灵芝石斛双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用的制作方法

1.本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种灵芝石斛双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用。


背景技术：

2.灵芝（ganoderma lucidum）被称为“扶正固本，滋补强壮”的珍贵中药材，属多孔菌科药用真菌，一直被用作治疗肝病、高胆固醇、高血脂等疾病。灵芝中主要抗氧化活性成分被认为是灵芝三萜与灵芝多糖。灵芝多糖还能显著促进细胞核内dna合成功能，并可促进细胞的分裂，从而起到延缓衰老的作用，并具有增强免疫力的作用。灵芝分为三个生长阶段：孢子、菌丝、子实体，灵芝菌作为第二生长阶段，近年来灵芝菌丝体与发酵液的充分利用为灵芝开发了一条新的应用途径。
3.铁皮石斛（dendrobium officinale）是我国名贵中草药，石斛系属兰科植物，因表皮呈铁绿色而得名，具有清热养阴、生津益胃、润肺止咳等功效。铁皮石斛中主要药效成分为多糖、生物碱、糖苷、菲类、联苄类和氨基酸等，而其中的多糖含量最高，且具有良好的抗肿瘤、抗氧化和增强免疫力的作用。因此铁皮石斛在药品、保健食品和化妆品的功效原料方面的应用受到科研工作者、医生、养生族和化妆品工程师的高度重视。
4.双向发酵技术是指用真菌为发酵菌种，利用药材或药渣作为药性基质共同构成发酵组合进行发酵的方式。双向发酵后菌质相比于原药材主要有几个方面的效果：增强药效、扩大用途、减轻毒性。“双向发酵工程”展示了药用真菌（含其它真菌）与中药材的有机结合，很好的克服了野生药用植物利用的难题，如果这种配伍组合正确，生产方法合理，还会产生多种作用，如提高中药有效成分含量、产生新的成分或药效作用、增加疗效或产生协调作用、降低中药有效成分的毒性等。
5.自然界真菌约有40万种，其中高等真菌数千种列，现有供药用与食用的真菌达数百种，已知真菌的酶类近400种，不同种类真菌的酶系统有所不同，而中药材目前达一万种左右，不同种类的成分也有不同，如果双方交叉组合可能构成大量不同的发酵组合，可产生几乎是无限量的、成分、性质不同的“菌质”，这些不同发酵组合产生的菌质各具一定的变化特色，可据既定的临床治疗目标用相应的免疫、药效等指标进行筛选，可获得具有一定功效的发酵产品，再对选定的品种作进一步研究，开发成新型真菌产品。
6.中国专利cn 105193905 a公开了一种灵芝黄芪双向发酵的中药加工技术，包括黄芪预处理、灵芝菌种活化、双向发酵培养基配制、双向发酵及药性变化和发酵菌质的处理。该申请文件描述了通过双向发酵技术增强两者的生物活性及药效，黄芪的抗氧化活性经发酵之后提高了20%以上且易于吸收。通过文献及专利调研发现灵芝与铁皮石斛的双向发酵物尚未应用于化妆品行业，本研究旨在通过灵芝与铁皮石斛双向发酵技术来得到一种组合物，开拓其在化妆品领域中的应用。


技术实现要素：

7.本发明的目的是通过新型双向发酵技术，将铁皮石斛与灵芝菌配伍进行发酵，旨在提高灵芝石斛菌种双向发酵体系在化妆品方面的应用。
8.一种灵芝石斛双向发酵液，其特征在于，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液20-100份、氮源0.1-20份、维生素0.1-1份、无机盐0.4-0.5份、ph调节剂0.01-0.02份；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为2%-10%。
9.进一步地，所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液40-80份、氮源5-15份、维生素0.3-0.8份、无机盐0.5份、ph调节剂0.02份；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为4%-8%。
10.进一步地，所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液20份、氮源10份、维生素0.5份、无机盐0.5份、ph调节剂0.02份；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为6%。
