一种12-酮基胆酸的制备方法与流程

一种12-酮基胆酸的制备方法，属于生物与医药技术领域，用于生产12-酮基胆酸，具体涉及12-酮基胆酸的制备方法。

背景技术：

生物催化技术是利用酶或微生物细胞或动植物细胞作为生物催化剂进行催化反应的技术。酶作为生物催化剂比化学催化剂有许多优点：酶催化反应一般在常温、常压和近于中性条件下进行，所以投资少、能耗少且操作安全高；生物催化剂具有极高的催化效率和反应速度，比化学催化反应的催化效率可高107-1013倍。

鹅去氧胆酸(cdca)为无色针状结晶，无臭、味苦。几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰乙酸、微溶于氯仿，是目前世界上用量最大的治疗胆结石药物之一。主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度，绝大多数患者服用cdca后(当cdca占胆汁中胆盐的70％时)，脂类恢复微胶粒状态，胆固醇就处于不饱和状态，从而使结石中的胆固醇溶解、脱落。大剂量的cdca(每日10-15mg/kg)可以抑制胆固醇的合成，并增加胆石症患者胆汁的分泌，但其中的胆盐和磷脂分泌量维持不变，又是合成熊去氧胆酸(udca)和其他甾体化合物的原料。

通过酶法将胆酸12位羟基转化为酮基，再经过黄鸣龙反应得到鹅去氧胆酸，由于胆酸是鸡、鸭、猪、牛、羊、兔等动物胆汁酸的主要成分，所以半合成法得到鹅去氧胆酸将大大提高其生产优势。

授权公告号：cn102007210b，公开了12α-羟类固醇脱氢酶、用于编码其的核酸序列、表达盒及载体；包含适当编码核酸序列的重组微生物；产生所述12α-羟类固醇脱氢酶的方法；使用所述酶进行酶促氧化12α-羟类固醇的方法，使用所述酶进行酶还原12-类固酮的方法，使用所述12α-羟类固醇脱氢酶定性或定量确定12-类固酮或12α-羟类固醇的方法；和制备熊去氧胆酸的方法，包括使用所述12α-羟类固醇脱氢酶酶催化胆酸氧化。

现有技术中12-酮基-石胆酸的制备如下：

现有技术中12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)高胆酸转化效率低下，不仅需要分离纯化，还需要使用辅酶协助反应，无法使鹅去氧胆酸实现规模化生产，使鹅去氧胆酸的生产成本高昂。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种12-酮基胆酸的制备方法，以解决上述现有的12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)高胆酸转化效率低下，且12α-羟基类固醇脱氢酶分离纯化成本较高的缺陷。

本发明采用的技术方案如下：

一种12-酮基胆酸的制备方法，包括如下步骤

(1)将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种按体积分数为2-6％的接种量接种到含lb液体培养基的生物培养容器中培养；

(2)培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液；

(3)诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度od(600)达到15且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12u/ml时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h；

(4)前体物质和辅助物质流加完毕后2h，检测胆酸浓度，浓度为0.3％时，结束培养。

本申请的技术方案中，含12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为菌种发酵生产12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)的过程中，当培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液，诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度od(600)达到15且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12u/ml时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h，最终得到含量高达80～150g/l的12酮基石胆酸溶液。

优选的，步骤(1)中大肠杆菌菌种发酵生产周期为17-20h。

优选的，步骤(1)中12a-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为二级发酵菌种。

更为优选的，二级发酵菌种通过如下方法获得，将保存在甘油管中的菌种液，按体积分数为2％接种量接入含lb液体培养基三角摇瓶中，置于37℃，40-50rh％，240rpm的摇床中培养12h即得。

优选的，步骤(1)培养时包括细菌增殖培养，培养液溶解氧值大于60％，培养温度为37℃，ph6-7，通入无菌空气通气比为0.6，开启搅拌功率20hz，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，之后进行步骤(2)。

优选的，步骤(2)中培养液溶解氧值保持在15-30％时，培养温度为25℃，ph6.5～7.5，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa。

优选的，步骤(2)诱导物质为诱导培养基，流加流量为20ml/(l*h)，诱导培养基为按重量百分比，包括乳酸0.1％，乳糖5％，甘油2％，消泡剂0.05％，0.01mmol/l的iptg，余量为水，共计流加8h。

