大豆分枝数量性状相关的QTL、SNP标记及应用的制作方法

本发明涉及分子标记技术领域，更具体的说是涉及一种大豆分枝数量性状相关的qtl、snp标记及应用。

背景技术：

大豆是世界上重要的粮食和经济作物，是人类食用脂肪和植物蛋白的重要来源。随着我国经济水平的发展，大豆的需求量逐年增加，每年大豆进口量不断升高。2017年中国大豆全年进口量达到9554万吨，同比增长13.9％，创历史最高纪录，2018年全年国内大豆进口总量8803.34万吨。我国大豆自产不足的原因是多方面的，但主要科技原因是我国大豆单产水平低，因此提高大豆产量对于保障国家粮食安全具有重要意义。

大豆分枝数量与产量性状关系密切：产量是由多个基因控制的复杂性状，易受形态、生理、农艺性状以及栽培条件和管理措施等影响。大豆产量不仅依赖于主茎的结实情况，也与分枝的结实率密切相关，因此分枝数量是影响大豆产量的重要因素之一。单株粒数和主茎分枝数对产量的影响最大，其次为单株有效荚数和百粒重。分枝不仅能通过提高结荚率直接影响大豆产量，还通过协调大豆群体通风透光状况及植株对光能的利用效率等因素间接影响产量。水分过多、播种晚、红外光与远红外光比例(r/fr)下降、种植密度较高等条件，也会通过减少分枝数及分枝的结实率降低产量。大豆群体的自动调节机能主要来自分枝，各产量影响因子的效应通过分枝数显现。不同大豆品种在不同种植密度下的产量有很大差异。低密度时，多分枝品种可依靠分枝优势获得高产；高密度时，大豆分枝数量减少，主茎生长占优势，具有极强的自我调节能力。

从农学角度出发，利用分枝基因相关基因信息，根据栽培方法的不同，开发出具有最优植物结构的大豆品种。在西方国家，通过选择具有少分枝表型等位基因的基因型，可以改良高产、机械化收获的大豆品种。此外，我国大豆生产主要分布在东北地区，目前东北品种以主茎型为主，生产上常常存在缺苗断苗现象，由于保苗不全，严重影响大豆产量。而多分枝品种对缺苗断苗具有补偿作用，而且对增产稳产和高产品种培育的应用研究具有重要的实践意义，发掘参与调控大豆分枝的基因/qtl对于全面深入理解大豆株型建成研究具有重要理论意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种大豆分枝数量性状相关的qtl、snp标记及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大豆分枝数量性状相关的qtl，所述qtl命名为qbn-1，位于两个ssr标记barcsoyssr_06_1048和barcsoyssr_06_1053之间，该区间包含2个基因，分别为glyma.06g208800和glyma.06g208900。

一种大豆分枝数量性状相关的snp标记，命名为snp20521336，位于大豆williams82参考基因组第6号染色体的20521336bp，该位置核苷酸为c或t。

一种用于检测大豆分枝数量性状的引物对，所述引物对的核苷酸序列如下：

上游引物：5′-gctactaacccaaagaaaca-3′；seqidno.1；

下游引物：5′-ctcacaagactcccctcacc-3′；seqidno.2。

一种用于检测大豆分枝数量性状的试剂盒，包括权利要求3所述的引物对。

上述snp标记、引物对或试剂盒在大豆育种中的应用。

一种检测大豆分枝数量性状的方法，通过检测snp20521336位点的基因型来确定大豆分枝数量性状，当基因型为c时，为少分枝材料，基因型为t时为多分枝材料，基因型为杂合型c/t时为中间类型分枝材料。

分枝数量受环境影响较大，尤其是种植密度，针对于垦农24和垦丰19的ril群体，在株距10cm时，一般认为0～2个为少分枝，超过5个为多分枝。

优选的，具体包括：

(1)提取待测大豆的基因组dna；

(2)利用权利要求3所述的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

(3)对所述pcr扩增产物进行测序，检测snp20521336位点的基因型。

优选的，所述pcr的扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，5min；10℃保存。

优选的，所述pcr扩增体系包括：easytaq0.2μl，10×easytaqbuffer2.0μl，dntpmixture1.5μl，2mm的上游引物0.75μl，2mm的下游引物0.75μl，30ng/μl的dna3.0μl，ddh2o11.8μl。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：在6号染色体上获得与大豆分枝数相关基因glyma.06g208900，检测该基因上的snp20521336基因型为c时，为少分枝材料，基因型为t时为多分枝材料，基因型为杂合型c/t时为中间类型分枝材料，该标记可以大大提高育种群体中个体选择效率，加快育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中大豆多分枝品种垦农24和大豆少分枝品种垦丰19的表型；