11.进一步地，所述氮源和维生素由蛋白胨提供；所述无机盐为氯化钠、所述ph调节剂为碳酸钙。
12.所述灵芝石斛双向发酵液的工艺，包括以下步骤：（1）制备石斛提取液；（2）制备灵芝菌液；（3）配制双向发酵培养基：将石斛提取液、氮源、维生素、无机盐和ph调节剂混合搅拌均匀，灭菌备用；（4）双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基进行发酵，待发酵完毕，灭菌、冷却、过滤得发酵液。
13.进一步地，步骤（1）中，所述石斛提取液由以下方法制得：粉碎石斛，过20-150目筛处理，将过筛后的石斛粉与蒸馏水按照料液比为1:60混合搅拌均匀，于80℃恒温提取2.5h，过滤除去不溶物，得石斛提取液。
14.进一步地，步骤（2）中，所述灵芝菌液由以下方法制得：取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在26℃、150r/min的条件下培养7-10天，得灵芝菌液。
15.所述种子培养基包括下述原料：葡萄糖、蛋白胨、氯化钠、碳酸钙。
16.进一步地，步骤（4）中，所述发酵为：以200r/min的搅拌速度，在发酵温度为26℃，ph为5.2-9.2的条件下，培养发酵。
17.进一步地，步骤（4）中，所述灭菌为在温度为120℃、压力为0.13mpa的高温高压条件下，灭菌30min；冷却，采用0.2um的滤板过滤得发酵液。
18.所述灵芝石斛双向发酵液及灵芝石斛双向发酵工艺所得发酵液在化妆品方面的应用。
19.本发明的有益效果为：通过双向发酵技术，将灵芝与石斛进行双向发酵，得到了其较优的发酵条件，且所得灵芝石斛双向发酵液清除dpph的能力明显优于石斛提取液、灵芝发酵菌液及未经双向发酵的灵芝石斛发酵产物；灵芝石斛双向发酵液所含总多酚的含量达到8.065mg/ml明显高于未经双向发酵的灵芝石斛发酵液、石斛提取液和灵芝发酵液所含总多酚的量。
20.此外，本发明所述灵芝石斛双向发酵液对透明质酸酶具有很高的抑制率，其对透明质酸酶的抑制率高达82.3%，明显高于未经双向发酵的灵芝石斛发酵液、石斛提取液和灵芝发酵液对透明质酸酶的抑制率，即本发明所述灵芝石斛双向发酵液具有良好的抗炎效果，可作为潜在的化妆品延缓衰老、抗炎原料使用。
21.由本发明灵芝石斛发酵液制成的面膜在保湿、补水以及改善皮肤光泽度、色度、减少红斑及美白方面具有一定的功效。
具体实施方式
22.实施例1一种灵芝石斛双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液20g、氮源0.1g、维生素0.1g、无机盐0.4g、ph调节剂0.01g；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为6%；所述氮源和维生素由蛋白胨提供；所述无机盐为氯化钠、所述ph调节剂为碳酸钙。
23.所述灵芝石斛双向发酵液的工艺，包括以下步骤：（1）制备石斛提取液；粉碎石斛，过20目筛处理，将过筛后的石斛粉与蒸馏水按照料液比为1:60混合搅拌均匀，于80℃恒温提取2.5h，过滤除去不溶物，得石斛提取液;（2）制备灵芝菌液；取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在26℃、150r/min的条件下培养7天，得灵芝菌液;（3）配制双向发酵培养基：将石斛提取液、氮源、维生素、无机盐和ph调节剂混合搅拌均匀，灭菌备用；（4）双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基以200r/min的搅拌速度，在发酵温度为26℃，ph为7.2的条件下进行发酵，待发酵完毕，在温度为120℃、0.13mpa的高温高压条件下灭菌30min、冷却、采用0.2um的滤板过滤得发酵液。
24.所述灵芝石斛双向发酵液及灵芝石斛双向发酵工艺所得发酵液可应用到化妆品中。
25.实施例2实施例2所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述培养基中石斛提取液的加入量为40g，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