更为优选的，诱导培养基流加完毕前1h，开始每半小时取2ml培养液进行培养菌菌体密度od(600)和12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量检测。

优选的，步骤(3)中前体物质按流加量100ml/(l*h)流加，前体物质为胆酸碱溶液，胆酸碱溶液浓度为20％胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；辅助物质按照流加流量为0.2ml/(l*h)流加，辅助物质包括核黄素碱溶液，核黄素碱溶液浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和ph11的氢氧化钠溶液，余量为水。

优选的，步骤(4)中采用高效液相色谱法检测胆酸浓度。

本申请的技术方案中：12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌来自市售。

本申请的技术方案中：iptg：异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，常用分子生物学试剂，是β-半乳糖苷酶和β-半乳糖透酶的诱导剂。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明公开了一种12-酮基胆酸的制备方法，属于生物与医药技术领域，用于生产12-酮基胆酸，以解决现有的12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)高胆酸转化效率低下，且12α-羟基类固醇脱氢酶分离纯化成本较高的问题。

2、本发明使用比较常规的lb培养基培养含12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌，与现有针对提高12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)含量的特殊培养工艺相比，减少了特殊培养工艺的原料、设备、过程控制等复杂配置(《一种高含量12α-羟基类固醇脱氢酶发酵液的发酵方法》)。

3、本发明区别于现有纯酶催化工艺，是全细胞催化过程，降低了纯酶催化环境条件(温度、ph、混合、生物污染、杂质等控制要求较苛刻)的苛刻程度。

4、本发明区别于现有纯酶催化，是全细胞催化过程，去除了酶分离、纯化、保存、使用等一系列工艺操作，不仅提高率生产效率，还大大降低了环境污染。

5、本发明区别于现有纯酶催化，是全细胞催化过程，保证了12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-hsdh)的动态稳定，使得前体物质胆酸投料量远远大于现有纯酶催化前体物质胆酸投料量，并且反应时间也远远低于现有纯酶催化反应时间，总体来说大大提高了12-酮基胆酸的生产效率。

附图说明

图1实施例2中胆酸的液相色谱图；

图2实施例2中12-酮基胆酸的液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种12-酮基胆酸的制备方法，包括如下步骤

(1)将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种按体积分数为2-6％的接种量接种到含lb液体培养基的生物培养容器中培养，大肠杆菌菌种发酵生产周期为17h，12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为二级发酵菌种，二级发酵菌种通过如下方法获得，将保存在甘油管中的菌种液，按体积分数为2％接种量接入含lb液体培养基三角摇瓶中，置于37℃，40rh％，240rpm的摇床中培养12h即得，培养时包括细菌增殖培养，培养液溶解氧值大于60％，培养温度为37℃，ph6，通入无菌空气通气比为0.6，开启搅拌功率20hz，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，之后进行步骤(2)；

(2)培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液，培养液溶解氧值保持在15-30％时，培养温度为25℃，ph6.5，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，诱导物质为诱导培养基，流加流量为20ml/(l*h)，诱导培养基为按重量百分比，包括乳酸0.1％，乳糖5％，甘油2％，消泡剂0.05％，0.01mmol/l的iptg，余量为水，共计流加8h，诱导培养基流加完毕前1h，开始每半小时取2ml培养液进行培养菌菌体密度od(600)和12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量检测；

(3)诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度od(600)达到15且12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12u/ml时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h，前体物质按流加量100ml/(l*h)流加，前体物质为胆酸碱溶液，胆酸碱溶液浓度为20％胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；辅助物质按照流加流量为0.2ml/(l*h)流加，辅助物质包括核黄素碱溶液，核黄素碱溶液浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和ph11的氢氧化钠溶液，余量为水；

(4)前体物质和辅助物质流加完毕后2h，检测胆酸浓度，浓度为0.3％时，结束培养，采用高效液相色谱法检测胆酸浓度。

生产结束后得到含量高达142g/l的12-酮基胆酸溶液。

实施例2

一种12-酮基胆酸的制备方法，包括如下步骤

(1)将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种按体积分数为2-6％的接种量接种到含lb液体培养基的生物培养容器中培养，大肠杆菌菌种发酵生产周期为18h，12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为二级发酵菌种，二级发酵菌种通过如下方法获得，将保存在甘油管中的菌种液，按体积分数为2％接种量接入含lb液体培养基三角摇瓶中，置于37℃，45rh％，240rpm的摇床中培养12h即得，培养时包括细菌增殖培养，培养液溶解氧值大于60％，培养温度为37℃，ph6.5，通入无菌空气通气比为0.6，开启搅拌功率20hz，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，之后进行步骤(2)；

