一种消线法免疫层析试纸及其在CRISPR核酸检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种“消线法”免疫层析试纸及其在crispr核酸检测中的应用，属于分子诊断技术领域。

背景技术：

近年来，crispr基因组编辑技术引发了生物界巨大的变革。2017年，研究人员发现了可用于核酸检测的leptotrichiawadeicas13a蛋白(lwcas13a)，通过将其与重组聚合酶等温扩增技术(reconbinasepolymeraseamplification，rpa)结合，使系统灵敏度提高了100万倍，并建立了灵敏度达到单拷贝、特异性达到单碱基的高灵敏、高特异性核酸检测方法sherlock(specifichighsensitivityenzymaticreporterunlocking)。该系统已用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的检测以及人体内游离的突变肿瘤dna。

2018年，研究人员通过在报告rna两端分别修饰生物素以及小分子抗原fam建立了适用于侧向流免疫层析试纸(lateralflowchromatographicassay，lfca)的crispr-cas13a核酸快速检测技术。和传统方法相比，侧流层析技术具有简便、快速、便携、可实现现场检测及无需专业操作人员等优点。目前适用于crispr核酸检测的lfca试纸主要原理为“三明治夹心法”。其具体检测原理为：在crispr反应体系中的报告rna两端分别修饰生物素以及fam，对于阳性样品，被cas蛋白切断后的双标报告rna由于毛细管作用力从样品垫侧流至结合垫，报告rna的fam端会与胶体金粒子结合，在层析过程中另一端被链霉亲和素(c线)捕获，而被剪切的报告rna-fam-胶体金粒子复合体又与t线上的二抗特异性结合，所以t线与c线同时显色；然而在实际使用过程中，发现无论阴性还是阳性样本，在基于这种检测原理的lfca试纸检测中，尤其是样本浓度较低时，t线与c线在阴阳性样本中虽然颜色深浅不同，但均会出现条带，这也给主要依赖主观肉眼观察的结果判读来了一定的困难。

因此，寻找一种新的crispr核酸检测方法是研究的热点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种目标核酸检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括如下：

1)免疫层析试纸；

所述免疫层析试纸按样品流动方向依次包括含有胶体金标记抗体的样品垫、含有t线和c线的nc膜和吸水滤纸；

所述t线由链霉亲和素形成；

所述c线由所述胶体金标记抗体的二抗形成；

2)crispr反应体系；

所述crispr反应体系包括报告rna、crrna和cas蛋白；

所述cas蛋白为第二类v型或vi型crispr系统中的cas蛋白；

上述crispr反应体系推荐使用crispr-cas13a反应体系，不排除其他crispr反应体系的应用，包括第二类v型、vi型crispr反应体系(classii，typevorvi，例如：crispr-cas12a、crispr-cas12b、crispr-cas13b等)；

所述报告rna的两个末端分别标记生物素和能与所述胶体金标记抗体结合的基团；

所述crrna包括所述cas蛋白结合区域和目标核酸靶序列结合区域。

上述试剂盒中，所述cas蛋白为lwcas13a蛋白、cas12a或cas12b蛋白。

上述试剂盒中，所述报告rna由20个u组成，且所述报告rna的两端分别标记生物素和荧光素；但不排除其他标记方式、核苷酸种类和数量的报告rna；

上述试剂盒中，所述试剂盒还包括用于扩增目标核酸的试剂。

上述试剂盒中，所述扩增为等温扩增raa、变温扩增pcr或等温扩增lamp，但不排除其他预扩增方式(如变温扩增pcr、等温扩增lamp等)及无预扩增检测使用，在本发明的实施例中，用于扩增目标核酸的试剂具体为等温扩增raa试剂盒。

上述试剂盒中，所述目标核酸为病原体核酸、具有单核苷酸多态性的核酸或耐药核酸，包括但不限于此。

上述试剂盒中，所述病原体核酸来自于新冠病毒、埃博拉病毒或森林脑炎病毒；在本发明的实施例中病原体核酸具体为新冠病毒核酸(2019-ncov)、埃博拉病毒(ebov)核酸或森林脑炎病毒(tbev)核酸。

