一株高效降解高盐废水中有机物和全盐的黄河盐单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高效降解高盐废水中有机物和全盐的黄河盐单胞菌及其应用。

背景技术：

高盐废水是指盐度(以nacl计)大于为1.0％(质量分数)的废水，其来源主要有两类：一类是石化、农化、皮革、制药、纺织等行业生产过程中产生的；另一类是为了充分有效利用水资源，节约淡水资源，沿海城市海水的大量使用所产生的。近些年，随着工业废水排放量及海水利用的日益增多，高盐废水的排放量大幅升高。这些废水中通常有机物含量高，若不经处理直接排放，势必会对生态环境造成极大的危害，因此，在工业排水中要求严格控制。

目前电解法、蒸发法、焚烧法、膜分离法和化学氧化法等物理化学法均在高盐废水处理中有所应用，但存在处理效果欠佳、二次污染、设备昂贵、维护成本较高的问题。而生物法不仅可以有效降低废水中的有机物等成分，而且环保无害，较为经济，故具有可观的利用价值和广阔的发展前景。普通微生物在污水处理过程中发挥了巨大的作用，但由于微生物的特殊性，废水中盐含量较高时，微生物由于外界渗透压过高，对微生物生长造成抑制，盐含量过高时能够使微生物死亡，进而影响污水处理效果。

近年来，国内外学者陆续筛选出一些能够耐受高盐环境的微生物。孙国庆等人制备了一种嗜盐菌复合菌剂，耐受盐含量为1-15％，但仅能降解废水中的三嗪类物质。高会杰等制备了一种耐盐微生物菌剂，cod和总氮去除率均可以达到90％以上，但是该微生物菌剂为多种菌构成的复合菌剂，耐受盐度范围仅为1-10％。除此之外现有技术中也有黄河盐单胞菌的相关研究，但是主要局限在其相关生物学特性的研究，对于其具体的应用研究较少，难以进行工业化应用。

因此本领域仍需寻求一种降解效率高、环境耐受性好的用于降解高盐废水中有机物的菌种，并将其合理的应用于废水处理中。

技术实现要素：

本发明针对上述技术存在的空白，提供一株高效降解高盐废水中有机物和全盐的黄河盐单胞菌及其应用，该菌株经鉴定为黄河盐单胞菌(halomonashuangheensis)，保藏号为cgmccno.20016；该菌株及其菌剂投入到高盐高cod废水中，可以有效耐受高盐环境，能够利用高盐废水系统中的有机物作为自身生长的营养物质，在废水中大量快速繁殖，对废水中的有机物进行彻底无害的降解处理，同时利用该菌株能够降低污水中的盐含量，还可以避免采用物理化学法处理污水成本高、造成二次污染等缺点，对操作人员无副作用；该菌剂的研究为高盐废水的生化处理奠定了基础，解决了常规微生物在高盐环境中生长受抑制，避免了高盐环境对生化处理系统造成冲击的问题，具有较高的应用价值。

本发明首先提供了一株全新的黄河盐单胞菌，该菌株是发明人从山东沾化某地区盐碱地周边土壤中，经初筛和复筛得到的。

该黄河盐单胞菌的形态特征如下：杆状或短杆状；在普通营养琼脂培养基培养1-2d后形成白色菌落，无芽孢，不透明，表面光滑湿润，呈圆形，边缘整齐，易挑取。该黄河盐单胞菌在盐含量1.5-30％(w/v)条件下生长，属于中度嗜盐菌。

发明人对其进行了16srdna测序，其核苷酸序列如seqidno：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列，所测得的16srdna序列进行blast比对，在分子水平上确定为黄河盐单胞菌，命名为yjy20-04，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20016。

经实验鉴定，该黄河盐单胞菌在盐含量1.5-30％(w/v)条件下生长，属于中度嗜盐菌，在温度30-37℃、ph7.0-7.5条件下处理3-5d，废水中cod在500-25000mg/l范围内，cod去除率＞80％，废水中全盐在15000-30000mg/l范围内，全盐去除率30-50％。

由于该菌株具有上述的有益效果，因此发明人进一步提供了该菌株的应用，利用该黄河盐单胞菌降解废水中的有机物和全盐，具体应用方法为：

该盐单胞菌制成固体菌剂或液体菌剂单独接种到高盐废水或生物降解池中，也可以与活性污泥共同使用，也可以固定于各种填料上挂膜后投加到高盐废水处理系统中，下面以直接接种到高盐废水或生物降解池中为例：

将黄河盐单胞菌悬浮于废水或生物降解池中，在温度为30-37℃、ph为7.0-7.5条件下进行搅拌3-5d，废水或生物降解池中含盐量在1.5-20％(w/v)，cod500-25000mg/l；

