本发明属于医药技术领域，特别涉及睡茄内酯类化合物及其提取方法和用途，还包括其药用组合物，即睡茄内酯类化合物的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
小酸浆(physalisminimal.)为茄科酸浆属一年生草本植物，在我国主要分布在云南、广东、广西和四川等地。《中华本草》记载其具有清热利湿，祛痰止咳，软坚散结等作用。根据文献报道，小酸浆主要成分为睡茄内酯类化合物，是一类具有28个碳原子骨架的麦角甾烷类化合物，其c-22与c-26形成一个δ内酯环的侧链。现代药理实验表明此类化合物具有明显的生物活性，特别是在抗肿瘤(chen,l.x.；xia,g.y.；he,h.；etal.newwithanolideswithtrail-sensitizingeffectfromphysalispubescensl.rscadvances.2016,6,52925-52936；cao,c.m.；wu,x.；kindscher,k.；etal.withanolidesandsucroseestersfromphysalisneomexicana.journalofnaturalproducts.2015,78,2488-2493；chen,l.x.；xia,g.y.；qiu,f.；etal.physapubescinselectivelyinducesapoptosisinvhl-nullrenalcellcarcinomacellsthroughdownregulationofhif-2αandinhibitstumorgrowth.scientificreports.2016,6,32582；he,h.；zang,l.h.；feng,y.s.；etal.physalinainducesapoptosisviap53-noxa-mediatedrosgeneration,andautophagyplaysaprotectiveroleagainstapoptosisthroughp38-nf-κbsurvivalpathwayina375-s2cells.journalofethnopharmacology.2013,148,544-555.)、抗炎(qiu,l.；zhao,f.；jiang,z.h.；chen,l.x.；etal.steroidsandflavonoidsfromphysalisalkekengivar.franchetiiandtheirinhibitoryeffectsonnitricoxideproduction.journalofnaturalproducts.2008,71,642-646.wu,j.p.；li,x.；zhao,j.p.；etal.anti-inflammatoryandcytotoxicwithanolidesfromphysalisminima.phytochemistry.2018,155,164-170.)等方面。
从小酸浆提取分离得到睡茄内酯类成分，并将这些成分在制备抗肿瘤药物中的应用及具体作用机制均未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供睡茄内酯类化合物。
本发明的第二个目的是提供睡茄内酯类化合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供含有睡茄内酯类化合物的组合物。
本发明的第四个目的是提供上述组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。。
本发明的技术方案概述如下：
睡茄内酯类化合物，具有如式(i)或其光学异构体的结构：
其中，通式(i)中，2-3位，5-6位，16-17位，24-25位，25-27位为单键或双键；
r1为h、oh或och3；
r2为h或oh；
r3为h或oh，r4为h或oh或r3与r4结合为
r5为oh或oac；
r6为h，r7为h或oh或r6与r7结合为
r8为h或oh；
r9为h或oh；
24-25位为单键时，r10为oh。
优选地，所述睡茄内酯类化合物选自化合物1-15中的任意一种，化合物1-15的结构式分别为：
上述睡茄内酯类化合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
含有上述睡茄内酯类化合物的组合物。
上述组合物包含药学上可接受的盐或药学上可接受的载体和/或赋形剂。
上述组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明具有以下优点及效果：
运用体外活性筛选评价体系进行活性评价，发现本发明的化合物能有效地抑制人恶性黑色素瘤细胞的生长，提示本发明睡茄内酯类化合物可作为治疗肿瘤疾病的药物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在本发明的基础上没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
睡茄内酯类化合物的提取分离及结构鉴定：
小酸浆p.minimal.的地上部分(9.0kg)经10质量倍的体积浓度为75％乙醇水溶液加热回流提取2次，每次2h，合并提取液并浓缩，得粗提物840g。将粗提物分散于5l水中，依次用等体积的石油醚和乙酸乙酯各萃取3次，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部分(200.0g)。
乙酸乙酯萃取部分经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、50:1、30:1、20：1、15:1、10:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到8个馏分(e1～e8)。
馏分e3经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到4个馏分(e31～e34)；馏分e33经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1和10:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到3个馏分(e331～e333)，馏分e332经sephadexlh-20柱色谱，二氯甲烷-甲醇(1:1)等度洗脱得到1个子馏分e3321，馏分e3321经过制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物11(3.5mg)。馏分e333经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、20:1、15:1、10:1和8:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到6个馏分(e3331～e3336)，馏分e3336经过制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物15(2.0mg)。馏分e34经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、20:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到5个馏分(e341～e345)，馏分e345经过制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物1(3.0mg)。