26.实施例3实施例3所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述培养基中石斛提取液的加入量为60g，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
27.实施例4
实施例4所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述培养基中石斛提取液的加入量为80g，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
28.实施例5实施例5所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述培养基中石斛提取液的加入量为100g，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
29.对比例对比例所述一种灵芝石斛双向发酵液，分别在实施例1-5所述一种灵芝石斛双向发酵液的培养基中加入1g葡萄糖作为对比例1-5，其余均与实施例所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
30.实施例1-5与对比例所述一种灵芝石斛双向发酵液的对比研究：表1 不同培养基对灵芝石斛双向发酵液的影响 蛋白胨葡萄糖氯化钠caco3石斛提取液水灵芝菌液ph实施例10.5g-0.4g0.01g20g80g6%7.2实施例20.5g-0.4g0.01g40g60g6%7.2实施例30.5g-0.4g0.01g60g40g6%7.2实施例40.5g-0.4g0.01g80g20g6%7.2实施例50.5g-0.4g0.01g100g0g6%7.2对比例10.5g1g0.4g0.01g20g80g6%7.2对比例20.5g1g0.4g0.01g40g60g6%7.2对比例30.5g1g0.4g0.01g60g40g6%7.2对比例40.5g1g0.4g0.01g80g20g6%7.2对比例50.5g1g0.4g0.01g100g0g6%7.2
通过对实施例1-5、对比例1-5菌丝生长状况观察可知：在相同培养基下，随着石斛提取液的量增加，灵芝菌丝生长速度越快、灵芝菌量越多；由实施例与对比例对比可知：对比例在添加葡萄糖后，灵芝菌球生长过大，不利于发酵罐接菌，因此本发明所用培养基中不加入葡萄糖。
31.实施例6一种灵芝石斛双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液100g、氮源10g、维生素0.5g、无机盐0.5g、ph调节剂0.02g；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为2%。
32.所述氮源和维生素由蛋白胨提供；所述无机盐为氯化钠、所述ph调节剂为碳酸钙。
33.所述灵芝石斛双向发酵液的工艺，包括以下步骤：（1）制备石斛提取液；粉碎石斛，过50目筛处理，将过筛后的石斛粉与蒸馏水按照料液比为1:60混合搅拌均匀，于80℃恒温提取2.5h，过滤除去不溶物，得石斛提取液;（2）制备灵芝菌液；取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在26℃、150r/min的条件下培养8天，得灵芝菌液;（3）配制双向发酵培养基：将石斛提取液、蛋白胨、氯化钠和碳酸钙混合搅拌均匀，灭菌备用；
（4）双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基以200r/min的搅拌速度，在发酵温度为26℃，ph为7.2的条件下进行发酵，待发酵完毕，在温度为120℃、压力为0.13mpa的高温高压条件下灭菌30min、冷却、采用0.2um的滤板过滤得发酵液。
34.所述灵芝石斛双向发酵液及灵芝石斛双向发酵工艺所得发酵液可应用到化妆品中。
35.实施例7实施例7所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为4%，其余均与实施例6所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
36.实施例8实施例8所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为8%，其余均与实施例6所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
