一种人类TYMS基因表达量检测标准对照品的制作方法

本发明应用于基因检测
技术领域：
，具体涉及一种人类tyms基因表达量检测标准对照品。
背景技术：
：氟类药物包括5-fu、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等,对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。当氟类药物进入人体后，可被转化为活性代谢产物一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(fdump)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(fdutp)和三磷酸氟尿嘧啶(futp)等嘧啶类核苷酸类似物，进而产生抗肿瘤活性。tyms(thymidylatesynthetase，ts)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是氟类药物发挥细胞毒作用的目标酶。氟类药物转化为fdump后，与ts、5,10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dump与ts结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dtmp，使dna合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示tymsmrna表达水平与氟类药物疗效密切相关，例如：结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低tymsmrna水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，tyms高表达的患者接受氟类治疗疗效较差。目前，在临床肿瘤标志物检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等传统技术，但存在实验过程过于繁琐，结果读取主观影响较大等缺点。近年来，荧光定量pcr凭借检测时间短、检测敏感性高及能进行实时检测，反应基因在组织中的初始含量，检测时间短，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。荧光定量pcr常见方法有sybrgreeni染料法和taqman探针法。其中，sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如taqman法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性。现有文献和报道中常用的检测tyms基因表达量检测方法，是在采用荧光定量pcr的基础上，人工合成标准品，然后通过相对定量的方法来判定tyms基因表达量。临床上主要是基于统计样本中中位值来判断待检样本tyms表达水平的高低，通过人工合成标准品作为对照，只能检测样本中tyms基因相对人工合成标准品的表达量，并不能真实反映该样本中tymsmrna水平相对大数据中中位值的高低。因此单独检测tymsmrna表达量对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中tymsmrna表达水平的高低。因此采用单独检测tymsmrna拷贝数对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中tymsmrna表达水平的高低。如果每次检测都要进行大规模统计样本分析用于临床用药指导，整个检测过程复杂，并且成本高。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的上述问题，提供一种人类tyms基因表达量检测标准对照品。本发明标准对照品能够用于评价样本中tymsmrna水平相对于中位值的高低，简便快捷。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：1)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入用于tyms基因表达水平检测的特异性引物和pcr反应试剂并进行pcr扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类tyms基因检测标准品为模板获得的tyms基因标准曲线，获得tyms基因表达量(初始拷贝数)n1/μl；2)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物和pcr反应试剂并进行pcr扩增，扩增结果对照以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板获得的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)n2/μl；3)将所述人类tyms基因检测标准品、人类β-actin基因检测标准品稀释后等体积混合均匀得到标准对照品。进一步的，所述步骤1)中tyms基因检测标准品的制备方法为：根据ncbi数据库公布的tyms基因(geneid:7298)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到t载体中，利用大肠杆菌dh5α菌株转化并提取质粒，作为tyms基因检测标准品。进一步的，所述tyms基因检测标准品的碱基序列(seqidno:7)为：ccaggtgactttatacacactttgggagatgcacatatttacctgaatcacatcgagccactgaaaattcagcttcagcgagaacccagacctttcccaaagctcaggattcttcgaaaagttgagaaaattgatgacttcaaagctgaagactttcagattgaagggtacaatccgcatccaactattaaaatggaaatggctgtttag。进一步的，所述步骤2)中β-actin基因检测标准品的制备方法为：根据ncbi数据库公布的β-actin基因(geneid:60)序列进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到t载体中，利用大肠杆菌dh5α菌株转化并提取质粒，作为β-actin基因检测标准品。进一步的，所述β-actin基因检测标准品的碱基序列(seqidno:8)为：acctgtacgccaacacagtgctgtctggcggcaccaccatgtaccctggcattgccgacaggatgcagaaggagatcactgccctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttccagcagatgtggatcagcaagcaggag。进一步的，步骤1)、2)中pcr扩增的条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环；第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒(收集信号)，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃收集vic信号，执行实时pcr。