聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及聚乙二醇修饰蛋白质类化合物，特别是涉及一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体、制备方法及聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。

背景技术：

谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)是生物体内一类非常重要的抗氧化酶系，属于大分子蛋白质类，在清除因物理或者化学因素造成的体内异常增多的自由基方面发挥着不可替代的作用。谷胱甘肽过氧化物酶gpx4是一种以单体形式存在的含硒蛋白，催化活性中心为硒代半胱氨酸。作为gpx家族的一员，谷胱甘肽过氧化物酶gpx4通过作用于磷脂氢过氧化物，能够减少复杂的脂质氢过氧化物与膜的结合，在维持脂质膜结构稳定中至关重要。天然谷胱甘肽过氧化物酶gpx4的来源有限，性质不稳定，为了解决这个问题，中国专利201410159032.6公开了新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶gpx突变体及其制备方法，该制备方法通过基因突变或者合成手段，最后获得了产量高、稳定性强且酶活力高的重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体，较强的抗氧化活性使其在制备抗氧化药物、化妆品及保健品方面具有广阔的应用前景。但是重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在生物体内容易经肾清除而造成体内循环半衰期较短，从而减弱抗氧化效果，为解决上述问题，使得重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体可以得到更好的应用，我们需要对重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体进行修饰或者改造，以达到降低肾清除率，提高生物稳定性并尽可能保持生物活性的目的。

中国专利201110122788.x公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法，该制备方法以猪谷胱甘肽过氧化物酶作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，对该酶进行共价偶联。以直链单甲氧基聚乙二醇上游离的氯原子和该酶的氨基进行反应，氨基修饰率控制在40～45％，酶活力保持较高，但是修饰率不高。中国专利201810823075.8公开了一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体的制备方法，该方法以重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体作为待修饰蛋白，以分子量为5kd的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂进行共价偶联，得到以稳定酰胺键存在的聚乙二醇化重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体，但是该方法制备得到的是多修饰产物和单修饰产物的混合物质。目前还没有专利公布关于重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的聚乙二醇修饰工艺。在此背景下，通过聚乙二醇单修饰提高重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的稳定性及延长重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在体内的循环半衰期的研究具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的主要是重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体因在体内的稳定性差、肾清除率高而导致的循环半衰期短，从而无法在体内充分发挥作用的问题。

为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体。

本发明的第二个目的是提供上述聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述聚乙二醇单修饰前后的该重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。

本发明可以通过常规技术(如乳化、冻干等)将聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体与可药用载体或辅料制备药物组合物、化妆品或保健品，可采用多种制剂形式，可以是液体制剂、注射剂、颗粒剂、片剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂等。

本发明所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体，以重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体(简写为：gpx4m)作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mpeg-ss)作为修饰剂(购自北京健凯科技有限公司)，通过共价偶联得到聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体(简写为：mpeg-gpx4m)，其结构式为：

其中，gpx4m表示重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体，该重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的制备参见中国专利201410159032.6公布的方法。mpeg表示单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯中的单甲氧基聚乙二醇部分。

本发明还公开了上述聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的制备方法。修饰剂为活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mpeg-ss)，共价偶联反应为待修饰蛋白的氨基和修饰剂进行共价偶联，得到稳定的酰胺键。修饰反应的反应式为：

进一步的，共价偶联反应具体步骤是加入摩尔量为gpx4m1～50倍的活化的直链mpeg-ss，混匀，在4～50℃、ph6.0～9.0条件下进行10～60min的共价偶联反应，然后加入适量甘氨酸作为终止剂终止反应。由于gpx4m长时间处于较高温度和较高ph时不稳定，容易降解，而且活化的直链mpeg-ss在不同ph条件和时间时水解程度不同，因此，上述反应需要控制反应温度、反应时间和反应缓冲液ph。

