基于转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于gfp-gr-purohela细胞转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法。

背景技术：

慢病毒(lentivirus)载体是以人类免疫缺陷i型病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1，hiv-1)为基础发展起来的一种基因治疗载体。基因工程中较为常用的病毒载体有三种：逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。其中，逆转录病毒载体只能感染分裂期的细胞，且载体容量有限；腺病毒在感染细胞后，目的基因一般不能整合至宿主细胞的染色体上，只能进行瞬时感染表达；而慢病毒不同于前面两种病毒，其不仅具有可感染分裂期和非分裂期细胞的能力，而且还具有载体容纳外源性基因片段大，以及可长期表达目的基因的特点。

糖皮质激素是肾上腺皮质激素的一种，可分别通过糖皮质激素受体(glucocorticoidsreceptor,gr)和盐皮质激素受体(mineralocorticoidsreceptor，mr)发挥其功能。自然条件下，机体通过昼夜循环进行糖皮质激素释放和调节，过量或长期低剂量糖皮质激素类药物暴露，会引起机体免疫抑制及多种副作用产生，如代谢紊乱、高血压、肥胖、性成熟提前以及生育力降低等。

糖皮质激素类药物可用于治疗肾上腺皮质功能不全、炎症、过敏以及多种皮肤疾病等；在养殖业中也广泛使用，常见药物有地塞米松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松等。随着药物的广泛使用，通过人源及畜禽饲养排放，经过畜禽迁移代谢以及生态环境迁移归趋后，已知分子结构的糖皮质激素类药物可能发生结构变化，从而产生结构类似并具有糖皮质激素内分泌干扰效应的未知污染物。这些已知和未知的污染物以更为复杂、多样的方式在生物和生态链中富集和迁移，将最终影响人类身体健康和环境生物的多样性。大量已知和未知糖皮质激素类混合物及其代谢产物可能会被漏检或无法检出，而现有质谱和酶联免疫等方法在满足高通量、灵敏度、时间和成本之间存在不平衡。

目前尚未大量针对糖皮质激素类混合物进行摸底排查和风险监测，原因主要在于成本昂贵和检测时间较长。因此，开发新型、通量更高、成本更低、更为广谱性/非靶向性，以及节省检测时间的监测检测方法至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于转基因工程细胞株检测糖皮质激素类混合物的检测方法，通过基因工程手段将gfp和gr的融合蛋白作为目的基因，克隆到慢病毒载体质粒中，构建转基因工程细胞株，基于该细胞株通过测定gfp-gr结合激素配体从细胞质区域迁移至细胞核区域的迁移比率，可以高通量、低成本、快速的检测不同样品中的糖皮质激素类混合物含量。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种转基因工程细胞株，通过慢病毒感染方式，将绿色荧光蛋白gfp和糖皮质激素受体gr融合蛋白基因整合入hela细胞染色体中，通过嘌呤霉素puro筛选，最终获得稳定表达gfp-gr的hela细胞株。

本发明还提供一种基于所述的转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法，包括以下步骤：

步骤1：利用慢病毒包装gfp-gr基因，再感染hela细胞，获取gfp-gr-purohela细胞转基因工程细胞株；

步骤2：向所构建的gfp-gr-purohela转基因工程细胞株中加入糖皮质激素类混合物后，通过测定荧光信号从细胞质向细胞核区域的迁移比率，定量和半定量确定糖皮质激素类含量(具体为测定阳性检测率)，以地塞米松计灵敏度可达为10^-9mol/l。

优选的是，步骤1中构建gfp-gr-purohela细胞转基因工程细胞株具体包括以下步骤：

步骤a：将合成的gfp-gr目的基因连接到病毒载体fv026上，构建lenti-gfp-gr载体；

步骤b：将lenti-gfp-gr载体、pspax2载体、pmd2g载体按着质量比2:1:1混合，按照脂质体介导法转染293t细胞，进行病毒包装；

步骤c：将步骤b中检测合格的病毒悬液用于感染hela细胞，再用含有嘌呤霉素puro的dmem完全培养基进行筛选，得到所述gfp-gr-purohela细胞转基因工程细胞株。