进一步的，一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：1)以梯度浓度的人类tyms基因检测标准品为模板，加入用于tyms基因表达水平检测的特异性引物、探针和pcr反应试剂，组成pcr反应体系ⅰ；将所述pcr反应体系ⅰ进行pcr扩增，绘制tyms基因标准曲线；2)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入所述pcr反应体系ⅰ；将所述pcr反应体系ⅰ进行pcr扩增，扩增结果对照步骤1)中的tyms基因标准曲线，获得tyms基因表达量(初始拷贝数)n1/μl；3)以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物、探针和pcr反应试剂，组成pcr反应体系ⅱ；将所述pcr反应体系ⅱ进行pcr扩增，绘制β-actin基因标准曲线；4)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入所述pcr反应体系ⅱ，将所述pcr反应体系ⅱ进行pcr扩增，扩增结果对照步骤3)中的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)n2/μl；5)将所述人类tyms基因检测标准品、人类β-actin基因检测标准品分别稀释为2×n1/μl、2×n1/μl后，等体积混合均匀后得到标准对照品。一种采用上述制备方法得到的人类tyms基因表达量检测标准对照品，用于tyms基因表达水平检测及用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物、探针核苷酸序列为：tyms基因上游引物，tyms-f：cacatatttacctgaatcacatc(seqidno:1)，tyms基因下游引物，tyms-r：taatagttggatgcggattgta(seqidno:2)，tyms基因检测探针，tyms-p：fam-ttccctctgctgacaaccaaacgt-trama(seqidno:3)；β-actin基因上游引物，β-actin-f：ccgacaggatgcagaaggag(seqidno:4)，β-actin基因下游引物，β-actin-r：aggatggagccgccgat(seqidno:5)，β-actin基因检测探针，β-actin-p：vic-cacccagcacaatgaagatcaagatca–trama(seqidno:6)。进一步的，用于tyms基因表达水平检测的探针5’端荧光基团为适用于荧光定量pcr分析的常规使用的荧光报告基团，所述荧光报告基团为fam、vic、hex、cy5或者rox，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量pcr的常规使用的荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为tamra、bhq1、bhq2、mgb或者dabcy1。进一步的，所述5’端的荧光报告基团为fam，3’端的荧光淬灭基团为tamra。进一步的，用于β-actin基因表达水平检测的探针5’端荧光基团为适用于荧光定量pcr分析的常规使用的荧光报告基团，所述荧光报告基团为fam、vic、hex、cy5或者rox，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量pcr的常规使用的荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为tamra、bhq1、bhq2、mgb或者dabcy1。进一步的，所述5’端的荧光报告基团为vic，3’端的荧光淬灭基团为tamra。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)以患者tyms基因及β-actin基因表达量的中位值为标准参考，利用人工构建tyms基因和β-actin基因标准品模拟中位值，并制备标准对照品，标准对照品可以长期保存；(2)本发明通过标准对照品判定tyms基因表达量水平高低，不需要再做大规模样本统计确定临床中位值，操作简单，节约时间和成本。附图说明图1为本发明一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的tyms基因标准曲线。图2为本发明一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的β-actin基因标准曲线。图3为本发明一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的标准对照品扩增曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。实施例1：人类tyms基因表达量检测标准对照品组成1、用于检测tyms基因表达水平检测的引物组和探针：tyms基因上游引物，tyms-f：cacatatttacctgaatcacatc(seqidno:1)tyms基因下游引物，tyms-r：taatagttggatgcggattgta(seqidno:2)tyms基因检测探针，tyms-p：fam-ttccctctgctgacaaccaaacgt-trama(seqidno:3)上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量pcr分析的常规使用的荧光报告基团，选用fam、vic、hex、cy5或者rox，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量pcr的常规使用的荧光淬灭基团，选用tamra、bhq1、bhq2、mgb或者dabcy1。在一优选实施例中，检测探针5’端荧光基团为fam，检测探针3’端荧光淬灭基团为tamra。2、用于检测内参基因β-actin表达水平的引物组和探针：β-actin基因上游引物，β-actin-f：ccgacaggatgcagaaggag(seqidno:4)β-actin基因下游引物，β-actin-r：aggatggagccgccgat(seqidno:5)β-actin基因检测探针，β-actin-p：vic-cacccagcacaatgaagatcaagatca–trama(seqidno:6)上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量pcr分析的常规使用的荧光报告基团，选用fam、vic、hex、cy5或者rox，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量pcr的常规使用的荧光淬灭基团，选用tamra、bhq1、bhq2、mgb或者dabcy1。在一优选实施例中，检测探针5’端荧光基团为vic，检测探针3’端荧光淬灭基团为tamra。3、血液标准品收集1001例患者血液样本，利用1和2中tyms基因表达水平检测的引物组和探针以及β-actin基因表达水平检测的引物组和探针检测1001例患者血液中tyms基因和β-actin基因表达量，选出1001例中位值患者(tyms基因相对于β-actin基因表达量)血液样本提取的rna反转录的cdna作为血液标准品。4、tyms基因检测标准品根据ncbi数据库公布的tyms基因(geneid:7298)序列以基因工程的方法进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到t载体中，利用大肠杆菌dh5α菌株转化并提取质粒，nanodrop2000测定浓度和纯度备用，以此作为tyms基因检测标准品。tyms基因检测标准品碱基序列如下：ccaggtgactttatacacactttgggagatgcacatatttacctgaatcacatcgagccactgaaaattcagcttcagcgagaacccagacctttcccaaagctcaggattcttcgaaaagttgagaaaattgatgacttcaaagctgaagactttcagattgaagggtacaatccgcatccaactattaaaatggaaatggctgtttag(seqidno:7)将已知拷贝数的tyms基因检测标准品10倍梯度稀释成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copy/ul备用。5、β-actin基因检测标准品根据ncbi数据库公布的β-actin基因(geneid:60)序列以基因工程的方法进行质粒构建；合成该序列基因片段，然后把该片段插入到t载体中，利用大肠杆菌dh5α菌株转化并提取质粒，nanodrop2000测定浓度和纯度备用，以此作为β-actin基因检测标准品。