一种诊断结直肠癌肝转移的标志物的制作方法

本发明属于结直肠癌诊断技术领域，具体涉及一种作为诊断结直肠癌肝转移标志物的血浆外泌体circrna。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcancer，crc)作为消化系统常见肿瘤，其发病率和死亡率一直持逐年升高的趋势，根据2018年最新的全球癌症统计数据显示，在统计的36种癌症中，结直肠癌发病率排名第三位10.2％，死亡率排名第二位9.2％。而结直肠癌肝转移(colorectalcancerlivermetastasis，crlm)是结直肠癌患者最主要的死亡原因。在2018年中国结直肠癌肝转移诊断和综合治疗指南中显示，未经治疗的结直肠癌肝转移患者的中位生存期仅6.9个月，无法切除患者的5年生存率低于5％；而肝转移病灶能完全切除患者的中位生存期为35个月。由此可见，早期诊断结直肠肝转移对患者的预后至关重要。目前对于结直肠癌肝转移的诊断主要通过肝脏超声、ct、肝脏mri；经皮穿刺活检作为有创性检查在临床上也仅限于病情需要时应用；血液肿瘤标志物cea、ca19-9对结直肠癌肝转移的早期诊断也缺乏特异性，因此寻找具有特异性的早期诊断结直肠肝转移的分子标志物仍是学者们关注的问题。

外泌体是直径为40-100nm的纳米级双层膜囊泡，通常以杯形出现。多种人类细胞可以通过细胞外分泌释放外泌体，这些囊泡广泛分布于血液，唾液，尿液和其他体液中。外泌体可以携带脂质体，蛋白质，mrna和非编码rna到达靶组织，并且可以参与细胞通讯，免疫反应以及肿瘤的生长和迁移。

研究发现，circrna在外泌体中稳定且丰富。环状rna(circrna)是一类天然存在的非编码rna，通过反向剪接前体rna(pre-mrna)形成共价闭合结构。circrna具有重要的特性，如通用性，保守性，稳定性和组织或发育阶段特异性，这也使其成为临床疾病的潜在理想诊断标记。circrna的研究最广泛的作用是作为microrna(mirna)的海绵，后者通过与mirna反应元件(mre)相互作用来调节下游基因。

与血液中游离的rna相比，测量外泌体衍生的rna作为生物标记具有许多优势。一方面，外泌体膜可以有效地保护内含物免受rnase降解，从而保持循环血液中外泌体rna的完整性和功能性。另一方面，癌细胞将外泌体分泌到外周循环液中，而外泌体rna可以更准确地反映出肿瘤演化过程中癌细胞的变化。circrna稳定且在血液，唾液和外泌体中含量丰富，是癌症早期诊断和预后的有希望的指标。人血清外泌体包含大量完整和稳定的circrna，其作为未来肿瘤检测的生物标志物具有巨大潜力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种诊断结直肠癌肝转移的标志物。

一种诊断结直肠癌肝转移的标志物，为人血浆外泌体中的hsa_circ_0080091。

所述hsa_circ_0080091在结直肠癌肝转移患者的血浆外泌体中表达量升高。

结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与fgfr3的表达水平与mir-99b-5p呈现负相关趋势。

一种诊断结直肠癌肝转移的试剂盒，包括hsa_circ_0080091。

hsa_circ_0080091、mir-99b-5p和fgfr3在调控结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭中的应用。

本发明的有益效果：本发明利用微阵列分析用于检测血浆外泌体中差异表达的circrna(de-circrna)，并证实这些候选circrna确实确实存在差异并且可以用作潜在的结直肠癌诊断生物标记。结果发现结直肠癌患者血浆外泌体中的hsa_circ_0080091表达改变可以作为诊断结直肠癌肝转移的标志物的组合，这将有助于探索这种疾病的发病机理，并为crc的诊断提供新的方向。本发明还发现结直肠癌原发灶与肝转移灶中hsa_circ_0080091与fgfr3的表达水平与mir-99b-5p呈现负相关趋势；干扰或增强细胞中mir-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力；在结直肠癌中具有调控作用。

附图说明

图1为外泌体的tem图像(比例尺，100nm)。

图2为血清外泌体nta分析确认的外来体的大小范围。

图3为差异表达的circrna的热图分析。

图4为差异表达的circrna的火山图分析。

图5为qrt-pcr检测has_circ_0080091在crlm患者血清外泌体中表达上调。

图6为血清外泌体has_circ_0080091、cea、ca19-9单独诊断效能。

图7为has_circ_0080091、cea、ca19-9联合诊断效能。

图8为干扰或增强细胞中mir-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的增殖、能力。

图9为干扰或增强细胞中mir-99b-5p的表达，影响结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下述实施例中人crc细胞系(sw480，sw620，lovo，ht-29)和正常ncm460结肠上皮细胞购自中国科学院上海生物科学研究所。所有细胞系均在合适的培养环境(5％co2，37℃)下保存在补充有10％fbs(gibco)的rpmi1640培养基(gibco，美国)中。

