一种基于直扩型的人MTHFR基因多态性检测试剂盒的制作方法

本发明属于检测试剂盒技术领域，具体为一种基于直扩型的人mthfr基因多态性检测试剂盒。

背景技术：

叶酸由谷氨酸、对氨苯甲酸及喋啶核三部分组成，又被称之为蝶酰谷氨酸。叶酸仅能通过外源肠道吸收而得，而无法通过自身合成获取。叶酸主要吸收部位位于小肠上段，主要参与的酶为nadph还原酶，存在于十二指肠和空肠上皮粘膜细胞。在该酶的作用下，叶酸甲基化生成二氯叶酸，再甲基化生成叶酸的活性型-四氨叶酸。叶酸代谢过程中个体差异明显，影响代谢的主要因素是参与叶酸代谢过程中的亚甲基四氨叶酸还原酶。

亚甲基四氨叶酸还原酶是甲硫氨酸代谢与叶酸代谢通路中至关重要的酶。亚甲基四氨叶酸还原酶蛋白编码基因即mthfr基因，该基因c677t其具有多态性，存在３种基因型；野生型（cc型）、杂合突变型（ct型）、纯合突变型（tt型）。在野生型mthfr基因的正常活性下可维护叶酸甲硫氨酸通路的有效循环，也可使dna合成和甲基化有效进行。若该基因编码蛋白活性发生异常，会阻碍５-甲基四氨叶酸合成，进而引发dna合成及甲基化异常，导致同型半胱氨酸血中含量升髙，最终造成多种遗传性疾病的发生。与之紧密相关的是，该基因与新生儿出生缺陷呈现正相关性，如唐氏综合症等；也与中老年疾病（同型半胱氨酸含量升高）呈现一定相关性，如冠心病，动脉粥样硬化，心肌梗死，脑卒中等。由上可知，叶酸代谢对于人体健康的影响程度可见深远，因此该基因值得深入研究。

随着基因检测技术的不断发展，目前应用于snp基因分型的主要方法有：1）直接测序法（sanger）：原理为双脱氧终止法，pcr扩增后的产物之后进行测序，查看峰图评估突变结果。该方法被誉为金标准，优点是直观准确，缺点是通量低成本高。2）限制性片段长度多态性（rflp）：pcr扩增后的产物之后用限制性内切酶酶切位点，电泳检测条带结果而进行判读。优点是结果只管成本低廉，缺点是对位点要求高易出错。3）taqman探针法：根据目的片段设计特异性引物及taqman探针。在探针５’端标记报告基团，而３’端标记淬灭基团。经pcr后检测荧光。优点是结果准确，缺点是仪器特殊。4)分子量阵列技术（massarray）：通过引物切割及延伸反应结合maldi-tof-ms技术，实现基因分型检测。优点是可做多重，缺点是仪器特殊成本较高。5)外基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof-ms）：通过特异性引物在snp位点上延伸１个碱基，通过质荷比率识别碱基。优点是准确性高；缺点是仪器特殊成本较高。6)免疫层析检测法:免疫层析和胶体金技术的结合，该方法具有poct前景。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决的问题，而提出一种基于直扩型的人mthfr基因多态性检测试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于直扩型的人mthfr基因多态性检测试剂盒，包括核酸预提悬浮液、核酸扩增试剂和对照品；

核酸预提悬浮液为透明树脂材料的悬浮液，核酸预提悬浮液包括1-30%的树脂颗粒、0-100mmtris-hcl、0-10mmedta和工艺用水；

核酸扩增试剂包括预混工作液和mthfr反应液；

对照品包括阳性对照和阴性对照；

试剂盒所检测样本为血液或唾液样本。

优选的，预混工作液包括0-100mmtris-hcl、0-10mmmgcl2、0-10mmdtt、0-10mmedta、0-10mmdatp、0-10mmdctp、0-10mmdgtp、0-10mmdttp、0-10mmdutp、0-1u/ulung酶、0-1u/ultaq酶和工艺用水。

优选的，mthfr反应液中分别包括用于检测mthfrc677t突变的特异性引物和探针。

优选的，用于检测mthfrc677t突变的特异性引物包括一对2-10mm上游引物和2-10mm下游引物。

优选的，探针为2-10mmtaqman荧光探针。

优选的，特异性引物和探针序列及修饰如下：上游引物5’-tgcatgccttcacaaa-3’；下游引物5’-tgaggctgacctgaa-3’；突变探针5’-fam-aaatcgactcccgc-mgb-3’；野生探针5’-vic/hex-aaatcggctcccgc-mgb-3’。