黄河盐单胞菌以液体菌剂或固体菌剂的形式投加，其中当采用液体菌剂时，每100l废水加入1-5l液体菌剂，当采用固体菌粉时，每100l废水加入0.1-1kg固体菌剂。

上述条件下该菌在cod500-25000mg/l范围内，对cod降解率高达80％，同时在全盐15000-30000mg/l条件下，全盐去除率达到30-50％，对高盐废水的处理显示出较高的应用价值。

上述液体菌剂或固体菌剂的具体制备方法如下，具体步骤为：

(1)菌种活化：取5-15μl冻存的黄河盐单胞菌接种于含有100mllb液体无菌培养基中，培养基中通过添加氯化钠使盐含量至w/v1.5-2％，置于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将活化的菌种100ml转接到含有1000mllb液体无菌培养基中，培养基中通过添加氯化钠使盐含量至w/v1.5-2％，于30-37℃，160-180rpm振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照v/v5-10％的接种量接种于装液量为60-70％的20l种子罐中扩大培养至对数期；

(4)生产罐发酵：将种子液按v/v8-10％的接种量接入装液量为60-70％的生产罐中的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到250亿/ml以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂；

在制备获得上述液体菌剂的基础上，还可以获得相应的固体菌剂，具体步骤如下：

(5)固体菌剂制备：将上述发酵完成后的液体菌剂浓缩到原体积的三分之一，之后按照质量比添加4-10％的硅藻土和1.5-2.0％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理上述获得的微生物菌剂，使其含水率控制在10％以内，即可获得固体菌剂。

上述过程中步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:0.8-1.5，搅拌速度为180-220rpm，培养温度为30-37℃，发酵周期为18-24h；

以上述步骤中，所用的种子罐和生产罐的发酵培养基配方为：葡萄糖0.8-1.2％，玉米淀粉0.8-1.2％，豆粕1.5-2.5％，酵母粉0.2-0.4％，硫酸镁0.03-0.07％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸锰0.02-0.06％，氯化钠1.5-2％，硫酸铵0.08-0.15％，水余量，ph7.0-7.4。

通过上述方法最终获得的固体菌剂的有效活菌数为2.0×10⁹-5×10¹⁰cfu/g，菌剂的含水率在10％以下。

采用固体菌剂时，优选的使用前先进行活化，具体活化方法为：固体菌剂按用量接种于营养盐溶液中进行活化，活化条件为溶解氧2-4mg/l，ph7.0-7.5，温度28-37℃，曝气4-6h进行活化。

上述活化过程中营养盐溶液组成如下：kh2po40.05-0.1g/l、k2hpo40.1-0.5g/l、nah2po40.1-0.5g/l、mgso4·7h2o0.1-0.5g/l、cacl20.1-0.5g/l、fecl30.001-0.01g/l，氯化钠15-20g/l，采用软化水进行溶解定容到1l。

一般情况下营养盐溶液用量能够满足固体菌剂生长活化即可，优选的按照固体菌剂1～5g/l的质量体积比接种于营养盐溶液中。

活化后的固体菌剂以溶于营养盐溶液的形式进行应用，但是计算其用量时需要按照原始加入的固体菌剂质量进行换算。

本发明的有益效果如下：

本发明的黄河盐单胞菌可应用于高盐废水的生物强化处理，利用该菌株制备获得的菌剂投入到高盐废水中，可以有效耐受高负荷的冲击，能够利用生化系统中的有机物作为自身生长的营养物质，快速降解有机物。在温度为30-37℃、ph为7.0-7.5条件下投加菌剂进行搅拌3-5d，废水或生物降解池中含盐量在1.5-20％(w/v)，cod500-25000mg/l，cod降解率高达80％以上。

同时该菌剂在废水含盐量1.5-3％(w/v)时，能够去除水中的部分全盐，在温度为30-37℃、ph为7.0-7.5条件下投加菌剂进行搅拌3-5d，全盐去除率达到30-50％。

使用该菌处理高盐废水还可以避免采用物理化学法处理成本高、二次污染等问题，经过处理后的污水达到综合池排放标准，大幅度降低了废水的处理成本，对操作人员无副作用。为高盐废水的生化处理研究奠定了物质基础，具有较高的应用价值，具有广阔的应用前景。

保藏信息，

保藏时间：2020年6月3日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心

保藏编号：cgmccno.20016

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

分类命名:黄河盐单胞菌(halomonashuangheensis)

附图说明

图1为实施例1中黄河盐单胞菌对cod的降解效果示意图；

图2为实施例2中黄河盐单胞菌对全盐的降解效果示意图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号cgmccno.20016的菌种。

