一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法及其应用与流程

本发明涉及小麦育种及应用
技术领域：
，尤其涉及一种小麦kasp功能基因指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术：
：小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一，现已成为世界三大主要粮食作物之一。全世界43个国家，有35％-40％的人口以小麦为主要粮食。小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素b，是一种营养丰富、经济价值较高的商品粮。因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。品种鉴定对于品种权保护和产权纠纷具有重要作用，随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。分子标记技术具有周期短、不受环境条件影响、可进行高通量测试分析等优点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用。但是，传统aflp、ssr等指纹图谱存在标记数量有限、检测位点少、位点突变率高等缺点。而目前的小麦指纹图谱均是基于ssr标记构建，ssr标记是随机扩增，找到多态性位点，并没有明确的目的性，更没有针对目标基因内部进行精确的评价，不能满足现在的育种需求。为了弥补ssr分子标记的不足，基于基因开发的功能标记应运而生。功能标记来源于控制表型的基因序列内部，在鉴别基因序列的表型功能后，挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应，从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的dna标记，即功能标记。功能标记(functionalmarker)是依据基因序列的多态性开发的，这些基因的不同等位变异与表型直接相关。本发明基于功能标记对小麦品种构建指纹图谱。技术实现要素：为了克服ssr标记并无针对基因构建图谱的不足，本发明的目的之一在于提供一种小麦kasp功能基因指纹图谱的构建方法，运用小麦中被鉴定的控制重要农艺性状的kasp功能标记，构建了首个功能基因的指纹图谱，弥补了只针对单个性状或者基因对小麦鉴定的片面性，为今后育种家对小麦资源的评价和利用提供了科学的理论支撑。本发明的目的之二在于提供一种小麦kasp功能基因指纹图谱。本发明的目的之三在于提供一种小麦kasp功能基因指纹图谱的应用。本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种小麦kasp功能基因指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取供试小麦品种的dna；(2)对上述步骤(1)提取的dna进行pcr扩增，所用引物包括18对kasp荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表seqidno.1-36所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表seqidno.37-54所示；(3)基于扩增过程中产物的荧光信号强弱，对目标产物进行分型检测。进一步地，所述小麦kasp功能基因包括小麦适应性相关基因：控制株高的基因rht-b1和rht-d1，影响小麦春化的基因vrn-a1、vrn-b1和vrn-d1，影响小麦开花的光周期基因ppd-d1；小麦抗性相关基因：抗穗发芽的基因4个，分别是phs1、sdr-b1、vp-1b和mft-a1，抗干旱的基因为1-fehw3和dreb-b1；抗叶锈的基因lr14a、lr34和lr68；抗条锈的基因yr15、抗赤霉病的基因fhb1以及1bl/1rs易位系。为选育适应性强的高产品种，育种家对作物不断的改良选择，以“绿色革命”为代表的矮杆小麦推动了20世纪40年代之后产量的极大提升；而春化和开花是小麦生命周期中两个重要的生长阶段，对这两个性状的改良使得小麦的适应性不断增强。本发明中所涉及的正是这三个性状，其中控制株高的基因为rht-b1和rht-d1；影响小麦春化的基因为vrn-a1、vrn-b1和vrn-d1；影响小麦开花的基因为光周期基因ppd-d1。生物胁迫和非生物胁迫是影响作物稳产的主要因素。随着全球气候变化以及病原菌快速变异，育种家对抗性性状及相关基因的选择从未停止。本发明涉及到的表型性状包括穗发芽、抗旱、抗赤霉病、抗叶锈病、抗条锈病，其中抗穗发芽的基因4个，分别是phs1、sdr-b1、vp-1b和mft-a1；抗干旱的基因为1-fehw3和dreb-b1；抗叶锈的基因lr14a、lr34和lr68；抗条锈的基因yr15、抗赤霉病的基因fhb1以及1bl/1rs易位系。进一步地，上述步骤(1)中dna的提取过程如下：a：配置ctab缓冲液，放入65℃水浴锅中预热；b：取适量小麦组织经液氮冷却后打碎，加入上述步骤a中预热后的ctab缓冲液，混合均匀后水浴加热；c：将上述步骤b的混合物冷却至室温，加入氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心，取上清液，加入rnasea，混匀，室温放置一段时间；d：向上述步骤c的混合物中加入预冷的异丙醇，混合均匀后，静置沉淀，离心后取沉淀加入乙醇溶液洗涤，干燥后即得待测的dna样品。进一步地，上述步骤a中ctab缓冲液的配置过程如下：每升ctab缓冲液加入20gctab，200mlph＝8.0的1.0mtris-hcl缓冲液，81gnacl，40ml0.5medta，10g1％pvp。进一步地，上述步骤c中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；上述步骤d中加入0.7倍混合物体积在-20℃预冷的异丙醇。进一步地，pcr扩增反应体系包括：浓度为40ng/μl待测dna样品2.2μl，kasplowmixture2.5μl，mg2+0.04μl，引物溶液0.056μl，ddh2o0.204μl；kasp扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存。进一步地，上述步骤(2)中pcr扩增中引物溶液的组成为：在体积为100μl的溶液中包括浓度为100μm的两条正向引物各12μl，通用反向引物30μl，ddh2o46μl。进一步地，上述步骤(3)中待pcr反应完成后，收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测，同一位点不同等位变异呈现不同颜色，相同等位变异类型的材料以相同颜色的点通过二维聚类图展示，统计小麦品种在18个基因位点的等位变异情况，计算位点的遗传多样性；进一步将每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，构建小麦的指纹图谱。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种小麦kasp功能基因指纹图谱，由上述方法构建得到。本发明的目的之二采用如下技术方案实现：上述小麦kasp功能基因指纹图谱在小麦品种鉴定方面的应用。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的小麦kasp功能基因指纹图谱的构建方法中，包括18对小麦基因组kasp标记组成的功能组合，利用pcr扩增技术、kasp基因分型技术对小麦品种进行鉴定，可在短时间内完成小麦资源功能基因品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高通量、快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点；与传统基于ssr标记构建的指纹图谱相比，本发明是基于控制小麦中适应性性状和抗性性状的重要功能基因开发的标记，对小麦品种进行功能基因指纹图谱构建。使用这些标记即可明确材料中是否携带重要的基因，可快速运用于育种实践中，具有很高的应用价值。本发明的方法可以对小麦资源所携带的功能基因进行有效甄别，从dna水平揭示品种的优异基因，为小麦品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。附图说明图1为采用本发明方法得到的50种小麦的功能基因指纹图谱。