上述试剂盒中，所述胶体金标记抗体为抗fitc抗体，在本发明的实施例中为兔源抗fitc抗体，兔源抗fitc抗体的二抗为羊抗兔igg。

上述试剂盒中，

若目标核酸为新型冠状病毒基因组(genbankid：mn908947.3)，则对应的crrna的核苷酸序列为序列2，用于扩增目标核酸的rt-raa扩增试剂盒中的引物为序列3所示的2019-ncov-f1引物和序列4所示的2019-ncov-f1引物；

若目标核酸为ebov基因组(genbankid：af086833.2)，则对应的crrna的核苷酸序列为序列5，用于扩增目标核酸的rt-raa扩增试剂盒中的引物为序列6所示的ebov-f1引物和序列7所示的ebov-r1引物；

若目标核酸为tbev基因组(genbankid：mh645618.1)，则对应的crrna的核苷酸序列为序列8，用于扩增目标核酸的rt-raa扩增试剂盒中的引物为序列9所示的tbev-f1引物和序列10所示的tbev-r1引物；

上述试剂盒在制备具有如下1)-3)中至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)检测目标核酸是否为病原体核酸；

2)检测目标核酸的snp位点多态性；

3)检测目标核酸是否为耐药基因。

本发明提供一种基于消线法的侧向流试纸及配套的报告rna的目标核酸检测试剂盒，该试剂盒中的试纸以“t”线的完全消失作为阳性结果的判读标准(即出现1条线为阳性、出现2条线为阴性)，在保证crispr核酸检测灵敏度的前提下，避免了因主观判读错误造成的假阳性结果，提高了crispr核酸检测结果的准确性；可通过结合crispr核酸检测系统实现对多种特定核酸(病原、基因突变、耐药突变等)的高灵敏、高特异、便捷检测。

附图说明

图1为“消线法”侧向流试纸原理模式图。

图2为“消线法”crispr侧向流试纸的灵敏度测试及与已有crispr核酸检测试纸的对比。

图3为“消线法”crispr侧向流试纸的特异性测试。

图4为“消线法”crispr侧向流试纸用于其他病原体的crispr检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：ntpmix(neb，n0466s)，rna酶抑制剂(murinernaseinhibitor，neb，m0314l)，t7rna聚合酶(neb，m0251s)，rt-raa扩增试剂盒(杭州众测，s003zc)，兔抗fitc抗体(上海生工，d110003)，链亲和素(索莱宝，s9170-10mg)，羊抗兔igg(赛默飞，n24916)，proclin300(sigma，48914-u)，硝酸纤维素膜(sartorius，cn140)，玻璃纤维(上海良信，cb08)，聚酯纤维(上海良信，dl42)，吸水纸(上海良信，ch37k)，hepes缓冲液(索莱宝，yz-b-hepes250)，mgcl2溶液(天根生化，rp107)，已有crispr侧向流试纸(twistdx,mileniahybridetect1)，lwcas13a蛋白(宁波匠神，db005)。

下述实施例中的核苷酸序列如下：

序列1为报告rna(20u)序列；

序列2为2019-ncov-crrna序列；

序列3为2019-ncov-f1引物序列；

序列4为2019-ncov-r1引物序列；

序列5为ebov-crrna序列；

序列6为ebov-f1引物序列；

序列7为ebov-r1引物序列；

序列8为tbev-crrna序列；

序列9为tbev-f1引物序列；

序列10为tbev-r1引物序列。

实施例1、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

1、“消线法”免疫层析试纸的制备

基于消线法的侧向流试纸(如图1a所示)按流动方向排序依次包括含有胶体金标记兔源抗fitc抗体的样品垫、含有t线和c线的nc膜以及吸水滤纸这3部分。

1)、含有胶体金标记兔源抗fitc抗体的样品垫

兔源fitc抗体购自上海生工，货号：d110003

胶体金溶液：每100ml纯化水加入0.4ml10％(质量体积比g：ml)的氯金酸和0.4ml10％(质量体积比g：ml)柠檬酸三钠，得到胶体金溶液。

胶体金标记兔源抗fitc抗体溶液：每1ml上述胶体金溶液加入0.005ml0.2m的碳酸钾水溶液以及0.01mg兔抗fitc抗体，得到浓度为0.01mg/ml胶体金标记兔源抗fitc抗体溶液。