(2)培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液，培养液溶解氧值保持在15-30％时，培养温度为25℃，ph7，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，诱导物质为诱导培养基，流加流量为20ml/(l*h)，诱导培养基为按重量百分比，包括乳酸0.1％，乳糖5％，甘油2％，消泡剂0.05％，0.01mmol/l的iptg，余量为水，共计流加8h，诱导培养基流加完毕前1h，开始每半小时取2ml培养液进行培养菌菌体密度od(600)和12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量检测；

(3)诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度od(600)达到15且12a-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12u/ml时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h，前体物质按流加量100ml/(l*h)流加，前体物质为胆酸碱溶液，胆酸碱溶液浓度为20％胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；辅助物质按照流加流量为0.2ml/(l*h)流加，辅助物质包括核黄素碱溶液，核黄素碱溶液浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和ph11的氢氧化钠溶液，余量为水；

(4)前体物质和辅助物质流加完毕后2h，检测胆酸浓度，浓度为0.3％时，结束培养，采用高效液相色谱法检测胆酸浓度。

生产结束后得到含量高达144g/l的12-酮基胆酸溶液。

实施例2中胆酸的液相色谱图对应的峰表如表1所示，制备的12-酮基胆酸的液相色谱图对应的峰表如表2所示。

表1实施例2中胆酸的液相色谱图对应的峰表

结合图1和表1，本实施例中胆酸对应峰号3，由表1知，其纯度为98.6948％。

表2实施例2中12-酮基胆酸的液相色谱图对应的峰表

结合图2和表2，本实施例中12-酮基胆酸对应峰号2，由表2知，其纯度为99.7427％。

实施例3

一种12-酮基胆酸的制备方法，包括如下步骤

(1)将12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌菌种按体积分数为2-6％的接种量接种到含lb液体培养基的生物培养容器中培养，大肠杆菌菌种发酵生产周期为20h，12α-羟基类固醇脱氢酶表达基因的重组大肠杆菌为二级发酵菌种，二级发酵菌种通过如下方法获得，将保存在甘油管中的菌种液，按体积分数为2％接种量接入含lb液体培养基三角摇瓶中，置于37℃，50rh％，240rpm的摇床中培养12h即得，培养时包括细菌增殖培养，培养液溶解氧值大于60％，培养温度为37℃，ph7，通入无菌空气通气比为0.6，开启搅拌功率20hz，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，之后进行步骤(2)；

(2)培养液溶解氧值低于60％时，流加诱导物质溶液，培养液溶解氧值保持在15-30％时，培养温度为25℃，ph7.5，培养容器内部排出气体压力为0.02mpa，诱导物质为诱导培养基，流加流量为20ml/(l*h)，诱导培养基为按重量百分比，包括乳酸0.1％，乳糖5％，甘油2％，消泡剂0.05％，0.01mmol/l的iptg，余量为水，共计流加8h，诱导培养基流加完毕前1h，开始每半小时取2ml培养液进行培养菌菌体密度od(600)和12α-羟基类固醇脱氢酶的酶含量检测；

(3)诱导物质溶液流加完毕，培养菌菌体密度od(600)达到15且12a-羟基类固醇脱氢酶的酶含量达到12u/ml时，流加前体物质，同时流加辅助物质，共计流加6h，前体物质按流加量100ml/(l*h)流加，前体物质为胆酸碱溶液，胆酸碱溶液浓度为20％胆酸和等胆酸摩尔当量的氢氧化钠，余量为水；辅助物质按照流加流量为0.2ml/(l*h)流加，辅助物质包括核黄素碱溶液，核黄素碱溶液浓度为0.01倍胆酸摩尔当量的核黄素和ph11的氢氧化钠溶液，余量为水；

(4)前体物质和辅助物质流加完毕后2h，检测胆酸浓度，浓度为0.3％时，结束培养，采用高效液相色谱法检测胆酸浓度。

生产结束后得到含量高达140g/l的12-酮基胆酸溶液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。