馏分e4经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1和30:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到2个馏分(e41～e42)，馏分e42经硅胶柱色谱分离，以体积比为20:1和15:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到2个馏分(e421～e422)，馏分e421经硅胶柱色谱分离，以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e4211，馏分e4211经ods柱色谱分离，以体积比为3:7和5:5的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e42111和e42112，馏分e42112经制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物2(5.0mg)，化合物8(4.2mg)，化合物12(20.0mg)。馏分e422经硅胶柱色谱分离，以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e4221，馏分e4221经ods柱色谱分离，以体积比为3:7和5:5的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e42211和e42212。馏分e42212经制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物14(3.0mg)。
馏分e6(30g)经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到4个馏分(e61～e64)。馏分e64经硅胶柱色谱分离，以体积比为10:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e641，馏分e641经ods柱色谱分离，以体积比为1:9和3:7的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分e6411和e6412,馏分e6412经制备hplc色谱，以甲醇-水(70:30)为流动相，得到化合物6(16.2mg)，化合物9(2.0mg)和化合物13(30.0mg)。
馏分e7经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、20：1、15:1、10:1、8:1和5:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到7个馏分(e71～e77)，馏分e76经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1和30:1二氯甲烷-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到2个馏分(e761～e762)，馏分e762经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7和5:5的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到3个馏分(e7621～e7623)，馏分e7623经制备hplc色谱，以甲醇-水(60:40)为流动相，得到化合物5(4.5mg)。馏分e77经硅胶柱色谱分离，以体积比为30:1和15:1二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到2个馏分(e771～e772)，馏分e772经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7和5:5的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到3个馏分(e7721～e7723)，馏分e7723经制备hplc色谱，以甲醇-水(45:55)为流动相，得到化合物7(3.0mg)。
馏分e8经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、30:1、15:1和10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到4个馏分(e81～e84)，馏分e84经sephadexlh-20柱色谱，二氯甲烷-甲醇(1:1)等度洗脱，得到2个馏分e841和e842，馏分e842经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7和5:5的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到3个馏分(e8421～e8423)，馏分e8423经制备hplc色谱，以甲醇-水(55:45)为流动相得到化合物3(25.1mg)，化合物4(6.7mg)和化合物10(7.4mg)。
通过理化常数及现代波谱学手段对各个化合物进行结构解析，化合物1-15均为未见文献报道的新化合物。如下所示：
所得各新化合物物理化学常数如下：
化合物1：白色无定型粉末；[α]25d45.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)206(3.55)nm；ir(kbr)νmax3385,2918,1714,1373,1234,1023cm-1；hresimsm/z543.2583[m+h]+(calcdforc30h39o9,543.2594),确定分子式为c30h38o9；1h(600mhz,pyridine-d5)和13c-nmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表1。
化合物2：白色无定型粉末；[α]25d135.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)206(3.49)nm；ir(kbr)νmax3307,2918,1710,1377,1243,1021cm-1；hresimsm/z527.2623[m+h]+(calcdforc30h39o8,527.2645)，确定分子式为c30h38o8；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表1。
化合物3：白色无定型粉末；[α]25d-162.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)212(3.77)nm；ir(kbr)νmax3394,2920,2840,1697,1647,1468,1384,1130cm-1；hresimsm/z503.2647[m+h]+(calcdforc28h39o8,503.2645)，确定分子式为c28h38o8；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表1。
化合物4：白色无定型粉末；[α]25d45.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.19),225(3.22)nm；ir(kbr)νmax3386,2918,1685,1398,1140,1031cm-1；hresimsm/z505.2800[m+h]+(calcdforc28h41o8,505.2801)，确定分子式为c28h40o8；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表2。
化合物5：白色无定型粉末；[α]25d60.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.02),228(3.11)nm；ir(kbr)νmax3391,2913,1701,1378,1255,1139,1031cm-1；hresimsm/z547.2933[m+h]+(calcdforc30h43o9,547.2907)，确定分子式为c30h42o9；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表2。
化合物6：白色无定型粉末；[α]25d52.5(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.01),226(3.11)nm；ir(kbr)νmax3374,2915,1705,1375,1224,1025cm-1；hresimsm/z561.2686[m+h]+(calcdforc30h41o10,561.2700)，确定分子式为c30h40o10；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表2。
