)菌体收集：收集乳酸菌发酵液，在转速为4000r/min条件下离心12分钟，弃上清收集菌体沉淀物；(4)在步骤(3)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水，以重量百分数计，菌泥90％，vc0.3％，大豆磷脂0.8％，水8.9％，(5)菌泥冷冻干燥：在步骤(4)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水后，铺盘1.0cm，在-75℃下冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冷冻干燥18～30h。冷阱温度-50℃，真空度1pa；(6)粉碎混合：将步骤(5)所得冻干粉半成品粉碎成粉末，添加一定量的稀释剂后罐装制得成品；以重量百分数计，冻干粉半成品20％，山梨醇1.5％，葡萄糖78.5％。(7)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口香糖、片剂等食品中的应用，其用量为口香糖总量的1％。将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口腔用的漱口水等日化产品中的应用，其用量为脂肪类食品总量的10％。实施例4：(1)培养基的配制：将脱脂奶粉15g，酵母膏3g，葡萄糖25g，k2hpo40.5g，caco33g溶于1000ml蒸馏水，在120℃下灭菌25分钟；(2)乳酸菌高密度发酵：在灭菌后的培养基中接入副干酪乳杆菌lpc48，使得原始菌数为1.0×104cfu/mlcfu/ml，在44℃下发酵24h，使菌数＞1.0×109cfu/ml；(3)菌体收集：收集乳酸菌发酵液，在转速为8000r/min条件下离心4分钟，弃上清收集菌体沉淀物；(4)在步骤(3)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水，以重量百分数计，菌泥90％，vc0.3％，大豆磷脂0.8％，水8.9％，(5)菌泥冷冻干燥：在步骤(4)收集的沉淀物中加入冻干保护剂和水后，铺盘3cm，在-85℃下冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冷冻干燥18～30h。冷阱温度-50℃，真空度1pa；(6)粉碎混合：将步骤(5)所得冻干粉半成品粉碎成粉末，添加一定量的稀释剂后罐装制得成品；以重量百分数计，冻干粉半成品20％，山梨醇1.5％，葡萄糖78.5％。(7)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口香糖、片剂等食品中的应用，其用量为口香糖总量的10％。(8)将步骤(6)制得副干酪乳杆菌lpc48冻干粉在制备口腔用的漱口水等日化产品中的应用，其用量为脂肪类食品总量的1％。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。序列表<110>生合生物科技（扬州）有限公司<120>一种具有口腔保健功能的副干酪乳杆菌冻干粉、制备方法及应用<141>2020-04-07<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1484<212>dna<213>artificialsequence<400>1caggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgagttctcgttgatgat60cggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggt120aacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaa180gaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcgg240cgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgag300aggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagta360gggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggct420ttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcg480tgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgta540ggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtc600tgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaacttgagtgc660agaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacac720cagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagc780gaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagg840gtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccg900caaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttta960attcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatc1020aggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgt1080gagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttag1140ttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaat1200catcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgc1260gagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaa1320ctcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacg1380ttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccgg1440tggcgtaacccttttagggagcgagccgtctaaggtgggacaaa1484当前第1页12