将1ml胶体金标记兔源抗fitc抗体溶液喷在0.006m²面积的样品垫上，包被浓度为0.02mg/ml，得到含有胶体金标记兔源抗fitc抗体的样品垫。

2)、含有t线和c线的nc膜的制备

链霉亲和素溶液，溶质为链霉亲和素(索莱宝，s9170-10mg)，溶剂为磷酸盐包被缓冲液(每100ml含有0.8gnacl，0.58gna2hpo4·12h2o，0.06gnah2po4·2h2o,0.02mlproclin300(sigma，48914-u)，并用纯化水定容至100ml)，浓度为1.5mg/ml。

羊抗兔igg(抗fitc抗体的二抗)溶液，溶质为羊抗兔igg(赛默飞，n24916)，溶剂为磷酸盐包被缓冲液，浓度为1mg/ml。

将30μl上述链霉亲和素溶液喷施在nc膜上，形成t线，包被浓度为1.5mg/ml；将30μl羊抗兔igg溶液喷施在硝酸纤维素膜(nc膜)上，形成c线，包被浓度为1mg/ml；且t线和c线间隔7mm，得到含有t线和c线的nc膜。

3)、“消线法”免疫层析试纸的组装

将上述含有胶体金标记兔源抗fitc抗体的样品垫、含有t线和c线的nc膜和吸水滤纸按照层析方向依次组装在pvc底板上，得到“消线法”免疫层析试纸。

2、crispr反应体系

反应体系包括如下物质：

1)报告rna

从北京天一辉远生物科技有限公司定制合成。

报告rna(20u)由20个u组成，核苷酸序列为序列1，且该rna的两个末端分别标记fam和生物素，其中fam与胶体金标记兔源抗fitc抗体结合，生物素与试纸条上的t线链霉亲和素结合。

2)crrna的制备

crrna由lwcas13a蛋白结合区域和目标核酸靶序列结合区域组成。

3)lwcas13a蛋白、ntpmix、t7rna聚合酶、rna酶抑制剂、mgcl2溶液和hepes缓冲液。

3、制备基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒

将上述一制备的“消线法”侧向流免疫层析试纸、上述crispr反应体系单独包装，构建得到基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒(基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒)。

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒检测原理和方法建立

1、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒检测原理

若待测样品中含有目标核酸，目标核酸与crispr反应体系中的crrna结合激活crispr反应体系中lwcas13a蛋白的活性，则crispr检测体系中末端连接fam基团和生物素的报告rna会被lwcas13a蛋白剪切，得到的反应体系在经过“消线法”免疫层析试纸的样品垫时，结合胶体金标记兔源抗fitc抗体，得到含有胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团的体系，经过t线时，不与链霉亲和素结合，t线不显色，待到c线时被c线抗体(羊抗兔igg-胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团)捕获后胶体金沉降显色，c线显色(试纸上仅出现1条质控线)。

若待测样品中不含有目标核酸，目标核酸无法激活crispr反应体系中lwcas13a蛋白的活性，则crispr检测体系中末端连接fam基团和生物素的报告rna不被lwcas13a蛋白剪切，得到的反应体系在经过“消线法”免疫层析试纸的样品垫时，结合胶体金标记兔源抗fitc抗体，得到含有胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团-生物素的体系，经过t线时，胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团-生物素上的生物素与t线上的链霉亲和素结合，胶体金沉降t线显色，经过c线时，胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团-生物素上的兔源抗fitc抗体与处于c线羊抗兔igg捕获后胶体金沉降显色(羊抗兔igg-胶体金标记兔源抗fitc抗体-fam基团-生物素)，c线显色(试纸上出现2条线，分别是质控线和检测线)。

2、方法的建立

1)目的核酸的扩增

提取待测样本中的核酸为目标核酸，作为预扩增的模板。

利用rt-raa扩增试剂盒对目标核酸进行预扩增，简要步骤如下：首先将2μl模板、2μl上下游引物(10μm)、41.5μlabuffer配制为混合液，加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μlbbuffer溶液，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟，得到rt-raa扩增产物。

