本发明涉及一种生防放线菌及其在生姜茎基腐病或大豆疫病防治方面的应用，属于农作物生物防治技术领域。
背景技术：
生姜属于姜科、姜属多年生草本宿根植物，是一种高产的经济作物。随着生姜种植面积的不断扩大，生姜病害的发生也呈现上升趋势，尤其是生姜茎基腐病的发生极为严重，该病又称为生姜软腐病、生姜腐霉病等，是由腐霉菌侵染引起的一种土传病害，已成为生姜产业健康发展的主要问题之一。目前，由于地理环境和气候条件的差异，我国北方生姜主产区的致病菌主要是群结腐霉菌(pythiummyriotylum)，感染菌后的主要特征表现在发病初期，茎基部出现大小不等的水渍状病斑，逐渐扩大，叶片发黄，发病后期病斑环绕茎基部一周，导致茎基部组织逐渐变褐、变软，最终倒伏和腐烂并伴有恶臭味，叶片则变黄、下垂，尔后枯死。湿度大时扒开土壤，距地表2公分处在病部和土壤中可见白色棉絮状物。
大豆是中国重要粮食作物之一，由大豆疫霉菌引起的大豆疫病是严重影响大豆生产的毁灭性病害。该病菌以卵孢子在土壤中存活，越冬成为初侵染源，湿度高或多雨天气、土壤粘重，易发病，一般减产10-30％，严重发生减产50-70％，有的甚至绝收。大豆疫霉菌在大豆生长的任何阶段都可侵染和危害，尤其是刚萌芽时的幼根和下胚轴最易受侵染，造成烂种、幼苗猝倒，苗期侵染引致根腐或茎腐，造成幼苗萎蔫或死亡，成株期受到侵染，首先下部叶片变黄随后上部叶片逐渐变黄并很快姜蔫，不脱落，近地面茎中空易折断，易形成瘪荚、瘪粒。在潮湿条件下病部常呈水渍状，扩散快，发病组织迅速死亡。
目前，针对大豆疫病和生姜茎基腐病主要是化学防治为主。据报道用化学药剂土壤熏蒸对土传病害有良好的防效，但是该方法对土壤生态系统破坏严重，成本昂贵，很难进行大范围推广应用。而生物防治能保护生态系统的良性循环和环境安全，从而减轻因过度使用化学农药造成的环境污染，并能大大节省防治成本。
利用环境有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力是近些年来研究的热点，尤其这些微生物对环境无污染，能克服化学药剂防治带来的缺陷，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害、以及应对不良环境的兴趣；特别是，在农业生产中具有较高的经济效益和环境效益，符合保护生态环境和维护人类健康安全的发展趋势，可为我国国民经济及未来农业的可持续发展提供广阔前景。
因此，本领域技术人员希望能够筛选出对生姜茎基腐病或大豆疫病进行防治的微生物。
技术实现要素：
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种生防放线菌，其中，所述生防放线菌为疮茄链霉菌(streptomycesscabies)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.18716。
本发明另一方面提供了一种菌药制剂，其中，所述菌药制剂包含由上述的生防放线菌发酵获得的放线菌菌剂。
优选的，所述菌药制剂包含由上述的生防放线菌发酵获得的放线菌菌剂和农药学上可接受的助剂。
本发明再一方面提供了上述的菌药制剂的制备过程，其中，将上述的生防放线菌的菌种在高氏一号培养基上进行活化培养，再将活化后的菌株进行第一次发酵培养获得种子液，再将所述种子液进行第二次发酵培养获得所述放线菌菌剂。
优选的，所述第一次发酵培养采用的培养基的配制方法是每1000ml培养基采用玉米粉9.8～10.2g、蔗糖9.8～10.2g、氯化钠1.9～2.1g、硫酸铵2.9～3.1g和碳酸钙1.9～2.1g溶解至蒸馏水中，调节ph至7.2-7.4，定容，再进行高温灭菌；所述第一次发酵培养采用的条件是25～30℃，转速为170-200r/min下振荡发酵培养120～144h。
优选的，所述第二次发酵培养采用的培养基的配制方法是每1000ml培养基采用大豆粉9.8～10.2g，葡萄糖14.8～15.2g，氯化钠1.9～2.1g，硫酸铵2.9～3.1g，碳酸钙1.9～2.1g，溶解至蒸馏水中，调节ph至7.2-7.4，定容，再进行高温灭菌；所述第二次发酵培养采用的条件是25～30℃，转速为170-200r/min下振荡发酵培养144～168h；所述第二次发酵培养结束后，采用纱布进行过滤制得所述放线菌菌剂。