进一步的，所述活化的直链mpeg-ss的平均分子量为2～30kd。

进一步的，所述活化的直链mpeg-ss的平均分子量为5～20kd。

进一步的，所述活化的直链mpeg-ss的摩尔量是gpx4m的1～30倍。

进一步的，所述活化的直链mpeg-ss的摩尔量是gpx4m的5～20倍。

进一步的，所述共价偶联反应在4～20℃，ph7.5～9.0条件下进行。

进一步的，所述共价偶联反应的时间为10～30min。

进一步的，所述终止剂甘氨酸与活化的直链mpeg-ss的摩尔比为1：1。

进一步的，最佳的反应是加入摩尔量为gpx4m20倍的活化的直链mpeg-ss(分子量为20kd)，混匀，置于4℃、ph8.5条件下反应20min进行共价偶联反应。然后加入与活化的直链mpeg-ss摩尔比1：1的甘氨酸终止反应，得到的是包含有活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体和聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的混合液。

进一步的，将上述共价偶联反应所得混合液用凝胶色谱分离纯化，所使用的凝胶为本领域所公知的sephacryls-100hr凝胶，按照说明书处理sephacryls-100hr凝胶并填装色谱柱，使用ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)平衡色谱柱内的sephacryls-100hr凝胶，将体积为色谱柱柱内凝胶体积1％的上述共价偶联反应所得混合液加入已平衡的含sephacryls-100hr凝胶的色谱柱内，当反应液刚好完全进入凝胶床面时再用1ml、ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)洗柱内壁一次，待上述缓冲液进入凝胶床面后，用ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)充满色谱柱内凝胶床面上端空间，拧紧层析柱上口，打开恒流泵，开始洗脱。出水口连接核酸蛋白检测仪，色谱工作站监测核酸蛋白检测仪在280nm的紫外吸收。收集含有目标产物mpeg-gpx4m的洗脱峰并进行透析除盐，透析袋的截留分子量为14kd，透析液为ph7.4的10mmol/l磷酸缓冲液，透析除去小分子氯化钠，将目标产物保留在透析袋内。然后将目标产物冻干，即得mpeg-gpx4m。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)同时结合考蓝染色和碘染色两种染色方式鉴定目标产物。

进一步的，所述gpx4m经修饰后所得产物mpeg-gpx4m的分子量明显增大，稳定性显著增强，免疫原性显著降低。具体见本发明实施例2～3，见图5～8。

进一步的，在mpeg-gpx4m对hsf细胞抗氧化活性评价试验中，mpeg-gpx4m和gpx4m相比较，前者的抗氧化能力强于后者，这为聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在化妆品领域的应用提供了试验依据，具体见实施例4，见图9和表1。mpeg-gpx4m和gpx4m两者都具有较好的抗氧化能力，前者在体外的抗氧化能力和后者基本一致，在体内的抗氧化能力前者明显强于后者，具体见本发明实施例5～7，见图10～15和表2～3。聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在体内的循环半衰期明显延长，血药浓度增加，具体见本发明实施例8，见图16和表4。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明首次通过聚乙二醇单修饰的方式对重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体进行化学修饰，得到了稳定性增强的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体。

(2)本发明的制备方法简单、操作性强、反应条件温和且产物单一，不会产生副产物，利于目标产物的分离纯化。

(3)本发明以活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯与重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体进行共价偶联，因空间位阻的影响和聚乙二醇在蛋白质表面的覆盖，使得修饰产物聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的免疫原性和对蛋白酶的敏感性与重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体相比明显降低。

(4)本发明制备的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体和重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体相比较，前者的ph稳定性和热稳定性明显增强。

(5)本发明制备的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的分子量约为重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的2倍，这有利于降低肾清除率，延长体内循环半衰期。修饰后表现出的较长半衰期、增强的药效以及较强的抗氧化活性极大地拓宽了重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的应用范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优势更加清楚，下面将结合本发明实施例和附图对本发明的具体技术方案进行清晰、详尽的阐述。显然，本发明所详述的实施例是本发明的一部分实施例，其他实施例可以在所述实施例的基础上进行适当修改。在没有进行创造性劳动的前提下，基于本发明的实施例进行的操作和任何改进均属于本发明的保护范围之内，这一点本领域的技术人员应该明了。