β-actin基因检测标准品碱基序列如下：acctgtacgccaacacagtgctgtctggcggcaccaccatgtaccctggcattgccgacaggatgcagaaggagatcactgccctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttccagcagatgtggatcagcaagcaggag(seqidno:8)将已知拷贝数的β-actin基因检测标准品10倍梯度稀释成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copy/ul备用。6、pcr反应液pcr反应液除了包含1、2描述的引物、探针，还包含了pcr反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dntp等物质。实施例2：人类tyms基因表达量检测标准对照品的制备方法一种人类tyms基因表达量检测标准对照品的制备方法，包括以下步骤：1)以梯度浓度的人类tyms基因检测标准品为模板，加入用于tyms基因表达水平检测的特异性引物、探针和pcr反应试剂，组成pcr反应体系ⅰ；将pcr反应体系ⅰ进行pcr扩增，绘制tyms基因标准曲线。参见附图1，收集1001患者新鲜血液样本，按照实施例1中4的方法制备tyms基因检测标准品，加入实施例1中1的用于tyms基因表达水平检测的特异性引物、探针，加入pcr反应试剂组成pcr反应体系ⅰ；将pcr反应体系ⅰ进行pcr扩增，绘制tyms基因标准曲线。pcr反应体系ⅰ如下：2)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入步骤1)中的pcr反应体系ⅰ；将pcr反应体系ⅰ进行pcr扩增，扩增结果对照步骤1)中的tyms基因标准曲线，获得tyms基因表达量(初始拷贝数)n1/μl。pcr扩增条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒(收集信号)，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃收集fam和vic信号，执行实时pcr。3)参见附图2，按照实施例1中5的方法制备β-actin基因检测标准品，以梯度浓度的人类β-actin基因检测标准品为模板，加入用于β-actin基因表达水平检测的特异性引物、探针和pcr反应试剂，组成pcr反应体系ⅱ；将所述pcr反应体系ⅱ进行pcr扩增，绘制β-actin基因标准曲线。pcr反应体系ⅱ如下：组分名称体积(μl)5×colorlessgoqflexibuffer4.0mgcl2solution(25mm)2.0pcrnucleotide(10mm)0.5hotstartpolymerase(5u)0.15β-actin-f(10um)0.5β-actin-r(10um)0.5β-actin-p(10um)0.4template1.0ddh2o补充至20.04)以血液标准品提取的rna反转录的cdna为模板，加入步骤3)中的pcr反应体系ⅱ，将pcr反应体系ⅱ进行pcr扩增，扩增结果对照步骤3)中的β-actin基因标准曲线，获得β-actin基因表达量(初始拷贝数)n2/μl。pcr扩增条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒(收集信号)，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃收集fam和vic信号，执行实时pcr，记录每个样本的δct，δct＝ct(tyms)-ct(β-actin)。5)将上述人类tyms基因检测标准品稀释为2×n1/μl、人类β-actin基因检测标准品稀释为2×n2/μl后，将两个稀释好的基因检测标准品等体积混合均匀后得到标准对照品。实施例3：人类tyms基因表达量检测标准对照品的检测为了更好地验证本标准品的效果，本实施例二进行了标准对照品验证实验，验证实验包括以下步骤：以实施例1中3所得中位值患者的cdna及实施例2中所制备的标准对照品为模板分别进行荧光定量pcr。pcr体系组成如下表：组分名称体积(μl)5×colorlessgoqflexibuffer4mgcl2solution(25mm)2pcrnucleotide(10mm)0.5hotstartpolymerase(5u)0.15tyms-f(10um)0.5tyms-r(10um)0.5tyms-p(10um)0.4β-actin-f(10um)0.5β-actin-r(10um)0.5β-actin-p(10um)0.4template1ddh2o补充至20.0pcr扩增条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃收集fam和vic信号，执行实时pcr。实验结果：参见说明书附图3，中位值患者样本cdna与所制备的标准对照品中tyms基因相对β-actin基因表达量检测扩增曲线基本一致。可见，本发明中制备的标准对照品可以直接评价某一样本tyms基因表达量水平高低，不需要再大规模检测样本确定中位值，可以对比检测样本中tyms基因表达水平高低直接用于指导临床用药，方便快捷。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本
技术领域：
的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>重庆浦洛通基因医学研究院有限公司<120>一种人类tyms基因表达量检测标准对照品<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cacatatttacctgaatcacatc23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2taatagttggatgcggattgta22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttccctctgctgacaaccaaacgt24<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccgacaggatgcagaaggag20<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aggatggagccgccgat17<210>6<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cacccagcacaatgaagatcaagatca27<210>7<211>210<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccaggtgactttatacacactttgggagatgcacatatttacctgaatcacatcgagcca60ctgaaaattcagcttcagcgagaacccagacctttcccaaagctcaggattcttcgaaaa120gttgagaaaattgatgacttcaaagctgaagactttcagattgaagggtacaatccgcat180ccaactattaaaatggaaatggctgtttag210<210>8<211>209<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8acctgtacgccaacacagtgctgtctggcggcaccaccatgtaccctggcattgccgaca60ggatgcagaaggagatcactgccctggcacccagcacaatgaagatcaagatcattgctc120ctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccacct180tccagcagatgtggatcagcaagcaggag209当前第1页12