本发明还一方面提供了上述的生防放线菌在防治植物病害方面的应用，其中，所述植物病害为大豆疫霉、群结腐霉、寡雄腐霉、钟器腐霉、刺腐霉、林栖腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、辣椒疫霉、柑橘褐腐疫霉、禾谷镰刀菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
优选的，所述植物病害为生姜茎基腐病或大豆疫病。
本发明还一方面提供了上述的菌药制剂在防治植物病害方面的应用，其中，所述植物病害为大豆疫霉、群结腐霉、寡雄腐霉、钟器腐霉、刺腐霉、林栖腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、辣椒疫霉、柑橘褐腐疫霉、禾谷镰刀菌或尖孢镰刀菌导致的植物病害。
优选的，所述植物病害为生姜茎基腐病或大豆疫病。
本发明提供的生防放线菌cgmccno.18716(疮茄链霉菌streptomycesscabies)，可以有效防治大豆疫病和生姜茎基腐病，同时也表现出了广谱的植物抗病能力，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展，也为研究开发新的环境友好型生防放线菌菌剂提供优质的生物资源。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得本发明的生防放线菌11×1(疮茄链霉菌(streptomycesscabies))cgmccno.18716的操作过程。
1、分离存在于植物体外的潜在的生防菌
1)土壤悬浮液的制备：称量3g土壤样品(来源于江苏省徐州市铜山区大豆种植田大豆根围土)置于盛有27ml无菌水的三角瓶(含灭菌玻璃珠)中，于摇床150rpm下震荡培养30min；
2)10倍梯度稀释：静置5min，从三角瓶中取1ml土壤悬浮液置于盛有9ml无菌水的试管中(稀释10倍)并振荡混匀，再进一步梯度稀释，配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液；
3)涂平板培养：分别从上述的梯度稀释液中取0.1ml，均匀涂布于高氏一号培养基上(含重铬酸钾70mg/ml)，每个梯度3个重复，置于28℃倒置，培养3天左右；
4)选取菌落数在50～300之间的平板，计数并且挑取所有菌落，在固体高氏一号培养基上纯化后，用接种环挑取单一菌落接种于盛有5ml高氏一号培养基(液体)的试管中，28℃200rpm摇菌培养24～48h，取菌悬液与等体积80％甘油溶液混匀，存于-70℃保存备用(bergetal.,2000)。
2、产酶活性测定初步筛选生防菌株
具有产蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶等产酶活性的菌株常作为初筛生防菌的标准。牙签挑取处于生长旺盛期的菌株点于蛋白酶酶活测定培养基、以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基(chi-ayers)、β-1,3-葡聚糖酶酶活测定培养基、纤维素酶酶活测定培养基上，接菌后28～30℃培养3天观察透明圈有无，分别记录透明圈的内径和外径。具有一种或多种以上产酶活性的菌株保留，待进一步筛选。
最终在大豆根围土壤中分离得到一菌株，经产酶活性检测及平板拮抗试验确认其为潜在生防菌株，命名为生防放线菌11×1。
二、关于本发明的生防放线菌11×1的鉴定过程如下：
1、形态学特征观察
利用插片法进行形态学特征观察，具体操作：将灭菌盖玻片以45度角斜插入涂有上述筛选出来的菌株的高氏一号培养基平板中，28℃恒温培养，期间观察培养性状和用光学显微镜观察形态特征。
形态学特征：单菌落为圆形，表面起粉而不透明；菌落质地致密，且带有泥腥味，菌丝呈现白色或灰白色，基生菌丝为淡黄色，生长局限，不产生色素；光学显微镜下，基内菌丝无横隔，气生菌丝分枝多，孢子丝多为长直形，部分有弯曲，有链状孢子形成，呈圆柱状或短杆状。
2、分子生物学鉴定
将筛选获得的生防放线菌11×1在高氏一号培养基上，28℃环境下培养至对数期，以5000转/分钟离心5分钟收集菌体。
采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组dna快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组总dna。