附图说明

图1：gpx4m的制备结果sds-page电泳考蓝染色图；

其中m是蛋白分子量marker；1是gpx4m。

图2：gpx4m的制备结果westernblot图；

其中m是蛋白分子量marker；1是gpx4m。

图3：mpeg-gpx4m的制备结果sds-page电泳考蓝染色图；

其中m是蛋白分子量marker；1是活化的直链mpeg-ss的摩尔量是gpx4m20倍的修饰结果；2是gpx4m；3是纯化的mpeg-gpx4m。

图4：mpeg-gpx4m的制备结果sds-page电泳碘染色图；

其中m是蛋白分子量marker；1是活化的直链mpeg-ss的摩尔量是gpx4m20倍的修饰结果；2是gpx4m；3是纯化的mpeg-gpx4m。由于碘染色是针对含有聚乙二醇结构的物质特异性染色，对于不含聚乙二醇结构的蛋白分子量marker和gpx4m在碘染色时不被染色，故显示没有颜色的空白区域。

图5：mpeg-gpx4m和gpx4m的免疫原性比较图；

图6：mpeg-gpx4m和gpx4m的热稳定性比较图；

图7：mpeg-gpx4m和gpx4m的ph耐受性比较图；

图8：mpeg-gpx4m和gpx4m对蛋白酶敏感性比较图；

图9：mpeg-gpx4m和gpx4m对过氧化氢引起hsf细胞损伤的细胞存活率比较图；

图10：mpeg-gpx4m和gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞损伤的细胞存活率比较图；

图11：mpeg-gpx4m和gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞损伤的细胞存活率比较图；

图12：mpeg-gpx4m和gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞损伤的细胞内乳酸脱氢酶含量比较图；

图13：mpeg-gpx4m和gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞损伤的细胞内乳酸脱氢酶含量比较图；

图14：mpeg-gpx4m和gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞损伤的细胞内丙二醛含量比较图；

图15：mpeg-gpx4m和gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞损伤的细胞内丙二醛含量比较图；

图16：mpeg-gpx4m和gpx4m在心肌损伤大鼠体内的药代动力学曲线；

表1mpeg-gpx4m和gpx4m对过氧化氢引起hsf细胞损伤的细胞内ros含量及sod活性的影响数据

注：##，与空白对照组相比，p＜0.01；与模型组相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01。

表2mpeg-gpx4m和gpx4m对老龄大鼠肝脏sod、cat活性及mda含量的影响数据

注：##，与空白对照组相比，p＜0.01；与模型组相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01。

表3mpeg-gpx4m和gpx4m对心肌损伤大鼠血清sod、cat活力及mda含量的影响数据

注：##，与空白对照组相比，p＜0.01；与模型组相比，*，p＜0.05，**，p＜0.01。

表4mpeg-gpx4m和gpx4m的药代动力学参数

注：t1/2代表药物的半衰期；cmax代表最大血药浓度；auc代表药时曲线下面积；cl代表肾清除速率。

具体实施方式

实施例1：聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的制备

参见中国专利201410159032.6公布的方法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和蛋白印迹(westernblot)鉴定gpx4m靶蛋白。