实施例1不同cod和盐含量下该菌株对cod的降解效果实验

为了验证本申请所提供的菌株在不同cod和盐含量下对cod的降解效果，发明人进行了下述的实验：

分别选择初始cod为500mg/l、10000mg/l和25000mg/l的废水，接菌后在培养温度为37℃、170rpm的恒温培养箱中培养120h，研究不同盐含量下黄河盐单胞菌对不同浓度cod降解的影响实验。

(1)种子液制备：挑去黄河盐单胞菌单菌落接种于100mllb培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)中，于35℃、170rpm的恒温培养箱中培养24h，作为种子液备用；

(2)将步骤(1)获得的种子液按照体积比5％接种，菌液离心后去掉培养基，再用蒸馏水洗两遍离心后得到菌体。取某污水处理厂水解酸化池出水，该池出水cod为30000mg/l，全盐3000mg/l，ph7.0-7.5，将该污水分别稀释成cod为500mg/l、10000mg/l和25000mg/l，补加氯化钠至全盐浓度分别为20000mg/l、40000mg/l、60000mg/l、80000mg/l、100000mg/l、120000mg/l、140000mg/l、160000mg/l、180000mg/l和200000mg/l，然后接种上述经过处理的菌体置于35℃、170rpm的恒温培养箱中培养120h，分别取不同盐浓度条件下培养的菌液10ml，采用12000r/min离心10min后，分别取上清液1ml，参照化学需氧量的测定方法国标gb11914-89测定上清液中cod含量。

(3)cod在500-25000mg/l条件下，当全盐初始浓度为20000-80000mg/l条件下，黄河盐单胞菌菌株120h内可降解90％以上的cod，当全盐初始浓度为100000-160000mg/l时，120hcod降解率在85％以上，随着全盐浓度的增大，其降解率逐渐减小，结果如图1所示。

实施例2不同cod和盐含量下该菌株对全盐的降解效果实验

为了验证本申请所提供的菌株在不同cod和盐含量下对全盐的降解效果，发明人进行了下述的实验：

分别选择初始cod为800mg/l、15000mg/l和20000mg/l的废水，接菌后在培养温度为35℃、160rpm的恒温培养箱中培养120h，研究不同cod和不同盐含量下黄河盐单胞菌对全盐降解的影响实验。

(1)种子液制备：挑取黄河盐单胞菌单菌落接种于100mllb培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)中，于35℃、170rpm的恒温培养箱中培养24h，作为种子液备用。

(2)将步骤(1)获得的种子液按照体积比3％接种，菌液离心后去掉培养基，再用蒸馏水洗两遍离心后得到菌体。取某石化污水，该水cod为80000mg/l，全盐50000mg/l，ph7.0-7.5，分别稀释成cod为800mg/l、10000mg/l和25000mg/l的废水，每个cod的废水分别补加氯化钠至全盐浓度为15000mg/l、17000mg/l、20000mg/l、22000mg/l、24000mg/l、26000mg/l和30000mg/l，接种经过上述离心处理的菌体，置于35℃、170rpm的恒温培养箱中培养120h。分别取不同盐浓度条件下培养的菌液，采用12000r/min离心10min后，分别取上清液10ml，参照全盐测定方法重量法测定全盐含量。

(3)当全盐浓度为15000-30000mg/l条件下，黄河盐单胞菌菌株120h内可降解30-50％的全盐，随着全盐浓度的增大，其降解率逐渐减小，如图2所示。

实施例3液体和固体菌剂的制备方法一

利用本申请所提供的黄河盐单胞菌制备成液体或固体菌剂，具体的制备方法为：

(1)菌种活化：取15μl冻存的黄河盐单胞菌接种于含有100ml高盐lb液体无菌培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)的三角瓶中，置于30℃，180rpm培养箱中振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将活化的菌种100ml转接到含有1000ml高盐lb液体无菌培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)中，于30℃，180rpm培养箱中振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照10％(v/v)的接种量接种入装液量为70％的20l种子罐中扩大培养。

(4)生产罐发酵：将种子液按10％(v/v)的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到250亿/ml以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂。

(5)固体菌剂制备：发酵结束后，将发酵完成后的液体菌剂按3:1(v/v)的比例浓缩，按照质量比添加4％的硅藻土与1％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂。通过上述方法获得的微生物菌剂的含水率控制在10％。

上述过程中步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:1.5，搅拌速度为220rpm，培养温度为30℃，发酵周期为24h。

以上述步骤中，种子罐和生产罐所用的发酵培养基配方为：葡萄糖0.8％，玉米淀粉1.2％，豆粕2.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸锰0.06％，氯化钠2.0％，硫酸铵0.08％，水余量，ph7.0-7.4。