再采用天根生化科技有限公司的pcr扩增试剂盒扩增该生防放线菌11×1的16srrna序列。以上述提取的基因组总dna为模板，扩增所采用的正向引物序列为5'-agagtttgatcctggctcag-3'(如seqno.1所述)，反向引物序列为5'-tacggctaccttgttacgactt-3'(如seqno.2所述)。具体pcr扩增操作按照试剂盒说明书进行。
pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的pcr产物回收。再将连接、转化和扩增，将pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
将所得测序结果提交到genbank数据库进行blast分析比对。结果表明生防放线菌11×1的16srrna序列的总长度为1490bp，且与链霉菌属(streptomycessp.)或疮茄链霉菌(streptomycesscabies)序列同源性达99.93％，同时结合该菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征结果，最终将筛选获得的生防放线菌11×1鉴定为疮茄链霉菌(streptomycesscabies)。
关于生防放线菌11×1的菌种名称“疮茄链霉菌”，也可以称为“疮痂链霉菌”，其拉丁文“streptomycesscabies”，也可以为“streptomycesscabiei”。
三、关于菌株的保藏
本发明的本发明的生防放线菌11×1，属于疮茄链霉菌(streptomycesscabies)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2019年10月21日，其保藏编号为cgmccno.18716。
四、本发明生防放线菌11×1的培养方法和菌剂制备
将本发明的生防放线菌11×1在高氏一号培养基(平板划线)上生长，28℃恒温培养箱中黑暗培养2-4天，待长出单菌落(获得活化的放线菌菌株)。其中，高氏一号培养基的配制方法为：每配制1000ml高氏一号培养基使用可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂15-20g，调节ph至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min；
挑单菌落(活化的菌株)接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，温度为28℃，转速为180r/min下振荡发酵培养120～144h，获得种子液。该步骤所用发酵培养基的配制方法为：每1000ml发酵培养基使用玉米粉10g，蔗糖10g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g，调节ph至7.2-7.4，用蒸馏水容至1000ml，在121℃条件下灭菌20min；
可以将上述获得的种子液以8％的接种量接种于发酵培养基中进行二次发酵。二次发酵所采用的发酵培养基的配制方法为，每1000ml培养基使用大豆粉10g，葡萄糖15g，氯化钠2g，硫酸铵3g，碳酸钙2g，将ph值调节至7.5，用蒸馏水定容至1000ml，121℃条件下灭菌20min，转速为180r/min下振荡发酵培养144～168h，温度为28℃，发酵结束后用纱布过滤制得放线菌菌剂，4℃保存备用。
将上述获得的放线菌菌剂在转速为5000r/min下进行离心，丢弃底部沉淀，取上清发酵液经过0.2μm的细菌过滤器过滤，制得无菌放线菌菌剂(活菌浓度大致为5×109～1×1010cfu/ml)，4℃保存备用。
五、本发明生防放线菌11×1的应用
一般来说，可以将上述第四部分获得的无菌放线菌菌剂稀释100～200倍，在农作物移栽当天进行灌根处理；此后，在农作物发病之前，根据作物的生长周期，每隔30-45d将上述第四部分获得的无菌放线菌菌剂稀释100～200倍对移栽的农作物进行灌根，可同时将上述第四部分获得的无菌放线菌菌剂稀释500～1000倍进行叶面喷施。
六、本发明生防放线菌11×1对植物病原菌的平板拮抗试验
具体的试验方法为：