化合物7：白色无定型粉末；[α]25d-38.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)218(3.76)nm；ir(kbr)νmax3394,3189,3008,2920,2849,1646,1468,1419,1261,1119cm-1；hresimsm/z545.2723[m+h]+(calcdforc30h41o9,545.2751)，确定分子式为c30h40o9；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表3。
化合物8：白色无定型粉末；[α]25d20.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)214(3.78)nm；ir(kbr)νmax3394,3190,2920,2849,1734,1687,1646,1400,1400,1242,1110cm-1；hresimsm/z511.2688[m+h]+(calcdforc30h39o7,511.2696)，确定分子式为c30h38o7；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表3。
化合物9：白色无定型粉末；[α]25d135.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.28),222(3.33)nm；ir(kbr)νmax3382,2916,1731,1678,1378,1253,1080cm-1；hresimsm/z547.2913[m+h]+(calcdforc30h43o9,547.2907)，确定分子式为c30h42o9；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表3。
化合物10：白色无定型粉末；[α]25d-126.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)228(3.82)nm；ir(kbr)νmax3395,2920,2849,1647,1467,1400,1123,1007cm-1；hresimsm/z505.2830[m+h]+(calcdforc28h41o8,505.2801)，确定分子式为c28h40o8；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表4。
化合物11：白色无定型粉末；[α]25d-124.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)225(3.33)nm；ir(kbr)νmax3432,2921,2849,2525,1647,1630,1401,1227,1117,1008cm-1；hresimsm/z561.2657[m+h]+(calcdforc30h41o10,561.2700)，确定分子式为c30h40o10；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表4。
化合物12：白色无定型粉末；[α]25d28.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)212(3.78)nm；ir(kbr)νmax3394,3189,2920,2849,1646,1467,1418,1253,1114cm-1；hresimsm/z559.2891[m+h]+(calcdforc31h43o9,559.2907)，确定分子式为c31h42o9；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表4。
化合物13：白色无定型粉末；[α]25d60.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)203(3.45)nm；ir(kbr)νmax3392,2917,1809,1714,1375,1236,1096cm-1；hresimsm/z575.2850[m+h]+(calcdforc31h43o10,575.2856)，确定分子式为c31h42o10；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表5。
化合物14：白色无定型粉末；[α]25d-82.0(c0.05,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.66)nm；ir(kbr)νmax3394,3192,2920,2849,1646,1468,1419,1259,1120cm-1；hresimsm/z577.3024[m+h]+(calcdforc31h45o10,577.3013)，确定分子式为c31h44o10；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表5。
化合物15：白色无定型粉末；[α]25d60.0(c0.07,甲醇)；uv(甲醇)λmax(logε)205(3.16),228(3.26)nm；ir(kbr)νmax3431,3124,2914,1708,1246cm-1；hresimsm/z545.3151[m+h]+(calcdforc31h45o8,545.3114)，确定分子式为c31h44o8；1hnmr(600mhz,pyridine-d5)and13cnmr(150mhz,pyridine-d5)，数据见表5。
表1化合物1-3的氢谱与碳谱数据
注：上述化合物所用测试溶剂为氘代吡啶；氢谱测试600mhz，碳谱测试150mhz。
表2化合物4-6的氢谱与碳谱数据
注：上述化合物所用测试溶剂为氘代吡啶；氢谱测试600mhz，碳谱测试150mhz。
表3化合物7-9的氢谱与碳谱数据
注：上述化合物所用测试溶剂为氘代吡啶；氢谱测试600mhz，碳谱测试150mhz。
表4化合物10-12的氢谱与碳谱数据
注：上述化合物所用测试溶剂为氘代吡啶；氢谱测试600mhz，碳谱测试150mhz。
表5化合物13-15的氢谱与碳谱数据
注：上述化合物所用测试溶剂为氘代吡啶；氢谱测试600mhz，碳谱测试150mhz。
实施例2：睡茄内酯类化合物抗肿瘤活性检测
采用mtt方法，取处于对数生长期的人黑色素瘤细胞a375(atcc)，每孔3×103个接种于96孔板中，放置于co2培养箱(37℃，5％co2，饱和湿度)进行培养。24小时后加入含有不同药物浓度的dmem培养基(gibco)，10μl/孔，终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625μm，加样组及空白对照组均设3个复孔，同时设空白对照组和阳性对照组(5-fluorouracil)。继续培养48小时后，加入mtt工作液(5mg/ml)，20μl/孔，2.5小时后，弃去培养基，加入dmso150μl/孔，平板摇床500rpm震摇5分钟，用酶标仪测定各孔的od值，测定波长为490nm，计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率＝[(空白对照组od值-给药组od值)/空白对照组od值]×100％。以上实验均重复三次。根据细胞增殖抑制率计算ic50值，活性结果(ic50)见表6。
表6化合物抗黑色素瘤细胞活性结果
由表6可见，本发明公开的化合物可显著的抑制人黑色素瘤细胞a375的增殖，ic50值最小可达2.0μm。
含有本发明所述化合物的组合物可以制备成适用于口服或者注射等应用形式，例如，可为片剂、胶囊剂、针剂、粉剂等。制备各个剂型可以采用常规方法制备。
本发明实施例只是用于帮助理解本发明。对于本领域普通技术人员，在没有创造性劳动的前提下，对本发明进行修改，这些修改也属于本发明保护的范围。