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。实施例1为了构建我国具有代表性的功能基因指纹图谱，本发明选取了我国自新中国成立以来育成的50份小麦种质资源，这些材料分布于我国十个小麦生态区，在不同育种年代都有广泛的代表性。基于这些材料构建其在18个关键基因位点上的指纹图谱，50份代表性小麦品种见表1，所述小麦kasp功能基因和对应的表型如表2所示。表1表2(1)小麦基因dna提取：采用ctab法提取小麦叶片组织基因组dna，步骤如下：a：每升ctab缓冲液的配制：表3成分用量ctab20g1.0mtris-hcl缓冲液(ph＝8.0)200mlnacl81g0.5medta40ml1％pvp10g将配置好的ctab缓冲液放入65℃水浴锅中提前预热；b：将适量小麦叶片组织置于2.0ml离心管中，加入小钢珠，经液氮冷却后迅速用磨样机打碎；c：加入预热的2xctab缓冲液800μl，待充分混匀后，置于65℃水浴锅30min以上，水浴期间每隔几分钟颠倒混匀；d：待水浴结束后冷却至室温，加入800μl的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀数次至无明显的分层，4℃12000rpm离心5-10min；e：小心吸取上清液于1.5ml离心管中，加入5μlrnasea，混匀，37℃放置至少15min；f：加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀，静置30-60min充分沉淀dna；4℃下12000rpm离心5min；g：弃上清或挑出dna沉淀，加入800μl70％乙醇，上下颠倒洗涤，12000rpm离心2min，倒掉上清液,重复洗涤2次,放于室温或者通风厨晾干，无酒精味；h：加入100μl1xte(ph＝8.0)溶解dna,1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna，测浓度，并将dna稀释至40ng/μl。剩余的dna样品-20℃保存以待备用。(2)对上述步骤(1)提取的dna进行pcr扩增，所用引物包括18对kasp荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表seqidno.1-36所示，其中标签序列为fam(5’aaggtgaccaaagttcatgct3’)和hex(5’aaggtcggagtcaacggatt3’)，一条通用的反向引物，其序列如序列表seqidno.37-54所示，以保证扩增总长度<120bp，详见表4，扩增过程如下：在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μl。混合反应体系配制过程为：包括浓度为40ng/μl待测dna样品2.2μl，kasplowmixture2.5μl，mg2+0.04μl，引物溶液0.056μl，ddh2o0.204μl；引物溶液的组成为：在体积为100μl的溶液中包括浓度为100μm的两条正向引物各12μl，通用反向引物30μl，ddh2o46μl。kasp扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存；(3)待反应完成后，利用quantstudiotm7flex荧光定量仪(appliedbiosystemsbylifetechnologies)收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；通过quantstudiotmreal-timepcrsoftwarev1.3(appliedbiosystemsbylifetechnologies)实现数据的可视化及结果判读。全部鉴定材料在每个基因的变异类型通过二维聚类图展示，以阴性对照(ddh2o)为判定基点，不同材料根据其携带的等位变异类型将以不同颜色的点呈现在相应坐标上，统计上述50个小麦品种上述18个基因位点的遗传多样性。结果如表5所示，所有基因位点的遗传多样性变异范围为0.1～0.5之间，按照其控制的农艺性状分类，将其分为两大类，分别为：逆境胁迫响应基因位点的平均多样性为0.33，适应性基因位点的平均多样性为0.4，综合考虑这两类基因的遗传多样性为0.53。在上述18个基因位点的基础上，构建了50份小麦的指纹图谱，其中每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，结果如表5和图1所示。表4表5本发明提供的小麦kasp功能基因指纹图谱的构建方法中，包括18对小麦基因组kasp标记组成的功能组合，利用pcr扩增技术、kasp基因分型技术对小麦品种进行鉴定，可在短时间内完成小麦资源功能基因品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高通量、快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点；与传统基于ssr标记构建的指纹图谱相比，本发明是基于控制小麦中适应性性状和抗性性状的一些重要功能基因开发的标记对小麦品种进行功能基因指纹图谱构建，使用这些标记即可明确材料中是否携带重要的基因，可快速运用于育种实践中，具有很高的应用价值。本发明的方法可以对小麦资源所携带的功能基因进行有效甄别，从dna水平揭示品种的优异基因，为小麦品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。序列表<110>遵义医科大学<120>一种小麦kasp功能基因指纹图谱及其构建方法和应用<160>54<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gaaggtgaccaagttcatgctcccatggccatctccagctg41<210>2<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaaggtcggagtcaacggattcccatggccatctccagcta41<210>3<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaaggtgaccaagttcatgctcatggccatctcgagctgctc42<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gaaggtcggagtcaacggattcatggccatctcgagctgcta42<210>5<211>53<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gaaggtgaccaagttcatgctagagttttccaaaaagatagatcaatgtaaat53<210>6<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gaaggtcggagtcaacggattgagttttccaaaaagatagatcaatgtaaac52<210>7<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaaggtgaccaagttcatgctggcagctaatgtggggtagtca43<210>8<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gaaggtcggagtcaacggattggcagctaatgtggggtagtct43<210>9<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaaggtgaccaagttcatgctatcattcgaattgctagctccgg44<210>10<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gaaggtcggagtcaacggattatcattcgaattgctagctccgc44<210>11<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaaggtgaccaagttcatgctcaaggaagtatgagcagcggtt43<210>12<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gaaggtcggagtcaacggattaagaggaaacatgttggggtcc43<210>13<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gaaggtgaccaagttcatgctggtggaacagatgcaactaaagg44<210>14<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gaaggtcggagtcaacggattggtggaacagatgcaactaaaga44<210>15<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gaaggtgaccaagttcatgcttcagcagacttcgactcgca41<210>16<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gaaggtcggagtcaacggatttcagcagacttcgactcgcg41<210>17<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gaaggtgaccaagttcatgctcgtgcatgcagcctacgcatacgta46<210>18<211>46<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gaaggtcggagtcaacggattcgtgcatgcagcctacgcatacgtg46<210>19<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gaaggtgaccaagttcatgctcgctcttatattagtttacggagggag48<210>20<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20gaaggtcggagtcaacggattctcattttgatagctctagctaa44<210>21<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gaaggtgaccaagttcatgctcctgcgcactttcttcttcctgt44<210>22<211>43<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22gaaggtcggagtcaacggattctgcgcactttcttcttcctgg43<210>23<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23gaaggtgaccaagttcatgctctccccccttccttctgtcc41<210>24<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gaaggtcggagtcaacggattctccccccttccttctgtct41<210>25<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gaaggtgaccaagttcatgctctacactagtactactttgagacaatttttt52<210>26<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gaaggtcggagtcaacggattacactagtactactttgagacaattttaa50<210>27<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27gaaggtgaccaagttcatgctggtatgccatttaacataatcatgaa47<210>28<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gaaggtcggagtcaacggattggtatgccatttaacataatcatgat47<210>29<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gaaggtgaccaagttcatgctcgtgtcttggacctgagcaat42<210>30<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30gaaggtcggagtcaacggattcgtgtcttggacctgagcaac42<210>31<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31gaaggtgaccaagttcatgctcagatccccggttctctcaag42<210>32<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32gaaggtcggagtcaacggattcagatccccggttctctcaaa42<210>33<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gaaggtgaccaagttcatgctttgggctcacgtcgtgcaa40<210>34<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gaaggtcggagtcaacggatttgtctgtttcgctgggatg40<210>35<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gaaggtgaccaagttcatgctggagcaggtccagatcgcg40<210>36<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36gaaggtcggagtcaacggattcggagcaggtccagatcgca41<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37tcgggtacaaggtgcgggcg20<210>38<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38cgggtacaaggtgcgcgcc19<210>39<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39gttagtagtgatggtccaataatgccaaa29<210>40<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40cacaggctttcctatcattcgt22<210>41<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gcctgaacgcctagcctgtgta22<210>42<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gcctcccactacactgggc19<210>43<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gtgagtgttatatgaaactaatgatccatt30<210>44<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44aggatctcgttggccttgacg21<210>45<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45tgatccatgcacgcatcagcgatcg25<210>46<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46cttcttccgaagtgtatcatatg23<210>47<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47tttcaccttgtgatatggattgccttgat29<210>48<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>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