37.实施例9实施例9所述一种灵芝石斛双向发酵液，所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10%，其余均与实施例6所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
38.表2 不同加入量的灵芝菌液对灵芝石斛双向发酵液的影响 蛋白胨氯化钠caco3石斛提取液灵芝菌液ph实施例60.5g0.5g0.02g100g2%7.2实施例70.5g0.5g0.02g100g4%7.2实施例50.5g0.5g0.02g100g6%7.2实施例80.5g0.5g0.02g100g8%7.2实施例90.5g0.5g0.02g100g10%7.2通过对实施例6-9菌丝生长状况观察可知，采用2%-10%的灵芝菌液的加入量，对灵芝菌生长速度的影响不是很大，采用6%灵芝菌液加入量时，灵芝菌生长速度较为良好，菌球量较多，因此本发明采用菌液接种量6%。
39.实施例10一种灵芝石斛双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与培养基通过双向发酵工艺制得；所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液100g、氮源20g、维生素1g、无机盐0.6g、ph调节剂0.03g；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为6%。
40.所述氮源和维生素由蛋白胨提供；所述无机盐为氯化钠、所述ph调节剂为碳酸钙。
41.所述灵芝石斛双向发酵液的工艺，包括以下步骤：（1）制备石斛提取液，粉碎石斛，过150目筛处理，将过筛后的石斛粉与蒸馏水按照料液比为1:60混合搅拌均匀，于80℃恒温提取2.5h，过滤除去不溶物，得石斛提取液；（2）制备灵芝菌液，取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在26℃、150r/min的条件下培养10天，得灵芝菌液；（3）配制双向发酵培养基：将石斛提取液、蛋白胨、氯化钠和碳酸钙混合搅拌均匀，灭菌备用；（4）双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基以200r/min的搅拌速度，在发酵
温度为26℃，ph为5.2的条件下进行发酵，待发酵完毕，在温度为120℃、0.13mpa的高温高压条件下灭菌30min、冷却、采用0.2um的滤板过滤得发酵液。
42.所述灵芝石斛双向发酵液及灵芝石斛双向发酵工艺所得发酵液可应用到化妆品中。
43.实施例11实施例11所述一种灵芝石斛双向发酵液，在双向发酵过程中，发酵的ph为6.2，其余均与实施例10所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
44.实施例12实施例12所述一种灵芝石斛双向发酵液，在双向发酵过程中，发酵的ph为8.2，其余均与实施例10所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
45.实施例13实施例13所述一种灵芝石斛双向发酵液，在双向发酵过程中，发酵的ph为9.2，其余均与实施例10所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。
46.表3 不同发酵ph对灵芝石斛双向发酵液的影响 蛋白胨氯化钠caco3石斛提取液灵芝菌液ph实施例50.5g0.6g0.03g100g6%7.2实施例100.5g0.6g0.03g100g6%5.2实施例110.5g0.6g0.03g100g6%6.2实施例120.5g0.6g0.03g100g6%8.2实施例130.5g0.6g0.03g100g6%9.2通过对实施例5、实施例10-13菌丝生长状况观察可知：在ph为7.2时，灵芝菌球呈现出较好的生长状态，ph低于7.2时，得到的菌球的数量较少，ph高于7.2时，菌球生长过程中会出现不分裂，菌球过大的现象，因此，本发明选择发酵ph为7.2。