2)crispr反应

利用lwcas13a蛋白和报告rna(20u)进行crispr反应，50μl体积crispr反应体系如下：

5μlrt-raa产物；2μllwcas13a蛋白(1.13μm，宁波匠神，db005)；4μlntpmix(neb，n0466s)；1μlt7rna聚合酶(neb，m0251s)；2μlrna酶抑制剂(murinernaseinhibitor，neb，m0314l)；0.5μlmgcl2溶液(1m)；1μlhepes缓冲液(1m，索莱宝，yz-b-hepes250)；3μl相应crrna(375nm)；5μl报告rna(20nm)；26.5μl无酶水。

将上述反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10秒钟后，放置在37℃条件下反应30分钟，得到crispr反应产物。

3)试纸检测

将crispr反应产物全部加入基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

阴性对照：配置不含有raa扩增产物的crispr体系，并全部加入“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

判断标准如下(图1b)：

若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有目标核酸，判定为阳性；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有目标核酸，判定为阴性；若试纸没有c线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

实施例2、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒与现有crispr侧向流层析试纸在检测新型冠状病毒核酸中的比较

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

1、“消线法”免疫层析试纸的制备

与实施例1的1相同；

2、crispr反应体系

1)报告rna的获得

与实施例1的2相同；

2)crrna的制备

crrna由lwcas13a蛋白结合区域和目标核酸靶序列结合区域组成。

crrna的核苷酸序列为序列2，其中，序列2中第1-38位为lwcas13a蛋白结合的区域，第39-66位为目标核酸(新型冠状病毒核酸)靶序列结合的区域。

3)lwcas13a蛋白、ntpmix、t7rna聚合酶、rna酶抑制剂、mgcl2溶液和hepes缓冲液。

3、制备基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒

将上述一制备的“消线法”免疫层析试纸、上述crispr反应体系单独包装，构建得到基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒(基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒)。

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的检测

1)、目的核酸的扩增

靶序列为新型冠状病毒基因组(genbankid：mn908947.3，2020年03月18日)第29265-29292位，以该靶序列作为标准化新型冠状病毒核酸。

将标准化新型冠状病毒核酸用ddh2o纯化水稀释至10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl分别作为目标核酸，并设置阴性对照组(h2o)。

利用rt-raa扩增试剂盒对目标核酸进行预扩增，简要步骤如下：首先将2μl模板、2μl上下游引物(10μm，序列3所示的2019-ncov-f1引物和序列4所示的2019-ncov-f1引物)、41.5μlabuffer配制为混合液，加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μlbbuffer溶液，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟，得到rt-raa扩增产物。

2)crispr反应

利用lwcas13a蛋白和报告rna(20u)进行crispr反应，crispr反应体系如下：

5μlrt-raa产物；2μllwcas13a蛋白(1.13μm，宁波匠神，db005)；4μlntpmix(neb，n0466s)；1μlt7rna聚合酶(neb，m0251s)；2μlrna酶抑制剂(neb，m0314l))；0.5μlmgcl2溶液(1m)；1μlhepes缓冲液(1m，索莱宝，yz-b-hepes250))；3μl相应crrna(375nm)；5μl报告rna(20nm)；26.5μl无酶水。

将上述反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10秒钟后，放置在37℃条件下反应30分钟，得到crispr反应产物。

3)试纸检测

将crispr反应产物全部加入基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

阴性对照：配置不含有rt-raa扩增产物的crispr反应体系，并全部加入“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

判断标准如下：

若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有目标核酸，判定为阳性；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有目标核酸，判定为阴性；若试纸没有c线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

结果如图2a所示，可以看出，除了阴性对照组为c线、t线同时显现(判定为阴性)外，其余各组均只显示c线(判定为阳性)。

三、对照：已有crispr侧向流试纸的灵敏度

利用已有crispr侧向流试纸(twistdx,mileniahybridetect1)代替上述试纸进行步骤3)，其余步骤与“消线法”crispr核酸检测试剂盒相同。

判断标准如下：

若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有目标核酸，判定为阳性；若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有目标核酸，判定为阴性；若试纸没有c线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

结果如图2b所示，可以看出，除了阴性对照组为c线、t线同时显现(判定为阴性)外，其余各组均显示t线，c线减弱(无法判定)。

四、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析核酸检测试剂盒的反应体系检测

将不含有rt-raa扩增产物的crispr反应体系(阴性对照)在反应结束后全部加入基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸和已有crispr侧向流试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