图2附图为本发明实施例1中群体频率分布图，其中a为f2群体，b为f7群体、c为f7：8群体；

图3附图为本发明实施例1中回交群体分枝数量分布直方图，其中d为bc2f2群体，e为bc3f2群体；

图4附图为本发明实施例1中qbn-1在bc3f2和bc2f2群体中定位结果；

图5附图为本发明实施例4中用snp检测垦农24×垦丰19的f2:7群体个体基因型的统计。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

试验用大豆分枝数量相关基因研究材料来自于黑龙江省农业科学院克山分院提供。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

以下为本发明涉及的实验方法：

(一)基因组dna的提取：

使用dna提取试剂盒plantzol(全式金生物技术公司)提取大豆叶片基因组dna。

具体步骤如下：取新鲜的植株叶片100mg，在液氮中研磨成粉末，置于离心管中；向研磨好的样品中加入400μl裂解液plantzol，震荡混匀，使样品完全悬浮。之后加入7.5μl(20mg/ml)rnasea，充分混匀后于55℃水浴中孵育60min；取出离心管，向管中加入400μl酚-氯仿抽提(酚:氯仿＝25:24)，充分震荡混匀，静置5min后12000rpm离心5min；吸取上清液300μl到新的离心管中，加入300μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；12000rpm离心5min，去上清；加入500μl70％的乙醇，震荡使dna沉淀悬浮，去上清；离心1min，吸净残留液体，晾干dna沉淀，加入100μlddh2o充分溶解；溶解后dna放于-20℃保存。

(二)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

pcr产物中加入4μl10×loadingbuffer，混合均匀，取1.5μl混合样品，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

非变性聚丙烯酰胺凝胶配方(6％page胶，1l)：丙烯酰胺57g，n,n-亚甲基双丙烯酰胺3g，5×tbe缓冲液100ml。

tbe缓冲液配方(1l)：tirs108g，硼酸55g，edta7.43g。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：

玻璃板在水中浸泡3～5min，用钢丝球擦洗至玻璃板上无杂质；用70％乙醇再次擦洗玻璃板；待玻璃板干燥后将凹板和平板相对放置，两边各用1个夹子对称夹紧，水准仪调平；取30～40ml6％page胶，加入300μl10％过硫酸铵，30μltemed，混匀，于两板中灌胶，如有气泡需排净；缓慢插入梳齿，室温凝胶备用。

采用250v恒压，0.5×tbe缓冲液进行电泳，根据pcr产物大小调整电泳时间，一般电泳30min左右。电泳后采用硝酸银染色法进行染色。染色液和显影液配方如下：

银染液：agno31g/l；

显影液：naoh15g/l，甲醛7.5ml/l。

将胶片从玻璃板上剥下，浸入银染液中震荡染色10min；取出后用去离子水冲洗2次；放入显影液中显色5min；去离子水冲洗2次；保鲜膜封胶。

实施例1候选基因的获得

(1)亲本及其群体表型特征

大豆多分枝品种垦农24和大豆少分枝品种垦丰19的表型如图1所示。

利用分枝数差异显著的大豆品种(大豆多分枝品种垦农24和大豆少分枝品种垦丰19)构建的重组自交系群体(ril群体)，后代个体在分枝数量性状上具有明显差异。在2015年、2018年及2019年中，垦农24在克山试验田中分枝数分别6.0、7.9、6.2个，垦丰19分枝数分别为0.6、1.1、0.8个。f2群体及ril群体(f7、f7：8)分枝数量表型呈现数量性状的特点(如图2所示)，说明该群体的表型是由数量性状位点控制。

(2)qbn-1初定位

本发明为了研究大豆分枝数量的分子遗传机制，通过构建一个包含599个个体的f2分离群体后代，对分枝数量进行了qtl分析。重组自交系是由多分枝亲本垦农24和少分枝亲本垦丰19杂交而成。

以垦农24和垦丰19的dna为模板，选用覆盖大豆20条染色体的543个ssr标记进行了扩增，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法筛选出在亲本间具有多态性的250个ssr。

在f2分离群体后代中，以亲本表型为标准，选择少分枝个体20株和多分枝个体20株，利用试剂盒plantzol提取dna，并将多分枝和少分枝个体dna个体按照等量方式分别混合，得到多分枝池和少分枝池。

以多分枝池、少分枝池和两个亲本的dna为模板利用pcr进行扩增并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选连锁。qbn-1位点通过侧翼标记barcsoyssr_06_0993和标记barcsoyssr_06_1070被初步定位到6号染色体上21mb的区域，物理位置为18902966-20996738，该区域共存在84个基因。

(3)qbn-1的精细定位

为了缩小qbn-1区间，对初定位区间进行加密标记，在ssr标记barcsoyssr_06_0993和ssr标记barcsoyssr_06_1070之间的物理区间内共包含77个ssr标记，以亲本的dna为模板对区间内的77个ssr标记进行扩增，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法筛选得到了14个亲本间具有多态性的ssr标记.