优选的是，步骤b中所述293t细胞用于转染前，先进行消化，重新接种到细胞培养皿中，待生长至汇合率80％-90％即可用于转染实验。

优选的是，检测合格的病毒悬液的滴度为1e+7tu/ml。

本发明提供一种所述的转基因工程细胞株的应用，

应用于医药健康、食品安全及环保领域，定量检测体液、食品及环境水源中糖皮质激素类混合物的含量。

优选的是，应用于定量检测人体和畜禽体液、乳品、污水不同样本中的糖皮质激素类混合物的含量。

本发明公开了以下技术效果：

本发明使用的慢病毒载体主要包括载体质粒fv026辅助质粒pspax2(phelper1)和辅助质粒pmd2g(phelper2)三种质粒。以绿色荧光蛋白和糖皮质激素受体的融合蛋白基因为目的基因，通过基因工程手段将目的基因克隆到慢病毒载体质粒中；再将载体质粒和两个辅助质粒三者共转染到293t细胞，完成病毒包装；制备好的病毒上清液经纯化后再次感染293t细胞，进行病毒滴度检测；最后用检测好的病毒上清液感染宿主hela细胞，通过嘌呤霉素筛选，获得稳定转染gfp-gr的hela细胞。

筛选的稳定转染gfp-gr的hela细胞可用于糖皮质激素类内分泌干扰效应检测，细胞培养环境中不存在糖皮质激素类混合物时，gfp-gr以结合多种热休克蛋白和免疫亲和素的蛋白复合体形式存在于细胞质中；当有糖皮质激素类混合物时，gfp-gr结合相应激素配体并从蛋白复合体中脱离出来，进而迁移至细胞核区域。该过程gfp-gr绿色荧光信号由细胞质移动到细胞核区域，测定质核迁移比率，此比率可作为阳性判定及半定量检测样本糖皮质激素类含量水平的依据。本申请实现了高通量、低成本、快速的定量检测样本中糖皮质激素类混合物。

附图说明

图1为gfp-gr-purohela转基因工程细胞株的监测原理机制图；a为慢病毒包装和感染宿主细胞原理示意图；b为转基因细胞添加糖皮质激素类药物时引发质核迁移示意图；c为高内涵筛选系统；

图2为lenti-gfp-gr电泳图；泳道m、6、7和8分别为marker和lenti-gfp-gr载体(fc-2338)；

图3为三质粒共转染293t细胞,分别采集转染24h、48h的细胞明场和gfp图像；

图4为病毒感染293t细胞判断滴度，分别采集加入100μl和10μl病毒上清液感染293t细胞的明场和gfp图像；

图5为筛选后gfp-gr-purohela细胞的明场和gfp图像；brightfield为明场，gfp为荧光信号；100x和200x分别代表放大100倍和200倍；

图6为gfp-gr-purohela细胞荧光信号质核转移情况；control组加入dmso(0.1％)；17β-e2组为添加10^-7mol/l雌二醇；dexa组添加10^-7mol/l地塞米松；给药后孵育1h后，固定细胞及hochest33324染色；高内涵采集图像，20×水镜，共聚焦模式；dpc为digitalphasecontrast通道，merge为gfp和hochest33324通道叠加效果；

图7为细胞区域分选结果，利用hochest33342和dpc通道分别分选细胞核和细胞整体区域，通过两者相差得到细胞质区域；

图8为dmso及17β-estradiol、dexamethasone、betamethasone、beclomethasone、prednisone、prednisolone、meprednison、methylprednisolone等8种药物在1h对gfp-gr-purohela细胞质核迁移情况的影响；