实施例4液体和固体菌剂的制备方法二

利用本申请所提供的黄河盐单胞菌制备成液体或固体菌剂，具体的制备方法为：

(1)菌种活化：取10μl冻存的黄河盐单胞菌接种于含有100ml高盐lb液体无菌培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)的三角瓶中，置于37℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；

(2)液体种子制备：将活化的菌种100ml转接到含有1000ml高盐lb液体无菌培养基(其配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl20g/l，ph7.0-7.2)中，于37℃，170rpm培养箱中振荡培养至对数期；

(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％(v/v)的接种量接种入装液量为70％的20l种子罐中扩大培养。

(4)生产罐发酵：将种子液按8％(v/v)的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到300亿/ml以上，将发酵完成后培养液出罐即得液体菌剂。

(5)固体菌剂制备：发酵结束后，将发酵完成后的液体菌剂按3:1(v/v)的比例浓缩，按照质量比添加8％的硅藻土与2％的麸皮吸附菌体，之后离心、干化处理获得固体菌剂。通过上述方法获得的微生物菌剂的含水率控制在10％以下。

上述过程中步骤(3)种子罐发酵和步骤(4)生产罐发酵的培养条件为：无菌空气的通气比均为1:1.2，搅拌速度为200rpm，培养温度为37℃，发酵周期为20h。

上述步骤中，种子罐和生产罐所用的发酵培养基配方为：葡萄糖1.0％，玉米淀粉1.0％，豆粕2.0％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸锰0.04％，氯化钠1.5％，硫酸铵0.1％，水余量，ph7.0-7.4。

实施例5该黄河盐单胞菌液体菌剂处理某农化高盐废水

取某农化行业高盐污水作为试样，废水中的盐浓度为30000mg/l，cod8000mg/l。将废水分成9份，每份废水为1l，分别设空白对照组、实验组，空白对照组不接菌剂，实验组分别添加实施例3和4制备的液体菌剂，以5％的接种量(v/v)分别接入到各组废水中，每组设三个平行，于37℃，160rpm培养120h，取水样离心获得上清液，参照化学需氧量的测定方法gb11914-89测定上清液中cod含量，参照全盐量的测定法重量法测定水中全盐。

测定结果为实施例3和4的液体菌剂在120h内对废水中cod降解率均达到95％，而空白对照组均未降解。实施例3和4的液体菌剂在120h内对废水中全盐的降解率均达到35％，而空白对照组未降解。

实施例6该黄河盐单胞菌固体菌剂处理某泡菜厂高盐废水

取某泡菜厂高盐废水作为试样，废水中的盐浓度为20000mg/l，cod为50000mg/l。将废水分成12份，每份废水为1l，分别设空白对照组、实验组，空白对照组不接菌剂，实验组添加实施例4制备的固体菌剂，分别按照0.1‰、0.5‰、1‰的质量体积比接种于接入到废水中，每组设三个平行，于室温曝气培养96h，溶解氧控制在2.0-4.0mg/l，取水样离心获得上清液检测cod和全盐浓度，cod测定方法为gb11914-89，全盐量的测定法为重量法。

测定结果为按照0.1‰、0.5‰、1‰的质量体积比添加实施例4制备的固体菌剂在96h内对废水中cod降解率均达到90％，而空白对照组未降解。按照0.1‰、0.5‰、1‰的质量体积比添加实施例4制备的固体菌剂在96h内对废水中全盐降解率均达到45％，而空白对照组未降解。

实施例7该黄河盐单胞菌固体菌剂应用于石化行业污水处理厂高盐废水

某石化污水处理厂污水中全盐含量为150000mg/l，cod18251mg/l，将实施例4制备的固体菌剂按照0.5‰的质量体积比加入生化好氧池中进行效果验证，菌剂在使用时提前进行活化，按照固体菌剂1～5g/l的质量体积比接种于营养盐溶液中，活化条件为溶解氧2.0-4.0mg/l，ph7.0-7.5，温度28-37℃，曝气4-6h进行活化，活化方法为：

将固体菌剂接种于营养盐溶液中进行活化，其中营养盐溶液组成如下：kh2po40.09g/l、k2hpo40.22g/l、nah2po40.26g/l、mgso4·7h2o0.23g/l、cacl20.28g/l、fecl30.003g/l，nacl150g/l，采用软化水进行溶解活化。

该好氧生化池ph控制在6.5-8.0，温度30-37℃，溶解氧控制在2.0-4.0mg/l。

跟踪检测好氧生化池出水口cod含量，初始cod为18251mg/l，投入菌剂120h后cod降解率达到85.21％，出水cod为2699.3mg/l，与物化法相比节约了成本，无二次污染。

序列表

<110>黄河三角洲京博化工研究院有限公司

<120>一株高效降解高盐废水中有机物和全盐的黄河盐单胞菌及其应用

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