本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)是机体重要的免疫细胞，作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来，nk细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受mhc限制等优点，相对于αβt细胞，γδt细胞和cik等其它用于免疫治疗的细胞nk细胞受到了更广泛的关注和临床应用。目前，国内外已经有大量的研究者进行了人nk细胞的培养和生物治疗方面的研究，但培养得到的nk细胞存在数量较少、或纯度较低、或杀伤活性低等问题，不能满足实际应用的需要。因此，如何分离制备得到高质量高纯度的nk细胞成为其临床应用中亟待解决的问题。
目前国内外对于nk细胞的培养，主要采取以下两种方法：
1、外周血或脐带血来源nk细胞先纯化再扩增，该方法是先将外周血中的nk细胞提取出来，再进行扩增培养。但是nk细胞数量较少，在外周血中仅占淋巴细胞的10％-15％，在脐带血中nk的含量更低，只有5％左右，正常人体外周血中和脐带血中nk细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。nk细胞的数量和纯度是临床疗效的重要影响因素，nk细胞数量太少不能达到治疗的效果，纯度低则会影响对肿瘤的杀伤作用。因此nk细胞培养方法仍是目前的技术瓶颈。
2、滋养层细胞（人肿瘤细胞，即人白血病k562细胞）培养方式，滋养层细胞的使用大大提高了nk细胞的生产效率。但由于在培养过程中选用的滋养层细胞为肿瘤细胞，需要增加后续纯化的步骤以及残留检测，同时也增加了临床使用的风险。。
因此，通过改进工艺，对外周血单个核细胞（pbmc）进行诱导培养，模拟体内环境，采用纯因子细胞培养方式，使用相应的细胞因子来刺激单个核细胞，向nk细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，可促进nk细胞的激活及大量增殖，获得高纯度高质量的nk细胞。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，以解决上述缺陷。
本发明提供了一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、准备阶段：用重组人纤粘连蛋白、cd16抗体包被细胞培养瓶；
s2、外周血单核细胞诱导培养：
s21、收集外周血；
s22、制备自体血浆和自体血清；
s23、将自体血浆进行分离，获得外周血单核细胞，并配置细胞悬液；
s24、接种细胞：将步骤s23配制的细胞悬液加入到步骤s1包被过的细胞培养瓶中，加入无血清细胞培养基，分别添加cd3单抗、her-2、ifn-γ及步骤s22的自体血清；
s25、将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱中培养；
s3、扩增培养：
s31、培养第4天，按（2.0~2.5）*106细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子、10%自体血清；
s32、第5~11天，每天按（2.0~2.5）*106细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子；
s33、培养14天后，收获nk细胞；
s4、采用台盼蓝染色法，用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率。
进一步地，步骤s1的包被细胞培养瓶的过程为：配制包被液：50ml离心管中加入d-pbs缓冲液20ml，加入重组人纤粘连蛋白至8-20μg/ml，加入cd16抗体至0.18-0.22μg/ml；包被：将上述配制好的包被液加入t175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被，即得。
进一步地，步骤s22~s23的过程如下：将步骤s1采集的外周血在室温下、700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；灭活后的血浆于4℃静置15min，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血清备用；添加淋巴分离液，室温下800g离心20min；离心后中间的白色雾层细胞即为外周血单核细胞（pbmc），用巴斯德吸管将白色的pbmc层吸出，加入pbs清洗，于1500rpm离心8min，弃上清；再次用pbs清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；置于培养基中重悬，混匀，取样0.5ml计数，1000rpm离心6min，弃上清；将末次洗涤时收集的细胞沉淀用无血清培养基重悬，混匀，即得。
进一步地，步骤s23中的细胞悬液的细胞密度为（1~2）*106/ml。
更进一步地，步骤s24中，无血清细胞培养基加入量为40ml，分别添加cd3单抗、her-2、ifn-γ浓度至0.9-1.4μg/ml、0.12-0.25μg/ml、0.3-1.0μg/ml，自体血清添加终浓度（重量浓度）为10%。