图9为四种药物的分子结构；

图10为1×10^-13mol/l、1×10^-11mol/l、1×10^-9mol/l、1×10^-7mol/l和1×10^-6mol/l5个浓度水平下的dexamethasone分别作用于0.5h、1h和3h对gfp-gr-purohela细胞质核迁移情况的影响；

图11为fv026载体(大小8.1kb)、辅助质粒pspax2、辅助质粒pmd2g的图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

基于gfp-gr-purohela细胞转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法

1、目的基因合成

gfp-gr全基因(如seqidno：1所示)合成(ptet-gfp-gr)，由南京金斯瑞公司完成。

2、质粒抽提和测序

ptet-gfp-gr通过热激法转化入大肠杆菌trans5α感受态细胞，涂lb(amp)平板，37℃培养。挑取单克隆菌株，在100mllb(amp)液体培养基中培养过夜，利用genestar无内毒素质粒中抽试剂盒进行质粒抽提。

质粒浓度857.6ng/μl，od260/280＝1.89；取20ul样品，送生工测序和鉴定。

3、载体构建

测序正确的质粒，利用pcr扩增gfp-gr目的片段，纯化pcr产物；慢病毒载体质粒fv026经过酶切线性化处理，后续将纯化的gfp-gr片段与慢病毒载体连接，构建lenti-gfp-gr载体(记为fc-2338，见图2所示)。

4、病毒包装和滴度检测

1)脂质体转染实验前，将293t细胞消化，重新接种到细胞培养皿中，待生长至汇合率80％左右即可用于转染实验。共转染的三个质粒按照lenti-gfp-gr：pspax2：pmd2g质量比为2:1:1进行混合；按照转染试剂操作说明，将质粒、转染试剂和opti-mem分别混合，最终混合后静置15min，随后加入到293t细胞培养皿中。培养6-8h后，更换成新鲜dmem完全培养基(10％fbs)；

2)转染24h后，利用荧光显微镜判断转染效率(如图3所示)。当荧光细胞比例大于70％，即为转染成功，可收集细胞培养液，4℃保存。细胞培养皿中更换新鲜dmem完全培养基；

3)转染48h后，再次观察荧光蛋白表达情况，第二次收集培养液；

4)收获的含有病毒颗粒的培养液经过0.22μm滤膜过滤，80000g离心4h，沉淀用virusstorebuffer重悬，再经过滤膜过滤除菌；

5)病毒滴度检测前，将293t细胞按照1×10⁴个/孔接种细胞于96孔板中，培养基为dmem(2％fbs)。取纯化除菌好的病毒上清液进行梯度稀释种板，即病毒上清液100μl、10μl、1μl、0.1μl。感染48h后观察gfp表达情况，并根据荧光比例，判定最终滴度为1e+7tu/ml(如图4所示)。

5、感染宿主hela细胞

1)感染实验前，需将hela细胞按3×10⁴个/孔种于96孔板中，病毒用lv-enhance稀释至滴度为1×10⁶tu/ml和1×10⁵tu/ml，并滴加入孔内培养。观察8h后细胞状态，视情况更换为dmem完全培养基。感染3-4d后，观察gfp荧光表达情况判断感染效率，选择最佳感染滴度；

2)hela细胞接种于6孔板中，待汇合率70-80％即可进行病毒感染实验，空白对照以无菌水替代病毒上清液；感染24-48h后，更换新鲜培养基为dmem完全培养基(含2μg/ml的嘌呤霉素puro)，继续培养待空白对照中细胞死亡，感染组细胞存活。

6、稳株细胞筛选

1)用dmem完全培养基(含puro)培养至感染组中未感染的阴性细胞死亡，去除死细胞，更换新鲜培养基；

2)细胞培养稳定后更换为不含puro的完全培养基继续培养；

3)当细胞汇合率达到90％左右，消化，扩大培养，连续稳定培养三代后扩大冻存，命名为gfp-gr-purohela(如图5所示)。

实施例2

糖皮质激素类混合物的检测与验证

1、实验方法

对实施例1筛选出的稳株细胞gfp-gr-purohela进行17β-雌二醇(17β-estradiol)(阴性)、地塞米松(dexa)(阳性)，以及其他几种糖皮质激素类药物的给药实验，作用时间均为0.5h，然后检测该细胞质核迁移响应情况。