加入摩尔量为gpx4m20倍的活化的直链mpeg-ss(分子量为20kd)，混匀，置于4℃、ph8.5条件下共价偶联反应20min。然后加入与活化的直链mpeg-ss摩尔比1：1的甘氨酸终止反应。得到的是包含活化的直链mpeg-ss、gpx4m、mpeg-gpx4m的混合液。再将上述共价偶联反应所得混合液用凝胶色谱分离纯化，所使用的凝胶为本领域所公知的sephacryls-100hr凝胶，按照说明书处理sephacryls-100hr凝胶并填装色谱柱，使用ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)平衡sephacryls-100hr凝胶，将体积为色谱柱柱内sephacryls-100hr凝胶体积1％的上述共价偶联反应所得混合液加入已平衡的含sephacryls-100hr凝胶的色谱柱内，当反应液刚好完全进入凝胶床面时再用1ml、ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)洗柱内壁一次，待缓冲液进入凝胶床面后，用ph7.4的20mmol/l磷酸缓冲液(含0.15mol/l氯化钠)充满色谱柱内凝胶床面上端空间，拧紧层析柱上口，打开恒流泵，开始洗脱。出水口连接核酸蛋白检测仪，色谱工作站监测核酸蛋白检测仪在280nm的紫外吸收。收集含有目标产物mpeg-gpx4m的洗脱峰并进行透析除盐，选用ph7.4的10mmol/l磷酸缓冲液进行透析，透析袋截留分子量为14kd，将上述含有目标产物的洗脱液装入透析袋中透析除去小分子氯化钠，透析两次，每次使用500ml透析液，最后将目标产物保留在透析袋内。然后将目标产物冻干，即得mpeg-gpx4m。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)同时结合考蓝染色和碘染色两种染色方法鉴定目标产物。

由图1和2看出，通过中国专利201410159032.6公布的方法成功制备重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体。

由图3看出，修饰反应得到了预期目标产物mpeg-gpx4m，分离纯化得到目标产物mpeg-gpx4m的纯品。

由图4看出，mpeg-ss成功地和gpx4m进行了共价偶联反应。由于碘染色是只针对含有聚乙二醇结构的物质进行特异性染色，故不含有聚乙二醇结构的gpx4m和蛋白分子量maeker在碘染色时不显示颜色。

实施例2：聚乙二醇单修饰前后重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的免疫原性比较

利用ph7.4的50mmol/l磷酸缓冲液分别将gpx4m和mpeg-gpx4m样品的浓度调整为200μg/ml(按gpx4m蛋白含量计)，经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。选用balb/c小鼠，体重约20g，共10只，经过3天适应性饲养之后，将小鼠随机分为2组，每组5只，分别对应gpx4m样品组和mpeg-gpx4m样品组。采用皮下多点注射给药，每只小鼠每次注射样品400μl(相当于80μg蛋白)，在第0天进行初次免疫，之后在第3天，10天和18天分别进行加强免疫；在初次免疫后的第20天，对小鼠进行摘眼球取血，离心获取小鼠的血清。利用elisa法测定小鼠血清样品中抗gpx4m的igg滴度。

由图5看出，与gpx4m相比，mpeg-gpx4m的吸光度值明显下降，说明聚乙二醇修饰使得gpx4m的免疫原性明显降低，在临床应用中可以有助于减少免疫反应的发生。

实施例3：聚乙二醇单修饰前后重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的酶学性质

(1)聚乙二醇单修饰前后重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的热稳定性比较

反应在37℃下进行，反应体系包括50mmol/l磷酸缓冲液(pbs，ph7.4)、1mmol/l乙二胺四乙酸(edta)、1mmol/l还原型谷胱甘肽(gsh)、0.25mmol/l还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、1单位谷胱甘肽还原酶以及终浓度为2μmol/l的待测样品(gpx4m样品和mpeg-gpx4m样品)。将上述物质均匀混合之后分别预孵育5、10、30、60、90、120min，然后加入过氧化氢(终浓度为0.5mmol/l)启动反应。在波长340nm下记录nadph吸光度值的变化。37℃下，每分钟转化1μmolnadph的酶量定义为一个酶活力单位。将最高酶活力定义为100％，其他酶活力均转换为相对值。

由图6看出，在37℃下，预孵育120min后，gpx4m的相对酶活力为24.97％，mpeg-gpx4m的相对酶活力为37.95％。与gpx4m相比，mpeg-gpx4m的热稳定性显著提高。

