本发明涉及检测试剂技术领域，尤其涉及sars-cov-2病毒的高通量检测引物及试剂盒。
背景技术：
2019新型冠状病毒(sars-cov-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒潜伏期具有传染性，目前，所致疾病没有特异治疗方法。
为了尽快控制疫情的发展，在第一时间内对所有可能感染sars-cov-2病毒的患者进行检测至关重要。目前，检测sars-cov-2病毒的主要方法是实时荧光定量pcr技术，该方法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是由于该方法对操作人员的要求较高，且其使用的检测仪器限制了一次检测样本的数量，使得一次检测样本的通量较低，无法满足大批量样本的检测需求，因此能够高通量检测sars-cov-2病毒的试剂是当前急需的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供sars-cov-2病毒的高通量检测引物及试剂盒，该引物适用于高通量测序的核酸检测方法。
本发明提供了seqidno:1～7所示7个核酸片段中的至少两个作为标志物在制备sars-cov-2病毒检测试剂的应用。
本发明还提供了sars-cov-2病毒的高通量检测引物组，其上游引物由顺序连接的上游通用序列和上游识别序列组成；
其下游引物由顺序连接的下游通用序列1、标签序列、下游通用序列2和下游识别序列组成；
其中，上游通用序列的核苷酸序列如seqidno:8所示；
下游通用序列的核苷酸序列1如seqidno:9所示；
下游通用序列的核苷酸序列2如seqidno:10所示；
上游识别序列选自seqidno:11～17所示的7种序列中的任一种；
下游识别序列选自seqidno:18～24所示的7种序列中的任一种。
所述引物组中还包括seqidno:25～26所示的内参引物。
一些实施例中，所述引物组包括7对特异性引物和seqidno:25～26所示的内参引物；
引物对1包括：
上游引物1：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatctgatggtggtgtcactcgtg-3’
下游引物1：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcggcacgacaaaacccacttc-3’
引物对2包括：
上游引物2：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatctcgaactgcacctcatggtc-3’
下游引物2：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcgactttagatcggcgccgta-3’
引物对3包括：
上游引物3：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatctgtcgttgacaggacacgag-3’
下游引物3：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcagtctccaaagccacgtacg-3’
引物对4包括：
上游引物4：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatccggatggcttattgttggcg-3’
下游引物4：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcggcatttccagcaaagccaa-3’
引物对5包括：
上游引物5：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatcgccgctgttgatgcactatg-3’
下游引物5：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtcgtctcaggcaatgcat-3’
引物对6包括：
上游引物6：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatctcttctcaacgtgccactcc-3’
下游引物6：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcggcaggtccttgatgtcaca-3’
引物对7包括：
上游引物7：
5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacacacactctttccctacacgacgctcttccgatcacacgtaaccctgcttggag-3’
下游引物7：
5’-caagcagaagacggcatacgagat[标签序列]gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcctgaggtgtgtaggtgcctg-3’。
本发明所述的引物组中，所述标签序列随机，其长度为8bp；每个检测体系对应一个标签序列。
每个待测样品对应一个标签序列，每个检测体系中至少包括两对检测引物和一对内参引物。每个检测体系中所有引物的标签序列是一致的。
标签序列在测序中，用于区分待测样品。本发明提供的引物组适用于sars-cov-2病毒的高通量检测，其检测依赖于illumina测序仪，测序策略使用单端150p测序。基于高通量平台的应用，利用本发明所述的引物组可以同时检测多个样品，每次检测最多可检测的样品数量可达1000例。因此，所述标签序列随机选自：
本发明还提供了一种sars-cov-2病毒的高通量检测试剂盒，其包括本发明所述的引物组。
本发明所述的高通量检测试剂盒中，还包括pcrbuffer、dntpmix和taqdnapolymerase。