更进一步地，步骤s31、s32所述的细胞扩增阶段细胞因子包括il-2、il-7、il-15、il-18、il-21中的一种或多种。
更进一步地，步骤s31、s32所述的细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度分别为：il-210-14ng/ml，il-715-25ng/ml，il-1546-55ng/ml，il-1810-13ng/ml，il-212-8ng/ml。
与现有技术相比，本发明提供的一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，具有以下有益效果：
（1）本发明采用纯因子细胞培养方式，使用相应的细胞因子来刺激单个核细胞，向nk细胞方向进行诱导，并配合相应的细胞培养基，可使nk细胞大量增殖。
（2）通过本发明的细胞因子诱导培养，可获得高数量、高活率、高质量的自然杀伤性nk细胞。通过14天的体外培养，细胞增殖超过100倍，活率高达98%以上，对人白血病k562细胞的靶向杀伤率高达86.9%，可满足临床治疗的需要。
（3）本发明采用的纯因子细胞培养技术，培养过程相当于模拟体内环境，因此安全性较高。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，包括以下步骤：
s1、准备阶段：用重组人纤粘连蛋白、cd16抗体包被细胞培养瓶：50ml离心管中加入d-pbs缓冲液20ml，加入重组人纤粘连蛋白：8μg/ml-15μg/ml，cd16抗体：0.18ug/ml-0.22ug/ml；将上述配制好的包被液加入t175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被；
s2、外周血单核细胞诱导培养：
s21、收集外周血；
s22、制备自体血浆和自体血清；
s23、将自体血浆进行分离，获得外周血单核细胞，并配置细胞悬液；
s24、接种细胞：将步骤s23配制的细胞悬液加入到步骤s1包被过的细胞培养瓶中，加入无血清细胞培养基，添加cd3单抗、her-2、ifn-γ及步骤s22的自体血清；
s25、将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱中培养；
s3、扩增培养：
s31、培养第4天，按（2.0~2.5）*106细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子、10%自体血清；
s32、第5~11天，每天按（2.0~2.5）*106细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子；
s33、培养14天后，收获nk细胞；
s4、采用台盼蓝染色法，用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率。
其中，步骤s22~s23的过程如下：将步骤s1采集的外周血在室温下、700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；灭活后的血浆于4℃静置15min，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血清备用；添加淋巴分离液，室温下800g离心20min；离心后中间的白色雾层细胞即为外周血单核细胞（pbmc），用巴斯德吸管将白色的pbmc层吸出，加入pbs清洗，于1500rpm离心8min，弃上清；再次用pbs清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；置于培养基中重悬，混匀，取样0.5ml计数，1000rpm离心6min，弃上清；将末次洗涤时收集的细胞沉淀用无血清培养基重悬，混匀。
其中，步骤s23中的细胞悬液的细胞密度为（1~2）*106/ml；步骤s24中，无血清细胞培养基加入量为40ml，分别添加cd3单抗、her-2、ifn-γ浓度至0.9-1.1μg/ml、0.12-0.25μg/ml、0.3-1.0μg/ml，自体血清添加终浓度（重量浓度）为10%；步骤s31、s32所述的细胞扩增阶段细胞因子包括il-2、il-7、il-15、il-18、il-21，细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度分别为：il-212-14ng/ml，il-715-25ng/ml，il-1551-55ng/ml，il-1810-13ng/ml，il-212-6ng/ml。
实施例2、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s1中加入重组人纤粘连蛋白：10μg/ml-15μg/ml，步骤s24中，分别添加her-2、ifn-γ浓度至0.15-0.22μg/ml、0.5-1.0μg/ml，细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度分别为：il-715-22ng/ml，il-213-8ng/ml等区别之外，其余均与实施例1相同。