优选的，阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株dna混合物。

优选的，野生质粒包含的部分mthfr基因片段序列如下：ggcccctcacctggatgggaaagatcccggggacgatggggcaagtgatgcccatgtcggtgcatgccttcacaaagcggaagaatgtgtcagcctcaaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcggctcccaaatcgactcccgcagacaccttctccttcaagtgcttcaggtcagcctcaaagctccctgcttcggggtggcctttggggtaacctgccaatagg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本试剂盒采用等位基因特异性扩增定量pcr技术突变进行mthfrc677t定性检测，从而辅助针对叶酸临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度；

本试剂盒适用样本类型有全血和唾液等。不同于其他扩增试剂盒的是，前处理——提取核酸的时间短，仅需10min，操作简便快捷。采用微量样本所提取dna用量即可满足pcr扩增需要。大大缩短了收样至结果产出的时间，高效快速且准确度高。直扩pcr是一种简便快速的方式，省去了/简化了从血液或唾液中提取核酸的步骤，降低提取dna污染风险；

本试剂盒增加了防污染ung酶体系的措施，防止产物对实验环境以及样本交叉污染；

本试剂盒具有无创取样、操作简便、成本不高、检出精准、预防污染的特点。

附图说明

为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明中试剂盒mthfrc677t位点野生型模板检测图。

图2为本发明中试剂盒mthfrc677t位点杂合突变型模板检测图。

图3为本发明中试剂盒mthfrc677t位点纯合突变型模板检测图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

请参阅图1-3所示，一种基于直扩型的人mthfr基因多态性检测试剂盒，包括核酸预提悬浮液、核酸扩增试剂和对照品；

核酸预提悬浮液为透明树脂材料的悬浮液，核酸预提悬浮液包括1-30%的树脂颗粒、0-100mmtris-hcl、0-10mmedta和工艺用水；

核酸扩增试剂包括预混工作液和mthfr反应液；

对照品包括阳性对照和阴性对照；

试剂盒所检测样本为血液或唾液样本。

预混工作液包括0-100mmtris-hcl、0-10mmmgcl2、0-10mmdtt、0-10mmedta、0-10mmdatp、0-10mmdctp、0-10mmdgtp、0-10mmdttp、0-10mmdutp、0-1u/ulung酶、0-1u/ultaq酶和工艺用水。

优选的，mthfr反应液中分别包括用于检测mthfrc677t突变的特异性引物和探针。

用于检测mthfrc677t突变的特异性引物包括一对2-10mm上游引物和2-10mm下游引物。

探针为2-10mmtaqman荧光探针。

特异性引物和探针序列及修饰如下：上游引物5’-tgcatgccttcacaaa-3’；下游引物5’-tgaggctgacctgaa-3’；突变探针5’-fam-aaatcgactcccgc-mgb-3’；野生探针5’-vic/hex-aaatcggctcccgc-mgb-3’。

阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株dna混合物。

野生质粒包含的部分mthfr基因片段序列如下：ggcccctcacctggatgggaaagatcccggggacgatggggcaagtgatgcccatgtcggtgcatgccttcacaaagcggaagaatgtgtcagcctcaaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcggctcccaaatcgactcccgcagacaccttctccttcaagtgcttcaggtcagcctcaaagctccctgcttcggggtggcctttggggtaacctgccaatagg。

本检测试剂盒包括以下反应操作流程：

s1、样本预处理提取dna：

取10µl全血或唾液，加入至10-50µl核酸预提悬浮液中。放置恒温混匀仪或pcr上，反应程序设置95℃5-10min；反应结束后，离心。

s2、直扩pcr反应体系配置：

将上清中的dna仅需2-5µl，即可作为反应体系中的样本模板；配置pcr反应体系（20µl总体系）：pcr反应体系包括10µl预混工作液、2µlmthfr反应液、2-5µldna模板（上清）、3-6µl水、20µl核酸扩增体系。

s3、直扩pcr反应程序设置：

50℃5min；98℃3min；（95℃30s，56℃30s）35-45cycle；65℃5-10min。

s4、直扩pcr反应结果判读：

fam:代表突变碱基。vic：代表野生碱基；根据是否有荧光值检出，来判断类型：野生型（cc型）只有vic、杂合突变型（ct型）fam和vic均有、纯合突变型（tt型）只有fam。

本发明的工作原理：本试剂盒采用等位基因特异性扩增定量pcr技术突变进行mthfrc677t定性检测，从而辅助针对叶酸临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度；

本试剂盒适用样本类型有全血和唾液等。不同于其他扩增试剂盒的是，前处理——提取核酸的时间短，仅需10min，操作简便快捷。采用微量样本所提取dna用量即可满足pcr扩增需要。大大缩短了收样至结果产出的时间，高效快速且准确度高。直扩pcr是一种简便快速的方式，省去了/简化了从血液或唾液中提取核酸的步骤，降低提取dna污染风险；

本试剂盒增加了防污染ung酶体系的措施，防止产物对实验环境以及样本交叉污染；

本试剂盒具有无创取样、操作简便、成本不高、检出精准、预防污染的特点。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。