(2)聚乙二醇单修饰前后重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的ph耐受性比较

反应在37℃下进行，反应体系包括50mmol/l磷酸缓冲液(pbs)、1mmol/l乙二胺四乙酸(edta)、1mmol/l还原型谷胱甘肽(gsh)、0.25mmol/l还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、1单位谷胱甘肽还原酶以及终浓度为2μmol/l的待测样品(gpx4m样品和mpeg-gpx4m样品)。pbs的ph分别为4.5、5.8、6.5、7.4、8.0、9.0、10.3、11.2、12.0。将上述物质均匀混合之后预孵育5min，然后加入过氧化氢(终浓度为0.5mmol/l)启动反应。在波长340nm下记录nadph吸光度值的变化。37℃下，每分钟转化1μmolnadph的酶量定义为一个酶活力单位。将最高酶活力定义为100％，其他酶活力均转换为相对值。

由图7看出，在ph4.5时，gpx4m的相对酶活力为16.52％，mpeg-gpx4m的相对酶活力为28.15％。在ph12.0时，gpx4m的相对酶活力为0.71％，mpeg-gpx4m的相对酶活力为8.74％。与gpx4m相比，mpeg-gpx4m的ph耐受性显著提高。

(3)聚乙二醇单修饰前后重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体的蛋白酶敏感性比较

利用50mmol/lpbs(ph7.4)分别将gpx4m和mpeg-gpx4m的浓度调整为0.5mg/ml，向gpx4m样品中加入与gpx4m质量比为20：1的胰蛋白酶，向mpeg-gpx4m样品中加入与mpeg-gpx4m质量比为20：1的胰蛋白酶，混合均匀，37℃水浴中孵育，分别测定0、10、30、60、90、120、180min的酶活力。酶活力测定按照实施例3中(1)所示方法。

由图8看出，与gpx4m相比，mpeg-gpx4m的活性在相同时间内高于gpx4m的活性，说明经聚乙二醇修饰后的gpx4m的蛋白敏感性显著降低，在体内不易被蛋白酶水解而导致失去活性。

实施例4：mpeg-gpx4m对hsf细胞的抗氧化活性评价

(1)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hsf细胞氧化应激损伤的细胞存活率的影响

将hsf细胞(原代人皮肤成纤维细胞)经培养后接种到含有10％胎牛血清(体积分数)的高糖dmem培养基的96孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2(体积分数)培养箱中继续培养至细胞密度约80％左右时，将细胞进行分组，分为空白对照组、过氧化氢模型组、gpx4m高剂量组、gpx4m中剂量组、gpx4m低剂量组和mpeg-gpx4m高剂量组、mpeg-gpx4m中剂量组、mpeg-gpx4m低剂量组。在空白对照组中加入高糖dmem培养基，其余七组分别加入等体积高糖dmem培养基和终浓度为150μmol/l的过氧化氢培养24h，然后在gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的gpx4m，mpeg-gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h。培养结束后移去上清液，每孔加入150μl的dmso置于酶标仪中震荡混匀使底部沉淀充分溶解，终止反应。然后使用酶标仪在550nm处测定各孔吸光度值，比较各组细胞存活率。

由图9看出，和模型组相比，gpx4m组和mpeg-gpx4m组给予相应物质后均比模型组的细胞存活率高，但是低于空白对照组的100％的细胞存活率，对hsf细胞给予gpx4m和mpeg-gpx4m后的细胞存活率与剂量呈现正相关，即随着gpx4m和mpeg-gpx4m剂量的增加，细胞存活率增大。比较给予同剂量gpx4m和mpeg-gpx4m后的细胞存活率，发现后者的细胞存活率明显高于前者，说明mpeg-gpx4m具有更强的抗氧化能力，对成纤维细胞可以起到很好的抗氧化作用，这为聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在化妆品行业的应用提供了有利的试验支持。

