本发明涉及一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法，属于多肽制备技术领域。
背景技术：
灵芝属于担子菌纲多孔菌目灵芝科，是一种珍贵的药用真菌，在古代享有“仙草”、“还魂草”的美誉。灵芝的生物活性物质十分丰富，现在已分离得到两百多种化合物。主要是多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸蛋白类、三萜类等。灵芝蛋白类是一类重要的活性物质，其具有延缓衰老、抗氧化，提高人体机能、改善内脏微循环的作用。
灵芝水溶性蛋白由于其与人体皮肤具有良好的相容性，而受到研究者们的广泛关注。低聚肽是以灵芝为原料经过水提得到水溶性蛋白，再通过双酶解所得。低聚肽一般由2到10个氨基酸组成，在人体内不需要消化可以直接吸收，具有很高的生物活性，它能促进细胞分裂，增强细胞新陈代谢，修复人体各种受损、病变细胞。其应用于化妆品中可以起到清除自由基、延缓皮肤衰老、美白、保湿等作用。随着人们对美的追求和护肤意识的不断增强，低聚肽的提取制备越来越成为了研究的热点。而现有的技术大多制备的低聚肽存在纯度低、不稳定、易分解、难保存、不易吸收等缺点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：现有技术制备的低聚肽存在纯度低、不稳定、易分解、难保存、不易吸收等问题。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将采购的灵芝子实体清洗后，烘干；
步骤2)：将干燥后的灵芝子实体置于粉碎机中粉碎，过筛，得到灵芝粉；
步骤3)：将灵芝粉加入到蒸馏水中提取，得到灵芝蛋白提取液；
步骤4)：将灵芝蛋白提取液离心，取上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白；
步骤5)：在灵芝蛋白中加入双酶进行酶解，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液；
步骤6)：将灭活液依次进行离心和膜分离，浓缩、干燥，得到灵芝蛋白低聚肽。
优选地，所述步骤1)中烘干温度为50℃。
优选地，所述步骤2)中过筛的规格为30～50目。
优选地，所述步骤3)中灵芝粉与蒸馏水的质量比为1:(10～15)；提取温度为25～35℃，ph值为6～8，提取时间为7-10h。
优选地，所述步骤5)中加入的双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
更优选地，所述木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶的质量比为2：(1～1.5)。
优选地，所述步骤5)中酶解的温度为50～60℃，时间为1.5～2.5h，ph值为6～8；灭活的温度为80～90℃，时间为15～20min。
优选地，所述步骤6)中离心的转速为4000～4500r/min，时间为10～15min。
优选地，所述步骤6)中的膜分离采用超滤；浓缩采用凝胶浓缩法；干燥采用冷冻干燥。
更优选地，所述凝胶浓缩法所采用的凝胶柱为sephadexg-25。
本发明提供的方法以灵芝子实体为原材料，通过水提获得水溶性灵芝蛋白，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶通过控制酶解的时间、温度、ph进行双酶酶解获得酶解液，通过超滤、凝胶浓缩、冷冻干燥的技术从而获得了养价值更高、更稳定、容易被人体皮肤吸收的低聚肽，实验结果表明所得低聚肽营养价值高，低聚肽的保质期一般在一年半以上。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。
本发明提供了一种灵芝水溶性蛋白酶解制备低聚肽的方法，具体步骤如下：
1)将采购的灵芝子实体清洗3到5次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将所述步骤1)的干燥灵芝子实体置于粉碎机中粉碎，过30到50目筛，得到灵芝粉；
所述粉碎机为万能粉碎机；
3)将所述步骤2)的灵芝粉称取2到3克，按一定的料液比加入蒸馏水，在一定的温度和ph下提取一定的时间，得灵芝蛋白提取液；
4)将所述步骤3)的灵芝蛋白提取液离心，取上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥得水溶性灵芝蛋白；
5)将所述步骤4)的灵芝蛋白加入双酶进行酶解，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液；
所述双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶；
6)将所述步骤5)的灭活液依次进行离心和膜分离，浓缩、干燥，得到灵芝蛋白低聚肽。
本发明将采购所得的灵芝子实体通过清洗、烘干、粉碎，得到灵芝粉。在本发明中，所述灵芝为赤芝，对于灵芝的来源没有特别的要求，一般市售的即可。本发明实施例中的灵芝购买自吉林省白山市，属长白山灵芝。本发明所用水均为去离子水。在本发明中，所述灵芝粉的目数优选为30到50目，更优选为40目。
得过目的灵芝粉后，本发明将称取2到3克灵芝粉，按优选地料液比1:10～15(质量比)加入去离子水，在提取温度为25～35℃，提取ph为6～8,的条件下提取7到10h，得到灵芝蛋白提取液；所述料液比为1:10～15(质量比)，优选为1:12。在本发明中，提取温度优选为30℃，提取ph优选为8，提取时间优选为9h。在本发明中用去离子水比用普通水减少了杂质的引入；提高了低聚肽的纯度，温度和ph条件都较为温和，蛋白质不易变形有利于提高低聚肽的产率。
得到灵芝蛋白提取液后，本发明将灵芝蛋白提取液离心，取上清液，经过滤、浓缩和冷冻干燥，得水溶性灵芝蛋白；
得水溶性灵芝蛋白后，本发明将向所述灵芝蛋白中加入双酶进行水解，将所得的酶解液进行灭活，得到灭活液；所述双酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。在本发明中采用双酶酶解提高了低聚肽得率；所述双酶质量浓度比优选为为2：1～1.5，更优选为2:1。在本发明中，优选温度为55℃时加入双酶；所述酶解时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。在本发明中所述灭酶温度优选为80～90℃，更优选为90℃；灭酶时间优选为15～20min，更优选为15min，酶解的ph优选为为6～8，更优选为8。在本发明中对木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶没有特殊限定，市售的即可。在本发明中采用双酶水解，得到低聚肽。
得到灭活液后，本发明将灭活液进行离心和膜分离，浓缩、干燥，得到灵芝蛋白低聚肽。在本发明中，所述离心的转速优选为4000～4500r/min，更优选为4500r/min；在本发明中，所述离心的时间优选为10min～15min，更优选为15min；在本发明中所述膜分离技术为超滤，其操作压强低，一般为0.1～0.5mpa，可以不考虑渗透压的影响，易于工业化，应用范围广泛；在本发明中所述浓缩技术为凝胶浓缩法，所述凝胶柱优选为sephadexg-25；在本发明中，所述干燥的方法优选为冷冻干燥法。
实施例1
1)将采购的灵芝子实体清洗3次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎，过30目筛，得到过目后的灵芝粉；
