一种角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法及应用与流程

本发明属于生物医疗技术领域，涉及角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法及应用，具体涉及在血管生成（angiogenesis）和/或淋巴管生成（lymphangiogenesis）研究领域中，常用的小鼠角膜微口袋实验技术过程中，一种新的微丸制备方法及该微丸在血管生成及淋巴管生成中研究中的应用。

背景技术：

肿瘤和心血管疾病是严重危害人类健康两大疾病，血管生成（angiogenesis）和淋巴管生成（lymphangiogenesis）在肿瘤和心血管疾病中发挥重要作用，是医学和生命科学领域的一个重要研究方向和治疗靶点。以血管生成为靶点在临床上的治疗，如抗血管生成在肿瘤和眼科疾病中已取得了一定的标志性成功，促血管生成是治疗心血管疾病(如心肌缺血、心脏肥大等)的理想策略。由于血管生成和淋巴管生成的过程复杂，是多细胞多因素参与调控的多阶段的过程，虽然体外模型也有一定的优势，但是体内模型仍是研究血管生成和淋巴管生成的可靠选择。

小鼠角膜微口袋模型是研究病理性血管生成和淋巴管生成的一个常用模型，它利用无血管分布的角膜进行显微操作，将事先制作好的微丸植入到角膜中，触发角膜中形成新的血管或淋巴管，进而对这些新生的血管在裂隙灯显微镜下进行可视化评估和对血管面积进行定量评估血管生成情况，或者进行进一步的细胞水平或分子水平分析。也可以通过特定的分子标记物显示淋巴管，从而使淋巴管生成的研究成为可能。此外，该模型还可以评估辐射对血管生成素的影响，评价血管生成调节剂药物或治疗情况，以及比较不同的遗传背景对血管生成的影响等研究方面的应用。因为新血管生长在天然的无血管组织角膜中，所以不需要测量背景血管，可减少实验过程中的背景干扰。因此，小鼠角膜微口袋模型是一种可视、可定量、重复性强且灵活的评价体内血管生成的方法。

目前，小鼠角膜微口袋模型通过使用包含特定生长因子的标准化缓释微丸，手术植入小鼠角膜，5或6天即可触发自身无血管的角膜生长出新的血管。微丸的制作是这一模型的关键，要求微丸必须统一、没有炎症活性，并且对促血管或淋巴管生成的分子具有可溶性且分布均一性。目前微丸的制作通常是将碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）或血管内皮生长因子（vegf）等促血管或促淋巴管生长因子配置成底物，与硫糖铝（sucralfate）混合后，再和加入酒精中的氢聚合物（hydronpolymer）充分混合制成悬浮液，然后，浇筑到尼龙网布上，晾干撕开网孔得到微丸。然而该方法耗时长、操作复杂、一次制作的微丸很多、获得的微丸并非严格意义上完全大小相同、且长时间保存易产生不稳定，因此，亟需改良了微丸制备方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种更简单、易操作、经济实惠、可现用现配的角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法及应用，以解决背景技术中所提出方法耗时长、操作复杂、一次制作的微丸很多、获得的微丸并非严格意义上完全大小相同、且长时间保存易产生不稳定的问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法，其特征在于，包括以下过程：

（1）、生长因子的配置和matrigel的分装过程

（1-1）、vegf的配置：vegfa粉末溶解于无菌水中，储存浓度为100ug/ml，置于-80℃保存；

（1-2）、heparin的配置heparin用无菌水溶解，储存浓度为25ku/ml，置于-20℃保存；

（1-3）、将matrigel在冰盒上操作分装，1ml/管，置于-80℃冰箱保存；

（2）、matrigel的准备过程

（2-1）、根据实验需要，将matrigel从-80℃冰箱取出放置到4℃过夜，使其充分溶解为液态；

（2-2）、第二天，将matrigel与dmem进行1:1混合均匀，然后，将vegfa和heparin加入到混合物中，充分混匀；

（2-3）、vegfa用量为100ng/微丸，heparin的浓度为30u/ml；

（3）、微丸的制作过程

（3-1）、准备好无菌10cmdish放入无菌操作台上，调节10ul移液器至8ul，吸取matrigel配置好的混合液8ul，滴在无菌培养皿中，形成一个圆滴；然后将皿盖盖好放入，做好标识，放置37度培养箱孵育1-2小时；