实施例1外泌体的获取

使用超速离心从血浆中提取外泌体。解冻后，首先将血浆样品以500g离心5分钟，然后将上清液转移至新的聚碳酸酯试管中，并以2000g离心10分钟。然后将它们以10,000g离心30分钟，以消除脱落的微囊泡(smv)。收集上清液，并通过0.22μm的膜滤器(merckmillipore)渗滤，并进一步以100,000g离心2小时。将外泌体沉淀用pbs洗涤一次，并重复先前的步骤。最后，将外泌体悬浮在pbs中，并保存在-80℃下以备后用。

将通过上述方法获得的10微升悬浮的外泌体置于铜网上，静置10分钟，并用2％乙酸铀酰水溶液染色3分钟。使用滤纸擦去多余的染料，并将样品在室内温度下风干。然后通过日立h-7650透射电子显微镜(tem)观察外泌体(图1)。同时，使用来自particlemetrix(德国)的zetaview粒子追踪器通过纳米粒子追踪分析(nta)计算了外泌体的浓度和大小分布(图2)。随后，通过蛋白质印迹检测外泌体生物标志物，例如四跨膜蛋白分子cd63(abcam)，cd9(abcam)和tsg101(abcam)。

实施例2微阵列分析

分析1例直肠癌原发患者和1例结直肠癌肝转移患者血清外泌体中circrna差异表达谱。根据arraystar的标准方案完成样品制备和微阵列杂交。简而言之，用rnaser(epicentre，inc.)消化总rna，以消除外泌体中线性rna并富集circrna，然后使用随机引物技术(arraystarsuperrnalabelingkit；arraystar)将其收集，延伸并转录为荧光crna。标记的crna与arraystarhumancircrnaarrayv2(8×15k，arraystar)进一步杂交。冲洗载玻片后，利用安捷伦扫描仪g2505c扫描阵列。使用安捷伦特征提取软件(版本11.0.1.1)分析采集的图像阵列。

发明人共检测到7048个差异表达的circrna，其中在结直肠癌肝转移患者中上调的有3752个，下调的有3296个(图3-4)；与结直肠癌原发患者相比，发现结直肠癌肝转移患者血清外泌体中的hsa_circ_0080091表达明显上调(p<0.05)，与基因芯片结果趋势一致，roc曲线下面积auc为0.664，具有一定的诊断效能。

实施例3qrt-pcr分析

为了进行qrt-pcr分析，通过比较41例结直肠癌原发患者与44例结直肠癌肝转移患者临床血清样本，验证筛选出的circrna表达情况与芯片结果趋势是否一致，采用roc曲线评估其诊断价值；使用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术比较30例结直肠癌原发灶组织与14例肝转移灶组织间mirna、circrna、mrna的表达情况及相关趋势。使用exorneasy血清/血浆maxi试剂盒(qiagen)从1ml血浆样品中提取外泌体rna。根据制造商的说明，使用mirneasyminikit(qiagen)解析组织和细胞样品的总rna。使用带有gdna橡皮擦(完美实时)(takara)的primescript^tmrt试剂盒将总rna反转录为cdna。使用荧光定量pcr仪器qtower3g(德国analytikjena)和premixextaq^tmii(tlirnasehplus)(takara)对rt的产物进行分析。每个样品进行三次重复分析。

结果表明，与结直肠癌原发灶组织比较，肝转移灶组织中mir-99b-5p表达下调，hsa_circ_0080091表达上调、fgfr3表达上调(p<0.001)，二者与mir-99b-5p表达水平均成负相关趋势(图5)。成功干扰或增强结直肠癌细胞系中的mir-99b-5p；cck8结果显示干扰mir-99b-5p表达后，细胞增殖能力加强(p<0.001)；过表达mir-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(p<0.001)(图6)；划痕实验采用愈合率评价转染后细胞迁移能力显示，干扰mir-99b-5p表达后，细胞迁移能力加强(p<0.01)；增强mir-99b-5p后，细胞迁移能力减弱(p<0.05)；transwell分析细胞迁移能力结果表明，干扰mir-99b-5p表达后，细胞侵袭能力加强(p<0.05)；增强mir-99b-5p后，细胞增殖能力减弱(p<0.001)(图7)；qrt-pcr、westernblot实验表明，与对照组相比，干扰mir-99b-5p表达后，hsa_circ_0080091表达上调(p<0.01)，fgfr3表达上调(p<0.001)，在蛋白水平表达上调(p<0.01)；增强mir-99b-5p后，hsa_circ_0080091表达下调(p<0.01)，fgfr3表达下调(p<0.001)，在蛋白水平表达下调(p<0.01)(图8-9)；双荧光素酶报告基因实验发现，野生型质粒载体与mirna-99b-5pmimic、mirna-99b-5pmimicnc共转染后，荧光值减低(p<0.001)，突变型质粒载体与mirna-99b-5pmimic、mirna-99b-5pmimicnc共转染后，荧光值无明显差异(p>0.05)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。