47.对比例1一种未经双向发酵的灵芝石斛发酵液，所述未经双向发酵的灵芝石斛发酵液包括培养基和灵芝菌液：所述培养基包括下述重量份的原料：石斛提取液20g、氮源0.5g、维生素0.1g、无机盐0.5g、ph调节剂0.02g；所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为6%；所述氮源和维生素由蛋白胨提供；所述无机盐为氯化钠、所述ph调节剂为碳酸钙。
48.所述未经双向发酵的灵芝石斛双向发酵液的工艺，包括以下步骤：将石斛提取液、氮源、维生素、无机盐、ph调节剂混合搅拌均匀，灭菌，接种灵芝菌液，混合搅拌均匀，得未经双向发酵的灵芝石斛双向发酵液。
49.对比例2一种灵芝菌液，所述灵芝菌液由以下方法制得：取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在26℃、150r/min的条件下培养7-10天，得灵芝菌液。
50.对比例3一种石斛提取液，所述石斛提取液由以下方法制得：粉碎石斛，过100目筛处理，将过筛后的石斛粉与蒸馏水按照料液比为1:60混合搅拌均匀，于80℃恒温提取2.5h，过滤除去不
溶物，得石斛提取液。
51.1、本发明所述灵芝石斛双向发酵液对dpph清除率测定1.1试剂配制（1）配制0.2mm/l的dpph乙醇溶液，称取20mgdpph，加入无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中，并4℃避光保存；（2）100ug/ml vc溶液配制：称取25mgvc加入蒸馏水溶解并定溶于250ml容量瓶中，避光保存；（3）样品浓度：对双向深层发酵的灵芝石斛发酵液进行稀释，稀释浓度为25%、20%、10%、5%，以及对未经发酵的培养基进行稀释，稀释浓度为100%、75%、50%、25%。
52.1.2实验过程（1）取1.0ml的待测液与1.0ml的dpph溶液加入a管，混合搅拌均匀；（2）取1.0ml的水与1.0ml的dpph溶液加入b管，混合搅拌均匀；（3）取1.0ml的无水乙醇溶液与1.0ml的待测液加入c管，混合搅拌均匀；（4）上述各混合液在暗处放置30min后，分别在517nm下测a、b、c管吸光度值；（5）计算清除率：清除率（%）=［（b+c）-a］/b＊100%1.3实验结果以本发明实施例5所述灵芝石斛双向发酵液作为试验组，对比例1-3所述发酵液分别作为对照组1、对照组2、对照组3，研究其在不同浓度下对dpph清除率，结果如表1所示：表4 dpph清除率对比研究表
从表4可知：当灵芝石斛双向发酵液的浓度为10%时，dpph清除率达到53.26%；灵芝单独发酵液的浓度为10%时，dpph清除率达到22.95%，而当未经双向发酵的灵芝石斛发酵液的浓度为50%时，其dpph清除率仅达到33.48%，石斛提取液与未经双向发酵的灵芝石斛发酵液的dpph清除率相似。即灵芝石斛双向发酵液的抗氧化能力优于未经双向发酵的灵芝石斛发酵液，优于灵芝提取液、石斛提取液在抗氧化方面的能力。
53.2、总多酚含量的测定2.1试剂配制（1）配制10%福林酚试剂（现配）：15ml福林酚，加入135ml去离子水，混匀即得；（2）配制7.5%碳酸钠：称取15g碳酸钠，用去离子水定容至200ml；2.2实验过程取1ml待测样品，分别加入5ml，10%福林酚试剂，混匀，7min后，加入4ml，7.5%碳酸钠溶液，1h后，765nm处测定吸光值；
以本发明实施例3所述灵芝石斛双向发酵液作为试验组，对比例1-3所述发酵液分别作为对照组1、对照组2、对照组3，对比研究其总多酚的含量，结果如表2所示：表5 总多酚含量对比研究表项目试验组对照组1对照组2对照组3总多酚含量8.065mg/ml4.119mg/ml5.356mg/ml4.093mg/ml从表5可知：经过双向发酵的灵芝石斛发酵液总多酚的含量高于未经双向发酵的灵芝石斛发酵液总多酚的含量；高于灵芝发酵液、石斛提取液中总多酚的含量。
54.3、透明质酸酶抑制实验3.1试剂配制（1）透明质酸酶：浓度500u/ml，现配现用，不能过夜，用醋酸缓冲液做溶剂；（2）透明质酸钠：0.5mg/ml，一次配制，多次使用，用醋酸缓冲液做溶剂；（3）buffer：溶液a（0.2mol/l醋酸、11.55ml冰醋酸溶于1l蒸馏水中）4.8ml；溶液b（0.2mol/l醋酸钠、16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于1l蒸馏水中）45.2ml，混合稀释至100ml，配制成ph=5.6的醋酸缓冲液；（4）乙酰丙酮溶液：50ml，1.0mol/l碳酸钠溶液和3.5ml乙酰丙酮溶液混合均匀（临用现配）（5）p-dab显色剂：0.8g对二甲氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇混合均匀；（6）氯化钙溶液：2.5mol/l；（7）氢氧化钠溶液：5mol/l。