(2)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hsf细胞损伤的细胞内活性氧簇含量影响

将hsf细胞经培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约80％左右时，将细胞进行分组，分为空白对照组、过氧化氢模型组、gpx4m高剂量组、gpx4m中剂量组、gpx4m低剂量组和mpeg-gpx4m高剂量组、mpeg-gpx4m中剂量组、mpeg-gpx4m低剂量组。在空白对照组中加入高糖dmem培养基，其余七组分别加入等体积高糖dmem培养基和终浓度为150μmol/l的过氧化氢培养24h，然后在gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的gpx4m，mpeg-gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。培养结束后利用活性氧簇(ros)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内ros含量测定。

由表1可知，过氧化氢处理之后原代人成纤维细胞的敏感性较高，细胞内ros的含量明显升高，但加入gpx4m和mpeg-gpx4m后细胞内ros数值和模型组相比升高不明显，ros数值和空白对照组ros数值较为接近，且细胞内ros水平与剂量呈现负相关，即随着gpx4m和mpeg-gpx4m给予剂量的增加，细胞内ros水平降低。说明gpx4m和mpeg-gpx4m均可以有效地降低氧化损伤细胞内ros水平，具有较好的抗氧化活性。比较同剂量gpx4m组和mpeg-gpx4m组的ros数值发现，mpeg-gpx4m组的ros数值小于gpx4m组，说明mpeg-gpx4m的抗氧化活性优于gpx4m。表1为聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在抗氧化化妆品领域的研究提供了数据支持。

(3)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hsf细胞损伤的细胞内超氧化物歧化酶活性的影响

将hsf细胞经培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约80％左右时，将细胞进行分组，分为空白对照组、过氧化氢模型组、gpx4m高剂量组、gpx4m中剂量组、gpx4m低剂量组和mpeg-gpx4m高剂量组、mpeg-gpx4m中剂量组、mpeg-gpx4m低剂量组。在空白对照组中加入高糖dmem培养基，其余七组分别加入等体积高糖dmem培养基和终浓度为150μmol/l的过氧化氢培养24h，然后在gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的gpx4m，mpeg-gpx4m高、中、低剂量组分别加入终浓度0.2u/ml、0.1u/ml和0.05u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。培养结束后利用超氧化物歧化酶(sod)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内sod活性测定。

由表1可知，在过氧化氢处理后的成纤维细胞中添加gpx4m和mpeg-gpx4m后，各组sod水平较过氧化氢模型组均有所增加，并且与给予剂量呈现正相关，即随着gpx4m和mpeg-gpx4m剂量的增加，细胞内sod的水平增加，但和空白对照组相比均存在一定的差异。比较同剂量gpx4m组和mpeg-gpx4m组的sod数值可知，二者均能够显著提高损伤hsf细胞内sod的活性，说明二者具有良好的抗氧化能力，且mpeg-gpx4m的抗氧化活性优于gpx4m，表1为聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体在抗氧化化妆品领域的应用提供了数据支持。

实施例5：mpeg-gpx4m对hek293t细胞的抗氧化活性评价

(1)gpx4m和mpeg-gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞氧化应激损伤的细胞存活率的影响

将本实验室保存的hek293t细胞(人胚肾细胞)经传代培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的96孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、阿霉素模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入阿霉素，终浓度为25μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为25μmol/l的阿霉素，继续培养作用24h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为25μmol/l的阿霉素培养12h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h。培养结束后移去上清液，每孔加入150μl的dmso置于酶标仪中震荡混匀使底部沉淀充分溶解，终止反应。然后使用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度值，比较各组细胞存活率。

由图10看出，和模型组相比，预防组和治疗组用药后均有较高的细胞存活率，但是低于空白对照组100％的细胞存活率。gpx4m经聚乙二醇单修饰后，和gpx4m相比，mpeg-gpx4m在体外仍然保持良好的抗氧化性。

(2)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞氧化应激损伤的细胞存活率的影响

将本实验室保存的hek293t细胞经传代培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的96孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、过氧化氢模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入过氧化氢，终浓度为600μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢，继续培养作用12h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢培养6h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养6h。每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h。培养结束后移去上清液，每孔加入150μl的dmso置于酶标仪中震荡混匀使底部沉淀充分溶解，终止反应。然后使用酶标仪在490nm处测定各孔吸光度值，比较各组细胞存活率。