随后将ril群体每个家系对这14个ssr标记进行pcr扩增以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终得到所有家系的标记基因型。

最后，使用icimappingv4.2进行qtl分析，使用lod阈值为3.0。最终将qbn-1定位位于barcsoyssr_06_1048和barcsoyssr_06_1053标记之间，lod值为32.07，表型贡献率为22.69％，该区间包含2个基因，分别为glyma.06g208800和glyma.06g208900。

qtl定位情况如表1所示。

表1垦丰19/垦农24分枝数量qtl定位结果

与大豆分枝数量表型紧密连锁的两个ssr分子标记，两个标记分别为barcsoyssr_06_1048和barcsoyssr_06_1053，所对应的引物如下：

barcsoyssr_06_1048的上游引物：5′-ccaaagttgcgatgtttgaa-3′；seqidno.3；

下游引物：5′-aactcaaacccatttgtaaagatt-3′；seqidno.4；

barcsoyssr_06_1053的上游引物：5′-gtaaattttgcgaaaatgaaaaa-3′；seqidno.5；

下游引物：5′-ttgttgggcttgttcttgtg-3′；seqidno.6。

(4)分枝位点qbn-1验证

针对ril群体中检测到的调控分枝数量qtlqbn-1，构建垦丰19为轮回亲本bc3f2和以垦农24为轮回亲本bc2f2群体。bc3f2和bc2f2群体分枝数量表型显示其分枝数量呈连续分布(如图3所示)。

利用精细定位得到的14个ssr标记对bc3f2和bc2f2群体的所有个体进行扫描得到回交群体每个个体的基因型数据，将每个个体的基因型与相应的表型结合，排除发生交换的标记，逐步缩小定位区间，最后发现控制分枝数量位点qbn-1仍定位于barcsoyssr_06_1048和barcsoyssr_06_1053标记之间(如图4所示)。

实施例2候选基因序列分析

对glyma.06g208900和glyma.06g208800进行序列分析发现，编码与cml15相关的钙结合蛋白的glyma.06g208800包含一个长度为442bp的外显子。序列分析表明，两亲本之间不存在变异。

编码磷脂易位atp酶的glyma.06g208900基因包含11个外显子和10个内含子，并含有1190个氨基酸。序列分析发现了几个变异，包括上游和下游区域的单核苷酸多态性(snps)和5-utr区域的一个起始密码子获得snp，如表2所示。进一步分析，glyma.06g208900snpc到t的变化导致了一个氨基酸从垦农24的gly到垦丰19的asp的变化。

表2垦农24和垦丰19的候选基因信息

实施例3snp标记的开发

开发：snp20521336位于大豆williams82参考基因组第6号染色体的20521336bp。该位置核苷酸为c/t多态。

通过phytozome网站获得上述snp所在位置上下游500bp的大豆参考基因组序列，并利用primer5软件进行引物设计，针对该处snp设计引物序列为：

上游引物：5′-gctactaacccaaagaaaca-3′；seqidno.1；

下游引物：5′-ctcacaagactcccctcacc-3′；seqidno.2。

实施例4snp标记在ril群体中的应用

利用所开发的snp标记，从垦农24×垦丰19群体的f2:7代中识别出595个个体，检测方法为：

(1)提取待测大豆的基因组dna；

(2)利用上述引物对大豆基因组dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

(3)对所述pcr扩增产物进行测序，检测snp20521336位点的基因型。

pcr的扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，5min；10℃保存。

pcr扩增体系包括：easytaq0.2μl，10×easytaqbuffer2.0μl，dntpmixture1.5μl，2mm的上游引物0.75μl，2mm的下游引物0.75μl，30ng/μl的dna3.0μl，ddh2o11.8μl。

结果表明，含有t型等位基因的分枝数平均为4.7个；含有c型等位基因的分枝数平均为2.4个；杂合个体中分枝数的平均值为4.2。进一步的方差分析显示，含t型等位基因材料的分枝数和杂合子材料的分枝数与含c型等位基因材料的分枝数存在显著性差异；含t型等位基因材料与杂合个体的分枝数无显著性差异(如图5所示)。结果表明，glyma06g208900基因可以准确地识别群体中的个体。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>大豆分枝数量性状相关的qtl、snp标记及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctactaacccaaagaaaca20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcacaagactcccctcacc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccaaagttgcgatgtttgaa20

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aactcaaacccatttgtaaagatt24

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtaaattttgcgaaaatgaaaaa23

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ttgttgggcttgttcttgtg20