55.3.2实验过程表6透明质酸酶抑制实验加样表
透明质酸酶抑制率（%）=[(c-d)-(a-b)]/ (c-d)
ꢀ×
100%试中：a—（透明质酸酶+样品+透明质酸钠）试样溶液的od值b—（醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液）试样空白的od值c—（透明质酸酶+去离子水+透明质酸钠）对照溶液的od值
d—（醋酸缓冲液+去离子水+醋酸缓冲液）对照空白的od值备注：以鸢尾苷作为阳性对照组。
[0056]
表7 透明质酸酶抑制率对比研究表从表7可知：灵芝石斛双向发酵液对透明质酸酶的抑制率随着其浓度的增加而增加，其抑制率最高达到82.3%，通过与阳性对照组鸢尾苷的对比，说明灵芝石斛双向发酵液具有良好的抑制透明质酸酶的功效，即具有良好的体外抗炎效果。
[0057]
对照组1未经双向发酵的灵芝石斛发酵液对透明质酸酶的抑制率为51.47%，对照组2灵芝菌液对透明质酸酶的抑制率为67.34%，对照组3石斛提取液对透明质酸酶的抑制率
为58.49%，即灵芝石斛经双向发酵后，对透明质酸酶的抑制率远远高于未经双向发酵的灵芝石斛提取液、灵芝菌液及石斛提取液。
[0058]
4、本发明所述灵芝石斛双向发酵液人体保湿功效研究为了进一步验证灵芝石斛双向发酵液在化妆品领域的应用，将其发酵液制备成了面膜，并对其保湿功效进行相关的人体功效评价。通过检测志愿者使用产品前后皮肤水分含量、tewl值、皮肤光泽度和皮肤色度值的变化来评价产品的保湿以及美白等功效。
[0059]
4.1实验仪器和试剂（1）实验试剂
试剂规格试剂来源甘油arp&g1,3-丁二醇aroxea黄原胶—cpkelco馨鲜酮—德之馨u20—诺誉naohar北京化工厂亮灯石墨烯面膜布—上海林洁无纺布制品有限公司硫酸98%北京化工厂琼脂br西陇化工股份有限公司无水乙醇ethanolar北京化工厂碳酸钙ar西陇化工股份有限公司氯化钠ar西陇化工股份有限公司蛋白胨br北京奥博星生物技术公司葡萄糖br北京奥博星生物技术公司玉竹粉100目湖南抗坏血酸>99%北京百灵威科技有限公司氢氧化钠soldiumhydroxidear北京化工厂苯酚5%实验室制备pehg添加量：0.08% dpph>97%梯希爱（上海）化成工业发展有限公司福林酚1mol／ml源叶生物碳酸钠ar国药集团化学试剂
（2）实验设备
仪器厂家型号规格皮肤表面水分流失测试仪（tewametertm300）courageandkhazakatewametertm300/mpa-9皮肤光泽度测试探头（skin-glossymetergl200）courageandkhazakaglossymetergl200皮肤水分含量测试仪（corneometercm825）courageandkhazakacorneometercm825/mpa-9皮肤色差测试探头（colorimetercl400）courageandkhazakacolorimetercl400酶标仪tecaninfinitem200pro点热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司hws24型冰箱海尔bcd-177db超净工作台北京世安科林净化技术有限公司tp-3102电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司ty5002分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司xs205
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4.2 发酵液面膜的制备分别称取1，3-丁二醇和甘油，质量比为1:1，混合均匀，配置为多元醇；分别分别称取多元醇和灵芝菌石斛发酵液，质量比为3:7，混合均匀，配置为灵芝石斛发酵液复配液。