由图11看出，和模型组相比，预防组和治疗组用药后均有较高的细胞存活率，但是低于空白对照组100％的细胞存活率。gpx4m经聚乙二醇单修饰后，和gpx4m相比，mpeg-gpx4m在体外仍然保持良好的抗氧化性。

(3)gpx4m和mpeg-gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞损伤的细胞内乳酸脱氢酶含量的影响

将本实验室保存的hek293t细胞经传代培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、阿霉素模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入阿霉素，终浓度为25μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为25μmol/l的阿霉素，继续培养作用24h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为25μmol/l的阿霉素培养12h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。培养结束后利用乳酸脱氢酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内乳酸脱氢酶含量测定。

由图12看出，和模型组相比，mpeg-gpx4m与gpx4m给药组均能明显增加细胞内乳酸脱氢酶的含量，说明二者均能降低细胞膜上脂质过氧化反应，并对该反应引起的细胞膜破损和细胞内乳酸脱氢酶外漏情况有明显的改善，二者的改善能力保持一致，即mpeg-gpx4m依然具有良好的降低脂质过氧化的能力。

(4)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞损伤的细胞内乳酸脱氢酶含量的影响

将本实验室保存的hek293t细胞经传代培养后接种到含有10％胎牛的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、过氧化氢模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入过氧化氢，终浓度为600μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢，继续培养作用12h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢培养6h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养6h。培养结束后利用乳酸脱氢酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内乳酸脱氢酶含量测定。

由图13看出，和模型组相比，mpeg-gpx4m与gpx4m给药组均能明显增加细胞内乳酸脱氢酶的含量，说明mpeg-gpx4m与gpx4m对于细胞膜上脂质过氧化反应均有减弱作用，并对该反应引起的细胞膜破损和细胞内乳酸脱氢酶外漏情况有较好的改善，二者的改善能力保持一致。

(5)gpx4m和mpeg-gpx4m对阿霉素引起hek293t细胞损伤的细胞内丙二醛含量的影响

将本实验室保存的hek293t细胞经传代培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、阿霉素模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入阿霉素，终浓度为25μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为25μmol/l的阿霉素，继续培养作用24h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为25μmol/l的阿霉素培养12h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.08u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养12h。培养结束后利用丙二醛试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内丙二醛含量测定。

由图14看出，mpeg-gpx4m与gpx4m都能够降低脂质过氧化物链式反应的发生率，从而使得细胞内丙二醛的含量有所下降，mpeg-gpx4m能够明显降低脂质过氧化物链式反应的发生率，其抗氧化性能和gpx4m保持一致。

(6)gpx4m和mpeg-gpx4m对过氧化氢引起hek293t细胞损伤的细胞内丙二醛含量的影响

将本实验室保存的hek293t细胞经传代培养后接种到含有10％胎牛血清的高糖dmem培养基的6孔板中，浓度为1×10⁵个/孔。将细胞置于37℃、5％co2培养箱中继续培养至细胞密度约90％左右时，将细胞分为空白对照组、模型组、预防组和治疗组。在空白对照组、预防组及治疗组中加入与模型组等量的高糖dmem培养基，模型组中加入过氧化氢，终浓度为600μmol/l。在预防组中，gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m预防组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞培养1h后分别加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢，继续培养作用12h。在治疗组中，首先在每个小组中加入终浓度为600μmol/l的过氧化氢培养6h，然后在gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的gpx4m和mpeg-gpx4m治疗组加入终浓度为0.1u/ml的mpeg-gpx4m，细胞接着培养6h。培养结束后利用丙二醛试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，按照说明书操作对上述各组细胞进行细胞内丙二醛含量测定。

由图15可知，mpeg-gpx4m与gpx4m都能够降低脂质过氧化物链式反应的发生率，从而使得细胞内丙二醛的含量有所下降，mpeg-gpx4m能够明显降低脂质过氧化物链式反应的发生率，其抗氧化性能和gpx4m保持一致。