为尽可能排除培养基和血清中的影响因素，提前1d将细胞培养基更换为无酚红mem(+10％活性炭处理血清，10％cd-fbs)完全培养基。随后，将gfp-gr-purohela消化计数，按照10⁴个/孔接入黑色96孔板(3603，corning)。培养过夜后，分别加入空白对照(dmso)，阴性对照雌二醇(17β-e2)以及阳性药物地塞米松(dexa)和其他几种糖皮质激素药物(泼尼松和甲基泼尼松等)，浓度均为10^-7mol/l，每个浓度设5个平行；37℃的co2培养箱中放置1h后进行细胞固定以及hochest33342(ex/em350/361nm)染色(如图6所示)。

2、数据处理

高内涵筛选系统进行区域分选和gfp信号强度导出：利用获得的图像，首先以hochest33342通道进行细胞核的分选，再利用dpc信号通道进行细胞整体区域的分选；随后，通过两个区域相差，获得细胞质区域(如图7所示)；最终利用高内涵系统分别计算给出每孔的细胞核和细胞质区域的平均gfp信号强度；

3、结果计算

不同药物组的质核迁移比率计算：以空白对照(dmso)质核迁移比率为1，dexa等不同药物组的质核迁移比率(如图8所示)。实验中涉及到的所有药物的作用浓度均为10^-7mol/l。其中，泼尼松(prednisone)和甲基泼尼松(meprednisone)两种糖皮质激素类药物的质核迁移比率虽高于阴性对照，但比其他药物的低；这是由于此两种药物的活性位置为醛基(如图9所示红色圆圈部分)，属于非激活状态；而其他药物该部位为羟基，属于激活态。

实施例3

1、实验方法

同样对实施例1筛选出的稳株细胞gfp-gr-purohela进行空白对照(dmso)以及1×10^-13mol/l、1×10^-11mol/l、1×10^-9mol/l、1×10^--7mol/l和1×10^-6mol/l5个浓度水平下dexa的给药实验，作用时间分别为0.5h、1h和3h，分析对gfp-gr-purohela细胞质核迁移情况的影响，旨在检测和筛选最佳作用时间及方法灵敏度；

为尽可能排除培养基和血清中的影响因素，同样提前1d将细胞培养基更换为无酚红mem(+10％活性炭处理血清，10％cd-fbs)完全培养基。随后，将gfp-gr-purohela消化计数，按照10⁴个/孔接入黑色96孔板(3603，corning)。培养过夜后，分别加入5个浓度水平的dexa，每个浓度设5个平行；37℃、5％co2培养箱中分别作用0.5h、1h和3h后取出进行细胞固定以及hochest33342(ex/em350/361nm)染色。

高内涵数据获取方法和过程完全与实施例2同。

2、结果计算

1×10^-13mol/l、1×10^-11mol/l、1×10^-9mol/l、1×10^-7mol/l和1×10^-6mol/l5个浓度水平(浓度采用log处理)的dexa等获取质核迁移比率，扣除dmso空白水平(如图10所示)。结果显示：在1×10^-13mol/l-1×10^-9mol/l之间，dexa表达几乎处于dmso基线水平，但在>1×10^-9mol/l水平后，即可发现质核迁移比率显著上升，可见该方法灵敏度大致为>1×10^-9mol/l(以dexa计)，同时在分别作用0.5h和1h条件下，质核迁移比率下降不显著，细胞表达较为稳定，因此药物作用gfp-gr-purohela最佳时间范围区间为0.5h-1h。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120>基于转基因工程细胞株测定糖皮质激素类混合物的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3147

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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