本发明属于植物共生菌类培养领域，具体为金线莲内生菌的提取与纯化制备方法。
背景技术：
金线莲在民间使用范围较广，素有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美称。经有关部门测定发现，金线莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参。几百年来作为民间常用草药。随着人民生活水平的日益提高，养生保健大健康产业也蓬勃发展，越来越多的保健型植物产品给了人们更多的选择，随着需求的升高，越来越多的保健型植物被广泛开发，植物组培领域的技术发展可满足市场对保健型植物原材料的供给，但是金线莲由于生长所需环境的特殊性，导致在组培行业里生产成本一直居高不下，且生长周期过长、单株产量不高、众多的因素推高了金线莲组培苗的成本，以至于该行业发展了十几年，众多的企业和资金投入金线莲组培生产，但并没有因为聚集效应带来的成本优势，降低终端价格。究其原因还是因为生产成本过高，该方法在充分分析植物原有的特性的基础上，根据金线莲的特殊生物学特性，将着力点放在还原原生态的金线莲生长模式，尽可能的去为金线莲营造如野生环境般与众多共生菌共生的生存方式。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种金线莲共生菌的提取及纯化方法，用于金线莲组培及种植行业共生菌的生产，可缩短金线莲的培养周期，并培养出苗壮、高产量、低杂菌污染的金线莲。
为达成上述目的，本发明的解决方案为：一种金线莲共生菌的提取及纯化方法，包括以下步骤：
s1，金线莲杂菌去除：首先在组培培养室中挑选长势粗壮、叶脉清晰舒展含内生菌的金线莲组培瓶苗作为外植体，其次对外植体进行清洗、消毒，然后接入培养基中进行培养；
s2，共生菌母种分离：将s1中获得的金线莲茎段，切口处斜插入培养基中培养，所述培养基为：ms培养基、naa0.4mg/l、蔗糖20g/l、琼脂4.6g/l，培养条件是温度18-25℃，湿度为60-70％rh，培养周期为7-10天；
s3，共生菌纯化培养：首先制作细菌培养基，所述细菌培养基由铃薯、豆芽、麦麸、牛肉膏、氯化钠、磷酸二氢钾、蛋白胨、维生素b1、b12、酵母膏、硫酸镁、琼脂按一定比例配置而成，ph＝7，经高温灭菌后冷却至40°，其次将s2中获得的共生菌样本分别稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000的溶液，分别取出少许不同浓度的稀释液，与所述细菌培养基混合，摇匀后，倾入灭菌后的培养皿中，待琼脂凝固后，制成含菌的琼脂平板，培养条件是温度18-25℃，湿度为60-70％rh，经过培养后，挑选分布单一的菌落，重复上述操作2-3次，即可得到纯培养的金线莲共生菌；
s4，共生菌扩大培养：首先制作细菌液体培养基，所述细菌液体培养基为：蛋白胨20g/l、牛肉浸膏3g/l、nacl5g/l、葡萄糖30g/l、ph＝7，其次将s3中获得的纯化共生菌加入液体培养基中进行摇床培养，培养条件是温度37℃，摇床转速200rpm，培养至目视浑浊即可。
进一步，s1中对外植体清洗、消毒的步骤为：在无菌工作台上完整取出，去除所有叶片，切除根部，然后将外植体放入0.1％升巩溶液中浸泡3min，用无菌水冲洗5次，将茎段裁成1cm带茎节的茎段，接种到培养基中。
进一步，s2中做一组对照实验，在相同培养条件下，用改良后的培养基对金线莲茎段进行培养，所述改良后的培养基是在原培养基的基础上添加原料m，所述原料m为牛肉膏0.8mg/100ml、蛋白胨2.0mg/100ml、氯化钠0.1g/100ml。
进一步，s3采用稀释倒平板法对金线莲共生菌进行分离提纯。
进一步，s4中，金线莲共生菌扩大培养所采用的瓶子为三角锥组培瓶，装液量为瓶身的1/3，置于摇床上进行震荡培养。
进一步，s4在s3的基础上挑选4-5个长势均一的单个菌落分别进行液体培养。
采用上述方案后，本发明的增益效果在于：