本发明中，所述pcrbuffer(ph值为7.5～8.5)的组分为30mmtris-hcl，50mmkcl，2mmmgcl2,10mm硫酸铵。
dntpmix的组分为：100mmdatp、100mmdctp、100mmdgtp和100mmdttp。
本发明还提供了非诊断目的的sars-cov-2病毒检测方法，其以本发明所述的引物组扩增样品cdna，根据扩增产物的测序结果判断样品中是否含有sars-cov-2病毒；
判断方法为：一个样本检测的标志物中，有至少两个标志物的reads数大于10，则判定为阳性结果，反之即为阴性结果；所述标志物为本发明所述的标志物。
本发明中，所述扩增产物测序前，还包括纯化的步骤，所述扩增产物使用ampurexp磁珠纯化。
本发明中，所述扩增的体系包括：
所述引物混合是由本发明所述引物组等量混合制成(总浓度为20μm)。
本发明中，所述扩增的程序为：96℃4min；96℃20s，59℃30s，72℃40s，16个循环；72℃10min。
本发明提供的引物针对的sars-cov-2病毒中特定的区域进行扩增，这些片段作为的sars-cov-2病毒的检测标志物，能够实现对的sars-cov-2病毒的高通量检测，灵敏度高、特异性好、准确率高。
具体实施方式
本发明提供了sars-cov-2病毒的高通量检测引物及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明采用的标志物在sars-cov-2病毒中对应的基因及位置如表1：
表1标志物序列
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.取200例样本类型为普通人痰液和咽拭子的样本及10例人工模拟rna混合物(该混合物序列与sars-cov-2病毒序列重合)作为检测样本。
2.核酸提取：使用qiaampviralrnaminikit试剂盒提取200例痰液和咽拭子样本核酸，具体操作参照说明书程序进行。
3.将上述提取的核酸rna及人工模拟rna使用thermofisher反转录试剂盒反转录成cdna，具体操作参照说明书程序进行。
4.使用步骤3得到的cdna为模板，每一个样本对应一种标签引物mix进行多重pcr扩增。反应体系如下：引物混合mix2μl，pcrbuffer(ph为7.5-8.5)12μl，dntpmix0.8μl、taqdnapolymerase(2.5u/μl)0.8μl，待检样本5μl，补无核酸水4.4μl至总反应体积25μl。引物序列如表2：
表2引物序列
5.反应程序如下：96℃4min；96℃20s，59℃30s，72℃40s，16个循环；72℃10min.
6.将上述反应的产物使用ampurexp磁珠纯化。
7.对纯化后的样本进行定量和质量检测。
8.所有样本合并，使用illumina测序仪上机测序，测序策略使用单端150p测序。
9.生信分析，判定结果。过滤不符合质量要求的数据，根据样本使用标签序列及测序序列与分析使用数据库比对，分析得200例痰液和咽拭子样本全为阴性，10例人工合成rna混合物为阳性，与预期结果一致，准确率为100％。
实施例2
实验方法：将实施例1提供的方法应用于环境水体、土壤或非生物表面中sars-cov-2病毒的检测，所用样本为5份掺入阳性质粒的自来水样本及10份自来水样本。
1.采用阴离子膜吸附-超声波振荡法对水体样本中的病毒进行浓缩富集。
2.核酸提取：使用qiaampviralrnaminikit试剂盒提取自来水样本核酸，具体操作参照说明书程序进行。
3.将上述提取的核酸rna使用thermofisher反转录试剂盒反转录成cdna，具体操作参照说明书程序进行。
4.将上述得到的cdna为模板，每一个样本对应一种标签引物mix进行多重pcr扩增。反应体系如下：引物混合mix2μl，pcrbuffer(ph为7.5-8.5)12μl，dntpmix0.8μl、taqdnapolymerase(2.5u/μl)0.8μl，待检模板5μl，补无核酸水4.4μl至总反应体积25μl
5.反应程序如下：96℃4min；96℃20s，59℃30s，72℃40s，16个循环；72℃10min。
6.将上述反应的产物使用ampurexp磁珠纯化。
7.对纯化后的样本进行定量和质量检测。
8.所有样本合并，使用illumina测序仪上机测序，测序策略使用单端150p测序。
9.生信分析，判定结果。过滤不符合质量要求的数据，根据样本使用标签序列及测序序列与分析使用数据库比对，分析得10份自来水样本全为阴性，8份掺入阳性质粒的自来水样本为阳性。结果与预期结果一致，准确率为100％。
实施例3
实验目的：检测该检测试剂的准确性
实验方法：将实施例1提供的方法获得的测序文库，以及采用相同的基因组为模板构建宏基因组全基因测序文库，分别使用使用illuminanextseq550测序仪进行高通量测序，比较两种文库的测序数据及检测结果。所用样本1、2、3为已知阳性质粒。
表3准确性实验检测结果
实施例4
实验目的：检测该检测试剂的特异性
实验方法：将实施例1提供的方法获得的测序文库，使用illuminanextseq550测序仪进行高通量测序，分析检测结果。所用样本4、5、6、7、8、9为已知阴性样本。
表4特异性实验检测结果
实施例5
实验目的：检测该检测试剂的灵敏度
实验方法：将实施例1提供的方法获得的测序文库，使用illuminanextseq550测序仪进行高通量测序，分析检测结果。所用样本为含各浓度梯度的标志物质粒。
表5灵敏度实验检测结果
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>微岩医学科技（北京）有限公司
<120>sars-cov-2病毒的高通量检测引物及试剂盒
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