结果如图2c所示，“消线法”免疫层析试纸(本试纸)中c线、t线同时显现(判定为阴性)，已有crispr侧向流试纸中c线、t线同时显现(判定为阳性)。

因此，从上述可以看出，消线法试纸对新型冠状病毒的灵敏度为单拷贝(10⁰copies/μl)，且容易准确判读实验结果，自然状态下少量报告rna的降解不会影响结果判读；已有crispr试纸结果判读存在很大的主观因素，在认定是否存在c线、t线等问题上容易产生分歧，自然状态下少量报告rna的降解严重影响其结果判读。综上所述，消线法侧向流试纸在结果判读标准上更具有标准性。

实施例3、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒在检测新型冠状病毒核酸的临界浓度重复性

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

与实施例2的一相同；

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的检测

1)、目的核酸的扩增

由实施例2得到消线法试纸对新型冠状病毒的灵敏度为10⁰copies/μl，利用10⁰copies/μl的标准化新型冠状病毒核酸作为目标核酸，并设置阴性对照组(h2o)。

方法与实施例2的二相同。

2)crispr反应

方法与实施例2的二相同。

3)试纸检测

方法与实施例2的二相同。

通过基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸进行20次重复检测。

结果如下：除了阴性对照组为c线、t线同时显现(判定为阴性)外，其余各组均只显示c线(判定为阳性)。

表明，本试剂盒对新型冠状病毒的临界浓度重复性良好，可以稳定检出。

实施例4、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒在检测新型冠状病毒核酸的特异性

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

与实施例2的一相同；

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的检测

1)、目的核酸的扩增

以本实验室保存的日本脑炎病毒(jev)、立克次氏体(ric)、乙肝病毒(hbv)、埃博拉病毒(ebov)、单增李斯特菌(lm)、h7n9流感病毒(h7n9)、呼吸道合胞病毒(rsv)、森林脑炎病毒(tbev)、sars病毒(sars)、中东呼吸综合症冠状病毒(mers)病原核酸为模板作为实验组，并设置阴性对照组(h2o)和阳性对照组(2019-ncov，genbankid：mn908947.3，2020年03月18日)。

方法与实施例2的二相同。

2)crispr反应

方法与实施例2的二相同。

3)试纸检测

方法与实施例2的二相同。

结果如图3所示，除了阳性对照组(2019-ncov)只显示c线(判定为阳性)外，其余各组均为c线、t线同时显现(判定为阴性)。

上述结果表明，本试剂盒对新型冠状病毒的特异性良好，对其他病原尤其是sars等相似病原均不产生交叉反应。

实施例5、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒在临床上检测新型冠状病毒的应用

本临床试验根据《体外诊断试剂注册管理办法》(国家食品药品监督管理总局局令第5号)、《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》(国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号)的要求，在湖北省疾病预防控制中心、华中科技大学同济医学院附属梨园医院和中国科学院大学宁波华美医院三家临床试验机构进行，并通过各自临床试验机构的伦理委员会批准。

本临床试验共收到574例有效病例，分别来自湖北省疾病预防控制中心(347例)、华中科技大学同济医学院附属梨园医院(119例)、中国科学院大学宁波华美医院(108例)等三家临床试验机构，临床病例样本包含“疑似病例”、“疑似聚集性病例患者”、解除隔离人群、符合出院标准人群的新鲜采集的样本、冻存样本、冻存的样本核酸(rna)提取液。

本临床试验采取对比分析的方式，对比试剂选用中山大学达安基因股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒(荧光pcr法)，国械注准20203400063。

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

与实施例2的一相同；

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的检测

1)、目的核酸的扩增

方法与实施例2的二相同。

2)crispr反应

方法与实施例2的二相同。

3)试纸检测

方法与实施例2的二相同。

对比试剂：以新型冠状病毒2019-ncov核酸检测试剂盒检测同样样本作为对照。

对574例样本进行统计分析，结果如表1所示，本发明试剂盒与对比试剂进行对比，结果阳性符合率为89.86％，阴性符合率为99.44％，总体符合率为95.82％，kappa值为0.909，大于0.75，对kappa值进行假设检验，结果p小于0.05，表明kappa值具有统计学意义(表1)。