本发明采用长势粗壮、叶脉清晰舒展含内生菌的金线莲组培瓶苗作为外植体，进行分离、纯化及扩大培养，得到育苗健壮、生产周期短、单株产量高、杂菌污染少、成本低的金线莲育苗；且流程简单，培育周期更短，易于工厂化生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做详细的说明。
本发明提供一种金线莲共生菌的提取及纯化方法，包括以下步骤：
s1，金线莲杂菌去除：首先在组培培养室中挑选长势粗壮、叶脉清晰舒展含内生菌的金线莲组培瓶苗作为外植体，在无菌工作台上完整取出，去除所有叶片，切除根部，然后将外植体放入0.1％升巩溶液中浸泡3min，用无菌水冲洗5次，将茎段裁成1cm带茎节的茎段，接种到培养基中。
s2，共生菌母种分离：将s1中获得的金线莲茎段，切口处斜插入培养基中培养，所述培养基为：ms培养基、naa0.4mg/l、蔗糖20g/l、琼脂4.6g/l，培养条件是温度18-25℃，湿度为60-70％rh，培养周期为7-10天，培养基表面出现零星的粉色细菌菌落；在此，做一组对照实验，在相同培养条件下，用改良后的培养基对金线莲茎段进行培养，所述改良后的培养基在原培养基的基础上添加原料m，所述原料m为牛肉膏0.8mg/100ml、蛋白胨2.0mg/100ml、氯化钠0.1g/100ml，考察原料m对金线莲培养的影响，结果见下表。从下表中可以看出原有金线莲诱导芽培养基中带有内生共生菌的外植体可以与共生菌共存，但共生菌会影响金线莲的生长，导致其产量低下；改良后的培养基由于添加了原料m，使更多的共生菌从金线莲茎段的切口处流出，对金线莲诱导芽培养的生长促进作用明显，芽体更加粗壮且产量更多。本案中所述ms培养基为基本植物组培培养基。
s3：共生菌纯化培养，采用稀释倒平板法将金线莲共生菌分离提纯，首先制作细菌培养基，所述细菌培养基由铃薯、豆芽、麦麸、牛肉膏、氯化钠、磷酸二氢钾、蛋白胨、维生素b1、b12、酵母膏、硫酸镁、琼脂按一定比例配置而成，ph＝7，经高温灭菌后冷却至40°，其次将s2中获得的共生菌菌落分别稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000的溶液，分别取出少许不同浓度的稀释液，与已熔化并冷却至40°左右的细菌培养基混合，摇匀后，倾入灭菌后的培养皿中，待琼脂凝固后，制成含菌的琼脂平板，培养条件是温度18-25℃，湿度为60-70％rh，经过培养后，挑选分布单一的菌落，重复上述操作2-3次，即可得到纯培养的金线莲共生菌。
s4，共生菌扩大培养：首先配制细菌液体培养基，所述细菌液体培养基为：蛋白胨20g/l、牛肉浸膏3g/l、nacl5g/l、葡萄糖30g/l、ph＝7，120°高温蒸汽灭菌20min后冷却，其次从s3获得的金线莲共生菌中选取4-5个长势均一的单个菌落，将共生菌菌落加入液体培养基中，所述液体培养基倾入三角锥组培瓶，装液量为瓶身的1/3，置于摇床上进行震荡培养。培养条件是温度37℃，摇床转速200rpm，培养7天，液体培养基开始变浑浊，培养14天，通过镜检检测细菌生长及纯化情况，再通过糖分残留检测糖分的消耗情况，若糖分基本消耗完全，即可用于后续金线莲生产添加剂使用。
本案选用长势粗壮、叶脉清晰舒展含内生菌的金线莲组培瓶苗作为外植体，由于金线莲共生菌呈溶水性会随着浆液从茎段切口处流出，通过改良后的培养基将位于金线莲茎干内的共生菌分离出母体、纯化和扩大培养后，将金线莲共生菌添加到金线莲组培无菌培养基或金线莲种植培养基中，可以使金线莲在相同培育条件下与所分离的细菌产生共生效应，可明显缩短金线莲生长周期，并且在植株外观上明显优于没有添加共生菌培养的金线莲，具体表现为叶片更加舒展，叶片金色纹路更加明显，茎节缩短、平均单株质量提高20％。
另外，添加共生菌的培养基由于细菌培养中存在竞争关系比没添加共生菌的培养基污染率下降30％，并可制成相应的菌液，解决金线莲组培行业对共生菌类添加剂产品的需求。本案制作工艺简单，容易操作，可以在工厂化生产金线莲组培苗中，添加共生菌共同培养，提高金线莲种苗的质量和产量，利于金线莲后期的下地栽培的成活率及环境适应性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本案设计的限制，凡依本案的设计关键所做的等同变化，均落入本案的保护范围。