实施例3、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s1中加入重组人纤粘连蛋白：10μg/ml-20μg/ml，步骤s24中，分别添加her-2、ifn-γ浓度至0.12-0.20μg/ml、0.3-0.8μg/ml，步骤s31、s32细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度分别为：il-210-12ng/ml，il-718-25ng/ml，il-1546-50ng/ml，il-213-6ng/ml等区别之外，其余均与实施例1相同。
对比例1、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s1中加入cd16抗体：0.13μg/ml-0.17μg/ml之外，其余均与实施例1相同。
对比例2、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s1中加入cd16抗体：0.23μg/ml-0.27μg/ml之外，其余均与实施例1相同。
对比例3、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s24中添加cd3单抗浓度至0.6μg/ml-0.8μg/ml之外，其余均与实施例2相同。
对比例4、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s24中添加cd3单抗浓度至1.2μg/ml-1.4μg/ml之外，其余均与实施例2相同。
对比例5、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s31、s32中细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度为：il-27-9ng/ml之外，其余均与实施例3相同。
对比例6、一种高效诱导培养制备自然杀伤性nk细胞的方法，除步骤s31、s32中细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度为：il-212-14ng/ml之外，其余均与实施例3相同。
试验例一、流式细胞检测试验
人外周血提取出来的白膜层细胞，包含有淋巴细胞和单个核细胞。通过细胞因子诱导，单个核细胞可分化为自然杀伤性nk细胞，高表达cd16、cd56细胞表面分子，低表达cd3细胞表面分子。通过对实施例1-3及对比例1-6中培养14天后的细胞进行流式检测，测其细胞表面分子cd16、cd56、cd3的表达量，来判定nk细胞纯度。
表1nk细胞表面标志物cd16、cd56实验
1、上述实验组孵育30min后，每管加pbs至1.0ml，于1000rpm，室温离心6min；
2、弃上清，加pbs至1.0ml，于1400rpm，室温离心6min；
3、弃上清，对照组加400ulpbs重悬细胞，实验组加200ulpbs重悬细胞，上流式仪检测；
4、流式检测：
①先打开仪器电源，5min后打开电脑，准备好清洗液，运行cleaning程序；
②清洗完毕，先用孵育完的单染同型对照管调试电压，圈出目标细胞，收样；
③将实验管上样检测（浓度由低到高依次检测），收样，保存数据；
④全部样品检测完毕，运行cleaning程序；
⑤进行数据分析。
试验例二、mtt杀伤试验
1、取对数生长期的k562肿瘤细胞株，重悬细胞浓度为1×105/ml，5×104/ml，2.5×104/ml，每孔100μl铺于96孔平底板中，置于37℃，co2浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时待用；
2、将实施例1-3及对比例1-6中培养14天的nk细胞重悬为1×106/ml，加入前述96孔板中，使效靶比为10∶1、20∶1以及40∶1，每个浓度各设4个复孔，并设未与肿瘤细胞反应的为效应细胞空白对照组，共培养48小时后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4小时后，离心弃上清，每孔加入100μldmso，于570nm处测定吸光度数值，计算杀伤率。
3、杀伤率的公式如下：[1-(效靶细胞组od值-效应细胞od值)/靶细胞od值-空白对照组od值]×100％
试验例一、试验例二的试验结果如下：
表2细胞计数及细胞活率
表3细胞表面抗原检测
表4mtt杀伤试验
通过上述试验结果可知，本发明采用纯因子细胞培养方式，使用相应的细胞因子来刺激单个核细胞，向nk细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，可使nk细胞大量增殖。通过本发明的细胞因子诱导培养，可获得高数量、高活率、高质量的自然杀伤性nk细胞。通过14天的体外培养，细胞增殖超过100倍，活率高达98%以上，对人白血病k562细胞的靶向杀伤率高达86.9%，可满足临床治疗需要。
本行业的技术人员应该了解，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。