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克，按料液比1:10(质量比)加入蒸馏水20克，在温度为25℃、ph＝6的提取条件下提取7h，得到灵芝蛋白提取液；
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4000r/min的条件下离心，取上清液，经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白；
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.2加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50℃、ph为6、的条件下酶解1.5h，得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为80℃的条件下灭酶处理18min，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4200r/min的条件下离心，通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱sephadexg-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例2
1)将采购的灵芝子实体清洗3次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎，过40目筛，得到过目后的灵芝粉；
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克，按料液比1:12(质量比)加入蒸馏水24克，在温度为30℃、ph＝8的提取条件下提取9h，得到灵芝蛋白提取液；
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4500r/min的条件下离心，取上清液，经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白；
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为55℃、ph为8、的条件下酶解2h，得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为90℃的条件下灭酶处理15min，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4500r/min的条件下离心，通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱sephadexg-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例3
1)将采购的灵芝子实体清洗3次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎，过50目筛，得到过目后的灵芝粉；
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克，按料液比1:15(质量比)加入蒸馏水30克，在温度为35℃、ph＝7的提取条件下提取10h，得到灵芝蛋白提取液；
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4300r/min的条件下离心，取上清液，经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白；
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.5加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为60℃、ph为7、的条件下酶解2.5h，得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理20min，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4300r/min的条件下离心，通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱sephadexg-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例4
1)将采购的灵芝子实体清洗3次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎，过50目筛，得到过目后的灵芝粉；
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克，按料液比1:11(质量比)加入蒸馏水22克，在温度为32℃、ph＝7.5的提取条件下提取8.5h，得到灵芝蛋白提取液；
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4100r/min的条件下离心，取上清液，经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白；
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.4加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为60℃、ph为7、的条件下酶解2.5h，得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理17min，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4300r/min的条件下离心，通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱sephadexg-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
实施例5
1)将采购的灵芝子实体清洗3次，置于50℃烘箱中干燥；
2)将步骤1)中烘干后的灵芝子实体置于万能粉碎机中粉碎，过50目筛，得到过目后的灵芝粉；
3)将步骤2)中的灵芝粉称取2克，按料液比1:13(质量比)加入蒸馏水26克，在温度为32℃、ph＝6.5的提取条件下提取7.5h，得到灵芝蛋白提取液；
4)将步骤3)中所获的灵芝蛋白提取液在转速为4400r/min的条件下离心，取上清液，经过滤、吹干浓缩和冷冻干燥得到水溶性灵芝蛋白；
5)将步骤4)中所获的灵芝蛋白向里面按质量浓度2:1.3加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为56℃、ph为7、的条件下酶解2.3h，得到酶解液。
6)将步骤5)中所获的酶解液在温度为85℃的条件下灭酶处理20min，将所得酶解液进行灭活，得到灭活液。
7)将步骤6)中所获灭酶液在转速为4100r/min的条件下离心，通过超滤、凝胶浓缩(凝胶柱sephadexg-25)、冷冻干燥获得灵芝蛋白低聚肽。
分别对实施例1到5制得的低聚肽进行相对分子质量测定，具体测定方法参考gb/t22729-2008，计算相对分子质量180到1000低聚肽比例，具体结果如表1所示。
表1
从表1可见，本发明制备的低聚肽占多肽总量的40.2％～44.5％，实验结果表明，本发明通过灵芝水溶性蛋白酶解制备的低聚肽得率高、纯度较高，利于皮肤吸收，具有较高的营养价值。