（3-2）、孵育后，放置到-20℃过夜，待手术时用无菌刀片刮下微丸。

进一步的，所述步骤（3）所制作的微丸可保存在-20°c冰箱中3个月，待使用时将10cmdish中的微丸刮下即可。

进一步的，所述步骤（2）中的混合物始终保持在冰上，且无菌操作。

本发明的实施例还提出角膜微口袋手术实验中微丸在血管生成和淋巴管生成研究中的应用，其特征在于，在小鼠实验研究中，小鼠麻醉状态下，在解剖显微镜下，将微丸植入到角膜中，植入后的第5-7天，用裂隙灯显微镜进行拍照观察血管生成情况，可观察到小鼠角膜的血管生成情况。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

（1）本发明的角膜微口袋手术实验中微丸制备方法和传统方法相比更简单、易操作、更经济、避免了传统方法一次制作大量微丸，需要长期保存的问题，本发明的微丸可现用现配，微丸制作简单、易操作、制作的微丸大小相同均一性强、而且可以根据每次实验的需要进行新鲜制作，本发明的微丸制备方法可以使得角膜微口袋实验模型更简单、易操作且重复性强更加灵活。

（2）本发明提供的微丸制备方法及应用，可使得小鼠角膜微口袋模型在肿瘤或者缺血性疾病的相关研究中具有更好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法所制备的微丸在角膜微口袋手术实验中裂隙灯显微镜下血管生成情况图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实验材料

1、matrigel（bdbioscience）；

2、vegf（北京义翘神州）；

3、heparin（sigma）；

4、dmem/highglucose（hyclone）。

实施例

一、生长因子如vegf、heparin的配置和matrigel的分装

vegfa粉末溶解于无菌水中，储存浓度为100ug/ml，置于-80℃保存；heparin用无菌水溶解，储存浓度为25ku/ml，置于-20℃保存；将matrigel在冰盒上操作分装，1ml/管，置于-80℃冰箱保存。

二、matrigel的准备

根据实验需要，将适量matrigel从-80℃冰箱取出放置到4℃过夜，使其充分溶解为液态。第二天，将matrigel与dmem进行1:1混合均匀，然后，将vegfa和heparin加入到混合物中，充分混匀。vegfa用量为100ng/微丸，heparin的浓度为30u/ml（注：混合物始终保持在冰上，且无菌操作）。

三、微丸的制作

准备好无菌10cmdish放入无菌操作台上，调节10ul移液器至8ul，吸取matrigel配置好的混合液8ul，滴在无菌培养皿中，形成一个圆滴，然后将皿盖盖好放入，做好标识，放置37度培养箱孵育1-2小时。然后放置到-20℃过夜，待手术时用无菌刀片刮下微丸。

四、微丸的保存

如果近期该实验较多，需要较多微丸，可根据实验需要一次制作多个，保存在-20°c冰箱中，待使用时将10cmdish中的微丸刮下即可，可保存3个月。

五、后续的实验过程

小鼠麻醉状态下，在解剖显微镜下，将微丸植入到角膜中，植入后的第5-7天，用裂隙灯显微镜进行拍照观察血管生成情况。

实验结果：如图1所示，裂隙灯显微镜下血管生成清晰可见，采用本发明的角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法所制作的微丸，手术后第6天，在裂隙灯显微镜下可观察到角膜的血管生成。与传统方法制作的微丸相比，本发明的角膜微口袋手术实验中微丸的制备方法方法更简单、易操作、经济实惠、可现用现配，避免了传统方法一次制作大量微丸，需要长期保存的问题。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。