一种用于COVID-19药物筛选的iPSC-nCoVN细胞模型及其建立和使用方法与流程

文档序号:21995899发布日期:2020-08-25 19:37阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于covid-19药物筛选的ipsc-ncovn细胞模型的建立方法,其特征在于,包括如下步骤:

s1、慢病毒表达载体构建

用分子克隆方法将sars-cov-2的核衣壳蛋白-ncovn的cdna亚克隆到pcw-cas9-blast载体中,取代原载体中的cas9和blast基因,得到pcw-ncovn载体;

s2、慢病毒包装

接种hek293t细胞到6孔板中,用含10%胎牛血清的dmem培养液进行培养,待细胞汇合度达到70%-80%时准备转染;pcw-ncovn、pvsvg、pspax2共转染hek293t细胞,转染完成后进行继续培养并离心后去除细胞残渣,保留上清液;

s3、转染ipsc细胞

ipsc培养:将ipsc细胞接种于matrigel基质包被的平板上,然后用stemup进行培养;

转染:待培养的ipsc细胞汇合度达到70%-80%时进行转染;转染24h后,将培养液更换成新鲜的含终浓度为2μg/ml的盐酸多四环素的stemup;2天后,将培养液更换成含2μg/ml的盐酸多四环素和嘌呤霉素的stemup进行筛选,筛选2-3天后,挑取单个的克隆接种到不同的皿中培养,即得ipsc-ncovn细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤s2中,在转染前1h,需弃去原来的培养液,加入2ml/孔预热的无血清optimem培养液。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤s2中,转染时,按照说明书用lipofectamine2000试剂进行转染,将20μgpcw-ncovn载体、10μgpvsvg载体、15μgpspax2载体共转染hek293t细胞;6h后,将培养液更换成含10%胎牛血清和1%bsa的dmem培养液,继续培养约60h。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤s2中,离心操作是取培养液于3000rpm、4℃调节下离心10min,然后用0.45μm低蛋白结合滤膜过滤上清液,去除细胞残渣。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤s2中,还包括将含病毒的培养液按照体积比4:1与10%蔗糖缓冲液混合,并在10000g、4℃条件下离心4h,弃去上清液,离心管在吸水纸上沥干3min,加入1×pbs重悬,-80℃保存待用。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤s3中,ipsc培养时,stemup培养基每两天更换一次,ipsc传代过程中用1×dpbs冲洗1次,然后在室温下用1×dpbs稀释的0.5mmedta再处理10min。

7.一种用于covid-19药物筛选的ipsc-ncovn细胞模型,其特征在于,其是根据权利要求1-6任一项所述的方法得到的。

8.一种根据权利要求1-6任一项所述的方法得到的ipsc-ncovn细胞模型的使用方法,其特征在于:是以ipsc-ncovn细胞为模型,在培养液中添加合适剂量的待测试药物,通过细胞增殖速率和全能性标志物的检测,从而获得药物对covid-19的有效性,达到筛选目的。


技术总结
本发明公开了一种用于COVID‑19药物筛选的iPSC‑nCoVN细胞模型及其建立方法和使用方法,属于生物医药技术领域。该细胞模型是通过nCoVN的cDNA来构建pCW‑nCoVN的载体,然后对HEK293T细胞进行慢病毒包装后转染iPSC细胞获得。本发明首次建立了可用于COVID‑19药物筛选的细胞模型,其检测方法简便、操作难度低、检测速度快、可通量操作,并且可以在无病毒的安全环境中快速评价受试药物是否能够抑制nCoVN蛋白的作用,减少或消除其对iPSC增殖速率和多能性的影响,从而达到药物筛选目的,无安全风险;用于抗COVID‑19候选药物的筛选,为COVID‑19的治疗提供科学依据。

技术研发人员:林彬;林泽斌;林先明;吴志明;王萍;孔维维;麦锦连;周丽诗
受保护的技术使用者:广东源心再生医学有限公司
技术研发日:2020.06.04
技术公布日:2020.08.25
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