表1临床试验结果2×2列联表

上述结果表明，本发明的试剂盒与目前常用临床诊断试剂盒在诊断结果上具有一致性。

实施例6、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒在其他病原体检测中的应用

将标准化埃博拉病毒(ebov)和森林脑炎病毒(tbev)核酸分别稀释至10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl，并设置阴性对照组(h2o)，通过消线法侧向流试纸进行检测。

埃博拉病毒(ebov)所用靶序列为其基因组(genbankid：af086833.2，2012年02月13日)序列的第1001-1028位；

森林脑炎病毒(tbev)所用靶序列为其基因组(genbankid：mh645618.1，2020年01月07日)序列的第11023-11050位；

一、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的制备

1、“消线法”免疫层析试纸的制备

与实施例1的1相同；

2、crispr反应体系

1)报告rna的获得

与实施例1的2相同；

2)crrna的制备

crrna(ebov)由lwcas13a蛋白结合的区域和与目标核酸靶序列(ebov靶序列)结合的区域组成，其核苷酸序列为序列5，其中，序列5中第1-38位为lwcas13a蛋白结合的区域，第39-66位为与目标核酸靶序列结合的区域。

crrna(tbev)由与lwcas13a蛋白结合的区域和与目标核酸靶序列(tbev靶序列)结合的区域组成，其核苷酸序列为序列8，其中，序列8中第1-38位为lwcas13a蛋白结合的区域，第39-66位为与目标核酸靶序列结合的区域。

3)lwcas13a蛋白、ntpmix、t7rna聚合酶、rna酶抑制剂、mgcl2溶液和hepes缓冲液。

3、制备基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒

将上述一制备的“消线法”免疫层析试纸、上述crispr反应体系单独包装，构建得到基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒。

二、基于crispr检测原理和“消线法”免疫层析的核酸检测试剂盒的检测

1)、目的核酸的扩增

将埃博拉病毒(ebov)核酸(af086833.2)和森林脑炎病毒(tbev)核酸(mh645618.1)分别用ddh2o纯化水稀释至10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl分别作为目标核酸，并设置阴性对照组(h2o)。

利用rt-raa扩增试剂盒对目标核酸进行预扩增，简要步骤如下：首先将2μl模板、2μl上下游引物(10μm)、41.5μlabuffer配制为混合液，加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μlbbuffer溶液，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟，得到rt-raa扩增产物。

ebov扩增中的上下游引物分别为序列6所示的ebov-f1引物和序列7所示的ebov-r1引物；

tbev扩增中的上下游引物分别为序列9所示的tbev-f1引物和序列10所示的tbev-r1引物。

2)crispr反应

利用lwcas13a蛋白和报告rna(20u)进行crispr反应，体系如下：

5μlrt-raa产物；2μllwcas13a蛋白(1.13μm，宁波匠神，db005)；4μlntpmix(neb，n0466s)；1μlt7rna聚合酶(neb，m0251s)；2μlrna酶抑制剂(neb，m0314l))；0.5μlmgcl2溶液(1m)；1μlhepes缓冲液(1m，索莱宝，yz-b-hepes250)；3μl相应crrna(375nm)；5μl报告rna(20nm)；26.5μl无酶水。

将上述反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10秒钟后，放置在37℃条件下反应30分钟，得到crispr反应产物。

3)试纸检测

将crispr反应产物全部加入基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

阴性对照：配置不含有rt-raa扩增产物的crispr反应体系，并全部加入基于crispr检测原理的核酸检测试剂盒的“消线法”免疫层析试纸的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察并拍照记录结果。

判断标准如下：

若试纸没有t线显现且有c线显现，则待测样本含有或候选含有目标核酸，判定为阳性；若试纸有t线显现且有c线显现，则待测样本不含有或候选不含有目标核酸，判定为阴性；若试纸没有c线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

结果如图4所示，除了阴性对照组为c线、t线同时显现(判定为阴性)外，其余各组均只显示c线(判定为阳性)。

上述结果表明，本试剂盒对埃博拉病毒和森林脑炎病毒的灵敏度均为单拷贝(10⁰copies/μl)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种“消线法”免疫层析试纸及其在crispr核酸检测中的应用

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