按照1:6(v/v)的比例将上述第四部分制备好的无菌放线菌菌剂与冷却好的v8固体培养基均匀混合，制成含生防放线菌11×1的培养基平板(将等比例的不含生防放线菌11×1的发酵培养基与10％的v8固体培养基混合制备对照组平板)。
上述10％的v8固体培养基按照1：100(w/v)的比例在v8蔬菜汁中加入caco3，然后5000r/min离心10min，取上清弃沉淀，在上清液中加入9倍体积的蒸馏水，配制成10％的v8蔬菜汁培养基，按照1.5％的比例加入琼脂，在121℃条件下灭菌20min，冷却后制得。
将群结腐霉(pythiummyriotylum)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、华丽腐霉(pythiumsplendens)、刺腐霉(pythiumspinosum)、林栖腐霉(pythiumsylvaticum)、大豆疫霉(phytophthorasojae)、钟器腐霉(pythiumvexans)、终极腐霉(pythiumuitimum)辣椒疫霉(phytophthoracapsici)、柑橘褐腐疫霉(phytophthoracitrophthora)、寡雄腐霉(pythiumoligandrum)、冬青丽赤壳菌(calonectriaillcicola)、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)分别在10％的v8固体培养基中培养1-4天备用。
对于上述植物病原菌，各自取菌落中靠近边缘部分，用已灭菌的打孔器打取直径为6mm的菌碟，将菌碟的菌丝面朝下分别接种于上述制成含生防放线菌11×1的培养基平板的正中央，每组处理设置3个重复，25℃黑暗培养1-5天，用十字交叉法测量菌落直径，并用公式计算出菌丝生长的抑制率：
抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-6)×100％
结果参见下表1。
表1
从上表1的结果可以看出，本发明的生防放线菌11×1对大豆疫霉和群结腐霉的抑制率高达86％以上，具有明显的拮抗活性(抑制作用)。
由此，可以推断，本发明的生防放线菌11×1以及菌剂可以用于防治大豆疫霉和群结腐霉导致的植物病害，例如大豆疫病和生姜茎基腐。
也可以看出，本发明的生防放线菌11×1对于寡雄腐霉、钟器腐霉、刺腐霉、林栖腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、辣椒疫霉、柑橘褐腐疫霉、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌都有高达44％以上的抑制率，能够抑制这些腐酶和镰刀菌的生长。
由此，也可以推断，本发明的生防放线菌11×1以及菌剂可以用于防治寡雄腐霉、钟器腐霉、刺腐霉、林栖腐霉、终极腐霉、瓜果腐霉、华丽腐霉、辣椒疫霉、柑橘褐腐疫霉、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌导致的植物病害。
七、本发明生防放线菌11×1在离体叶片上对群结腐霉菌和大豆疫霉菌防治效果的测定
(1)将放线菌菌剂培养至预定的时间：选取相同叶位的生姜和大豆叶片各60片左右，先用浓度0.5％的吐温20分别浸泡大豆叶片和生姜叶片约10s，接着用无菌水轻轻漂洗，取出后在超净工作台中晾干。取上述第四部分获得的无菌放线菌菌剂(活菌浓度大致为5×109～1×1010cfu/ml)，再将大豆叶片和生姜叶片分别浸入无菌放线菌菌剂中1min后(对照组采用不含生防放线菌11×1的发酵培养基的上清液)，取出在超净工作台中晾干。
(2)将群结腐霉菌和大豆疫霉菌各自在10％v8固体培养基中培养1-4天；分别用打孔器打取菌落外边缘制成菌碟(直径6mm)，再将群结腐霉菌的菌碟的菌丝面朝下分别接种于生姜叶片，将大豆疫霉菌的菌碟的菌丝面朝下分别接种于大豆叶片上，各处理设置12个重复，25℃黑暗培养。分别测量生姜(接种后培养24h)和大豆叶片(接种后培养48h)上的病斑直径，最后评估防效。其中防效的计算公式是：
防效(％)＝(对照组病斑直径-处理组病斑直径)/对照组病斑直径×100％测定的结果参见下表2。
表2
从上表2中可以看到，本发明的生防放线菌11×1菌剂(发酵液)对大豆疫霉菌在大豆离体叶片上的防效为90％，对群结腐霉菌在生姜离体叶片上的防效为58.3％，这说明，采用本发明的生防放线菌11×1菌剂(发酵液)可以用作生物药剂喷施于生姜和大豆叶面。