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4.3面膜配方原料名称质量分数（wt%）u200.1810%naoh0.45灵芝石斛发酵液复配液25馨鲜酮0.5黄原胶0.05根据上表称取配置100 g面膜液所需原料，在150 ml烧杯中添加适量蒸馏水，将u20轻轻撒于水面，无需搅拌，使u20浸润于水中，将烧杯放于电陶炉加热至85℃并保温30 min，冷却至65℃时加入馨鲜酮并搅拌均匀，待冷却至室温后，逐滴加入10%naoh，并确保u20与10%naoh比例为1:2.5，搅拌均匀后加入灵芝石斛发酵液复配液，将面膜液灌装于面膜袋中，每片面膜的装液量为25 g。
[0061]
4.4灵芝石斛发酵液面膜的功效评价随机选取50位，年龄范围为18-25岁的人群作为受试者，受试者洁面后于恒温恒湿的实验室环境静坐20 min后，测试皮肤本底的水分含量值、水分散失量、皮肤色度和光泽度，并计算其平均值。
[0062]
受试者使用灵芝石斛发酵液面膜，15 min后揭下面膜，轻怕至面膜液吸收，分别检测使用面膜15 min后的及时、0.5 h、2 h、3 h、4 h时皮肤的水分含量值、水分散失量、皮肤色度和光泽度，并计算其平均值。
[0063]
4.5检测结果4.5.1 灵芝石斛发酵液面膜使用前后的皮肤水分含量
皮肤水分含量本底及时0.5h2h3h4h均值46.04972.80067.42864.64260.11860.685
差值 26.7521.3818.5914.0714.64变化率 58.09%46.43%40.38%30.55%31.78%相对使用前显著性分析 4.6138e-416.2235e-305.24726e-237.21948e-131.6089e-12
由上表可知，灵芝石斛发酵物面膜在提高皮肤水分含量方面有显著的效果，使用面膜的及时皮肤水分含量由46提升至72，使用4h时皮肤水分含量依旧高于未使用时的皮肤水分含量，由此可知灵芝石斛发酵物面膜在补水方面有一定功效。
[0064]
4.5.2灵芝石斛发酵液面膜使用前后的皮肤水分散失量
皮肤水分散失量本底及时0.5h2h3h4h均值19.6418.9719.4619.5318.6819.73差值
ꢀ-
0.675-0.183-0.108-0.098-0.083变化率
ꢀ-
3.44%-0.93%-0.55%-0.35%0.42%相对使用前显著性分析 0.6110.8580.9220.9510.961
由上表可知，灵芝石斛发酵液面膜使用后皮肤水分散失量稍有降低，且无升高趋势，说明有一定的保湿效果。
[0065]
4.5.3 灵芝石斛发酵液面膜使用前后的皮肤光泽度
皮肤光泽度本底及时0.5h2h3h4h均值5.285.556.136.096.036.00差值 0.270.850.810.740.72变化率 5.08%16.11%15.29%14.53%13.68%相对使用前显著性分析 0.4000.0320.0110.0590.066
通过上表可知，灵芝石斛发酵液面膜使用前后皮肤光泽度有所提升。
[0066]
4.5.4灵芝石斛发酵液面膜使用前后的皮肤色度4.5.4.1灵芝石斛发酵液面膜使用前后的l值
l值本底及时0.5h2h3h4h均值64.0565.9064.4164.1963.4663.92差值 1.8550.3670.142-0.108-0.128变化率 2.90%0.57%0.22%-0.12%-0.20%相对使用前显著性分析 0.000170.6240.8030.7810.724
由上表可知，灵芝石斛发酵液面膜使用前后的l值有小幅下降，由此可以推断，灵芝石斛发酵液面膜在4小时内可以小幅提高皮肤白度。
[0067]
4.5.4.2灵芝石斛发酵液面膜使用前后的a值
a值本底及时0.5h2h3h4h均值12.4910.0511.8112.1512.3712.42差值
ꢀ-
2.44-0.68-0.34-0.12-0.07变化率
ꢀ-
19.50%-5.42%-2.72%-0.93%-0.58%相对使用前显著性分析 0.0250.0490.3930.8080.827
由上表可知，灵芝石斛发酵液面膜使用后a值明显降低，灵芝石斛发酵液面膜在减少皮肤红斑方面有一定功效。
[0068]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其细节上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，
均落在本发明的保护范围之内。