八、本发明的生防放线菌11×1对生姜茎基腐病的盆栽防效测定
(1)群结腐霉菌游动孢子悬浮液的制备：将保存的群结腐霉菌株在10％v8培养基上活化生长，在25℃恒温培养箱中黑暗放置进行培养，一般培养的时间为1-2天备用；将备用的菌株用手术刀切成10mm×15mm大小的菌丝块(10-20块)置于15ml的灭菌自来水中，菌丝块的菌丝面朝上，每隔30min换一次水，重复3次；最后加8ml左右的灭菌自来水，25℃恒温培养箱中放置培养，培养24h左右即可诱导产生游动孢子，将游动孢子悬浮液用无菌水调节至浓度约为1×104个/ml。
(2)盆栽防效的测定：用高度为7.5cm组织培养的生姜苗，在根部灌入生防放线菌11×1菌剂(上述第四部分制得的)，每株生姜苗灌5ml(以根部位置灌入等体积的未接种生防放线菌11×1的发酵培养基上清液的姜苗为对照)。灌根3天后，再向生姜根部灌入群结腐霉菌的游动孢子，每株生姜苗灌2ml，各处理重复3组，每组12株苗，共接种36株生姜苗。置于25℃恒温培养箱中培养，接种11天后计算植株的病情指数和防治效果。各参数计算公式如下：
病情指数＝100×∑(各级病植株数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)；
0＝植株保持绿色和健康；1＝叶鞘环变色并且下部叶片变黄；2＝植株存活，但叶片完全黄化或死亡；3＝整个植株死亡。
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
测定的结果参见下表3。
表3
表3中的病情指数结果，在0.01水平上有显著差异。
从表3的结果可以看出，经本发明生防放线菌11×1菌剂(发酵液)灌根处理生姜苗，其病情指数为14.67、防效为85.33％，而对照组的姜苗全部因生姜茎基腐病死亡，这说明本发明生防放线菌11×1菌剂能用于对生姜茎基腐病的防治。
九、本发明的生防放线菌11×1对大豆疫病的盆栽防效测定
(1)大豆疫霉菌培养：将保存的大豆疫霉菌株在10％v8培养基上活化生长，在25℃恒温培养箱中黑暗放置进行培养，一般培养的时间为5-7天备用；将备用的菌株用手术刀切成10mm×15mm大小的菌丝块，备用。
(2)盆栽防效的测定：用生长10天的大豆苗，在根部灌入生防放线菌11×1菌剂(上述第四部分制得的)，每株大豆苗灌5ml(以根部位置灌入等体积的未接种生防放线菌11×1的发酵培养基上清液的大豆苗为对照)。灌根3天后，向手术刀将大豆的近根部的茎干轻轻划破表皮，造成轻微伤口，将上述获得菌丝块长有菌丝的一面紧贴伤口，保湿后放置在25℃恒温光照培养箱中生长，光照时间16h光照/8h黑暗。各处理重复3组，每组15株苗，共接种45株生大豆苗。接种2天后计算植株的病情指数和防治效果。各参数计算公式如下：
病情指数＝100×∑(各级病植株数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)；
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
测定的结果参见下表4。
表4
表4中的病情指数结果，在0.01水平上有显著差异。
从表4的结果可以看出，经本发明生防放线菌11×1菌剂(发酵液)灌根处理大豆苗，其病情指数为34.32、防效为58.22％，而对照组的大豆全部因大豆疫病死亡，这说明本发明生防放线菌11×1菌剂能用于对大豆疫病的防治。
综上所述，本发明的生防放线菌11×1(疮茄链霉菌streptomycesscabies)，可以有效防治大豆疫病和生姜茎基腐病，同时也表现出了广谱的植物抗病能力，对人畜无毒，不污染环境，无残留，有利于生态环境的可持续发展，也为研究开发新的环境友好型生防放线菌菌剂提供优质的生物资源。
在获知本发明的生防放线菌11×1具有大豆疫病和生姜茎基腐病的防治效果后，可以将本发明的生防放线菌11×1的菌剂与农药上可接受的助剂组合获得防治大豆疫病或生姜茎基腐病的菌药制剂。
在获知本发明的生防放线菌11×1具有大豆疫病和生姜茎基腐病的防治效果后，可以将常规的防治大豆疫病或生姜茎基腐病的杀菌剂(化学药剂)与本发明的生防放线菌11×1的菌剂或菌粉进行复配获得菌药组合物。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。