实施例6：mpeg-gpx4m的抗氧化功能动物试验

选用平均体重约200g的老龄大鼠(12月龄)，共70只，随机分为7组，每组10只，编号1～7。第1组为老龄大鼠对照组，第2～4组分别为gpx4m高、中、低剂量组，第5～7组分别为mpeg-gpx4m高、中、低剂量组。另外选取健康成年大鼠10只作为第8组，即年轻大鼠对照组。gpx4m和mpeg-gpx4m的灌胃剂量按照人体每天所需硒元素推荐量的5倍、10倍、20倍(对应低、中、高剂量组)经口灌胃30天，第2～4组老龄大鼠分别给予高、中、低剂量gpx4m(0.063g/kg、0.031g/kg、0.016g/kg)，第5～7组老龄大鼠分别给予高、中、低剂量mpe-gpx4m(0.063g/kg、0.031g/kg、0.016g/kg，按gpx4m蛋白含量计)。在给予gpx4m和mpeg-gpx4m的同时，年轻大鼠对照组和老龄大鼠对照组分别灌胃给予等体积0.9％生理盐水。试验结束后将大鼠处死，测定肝组织中的丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)生化指标的变化。

由表2可知，和老龄大鼠对照组相比，给予gpx4m和mpeg-gpx4m的大鼠肝脏中sod、cat活力明显增强，mda含量显著下降，上述sod和cat的活性随着剂量的增加呈上升趋势，mda含量随着剂量的增加呈下降趋势。比较gpx4m低剂量组和mpeg-gpx4m低剂量组，发现mpeg-gpx4m低剂量组的生化指标变化程度高于gpx4m组，说明mpeg-gpx4m的抗氧化效果优于gpx4m。表2为聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶gpx4突变体保健品的开发利用提供了数据支持。

实施例7：mpeg-gpx4m的体内药效学评价

健康雄性wistar大鼠40只，体重约200g，经适应性饲养3天后将大鼠随机分为4组，每组10只，包括空白对照组，模型组、gpx4m治疗组和mpeg-gpx4m治疗组。模型组每天固定时间尾静脉注射终浓度3mg/ml阿霉素，连续注射6周；治疗组每天相同时间尾静脉注射终浓度3mg/ml阿霉素，治疗组在每次注射阿霉素30min后经腹腔注射给予药物治疗，利用0.9％生理盐水将gpx4m和mpeg-gpx4m样品的浓度调整为25μg/ml(按gpx4m蛋白含量计)，经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，gpx4m治疗组给予终浓度为50μg/kg的gpx4m,mpeg-gpx4m治疗组给予终浓度为50μg/kg(按gpx4m蛋白含量计)的mpeg-gpx4m。空白对照组每天相同时间腹腔注射等体积的0.9％生理盐水，连续注射6周。给药结束后，对经gpx4m和mpeg-gpx4m给药后的大鼠血清中超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和丙二醛(mda)等生化指标进行测定。

由表3可知，模型组sod、cat活力较空白对照组明显下降(p＜0.01)，mda含量明显增加(p＜0.01)；gpx4m组和mpeg-gpx4m组和模型组比较，sod和cat活力均有升高,其中mpeg-gpx4m组中sod和cat活力显著升高(p＜0.01)；和模型组比较gpx4m组和mpeg-gpx4m组中mda含量明显下降，且mpeg-gpx4m组中mda含量下降更为明显(p＜0.01)。说明与gpx4m相比较，mpeg-gpx4m有更好的体内抗氧化效果。

实施例8：mpeg-gpx4m的体内药代动力学评价

健康雄性sd大鼠24只，体重约250g，经适应性饲养3天后将大鼠随机分为4组，每组6只，包括空白对照组、模型组、gpx4m治疗组和mpeg-gpx4m治疗组。模型组第一次尾静脉注射终浓度15mg/ml阿霉素，第一次注射一周后再次注射终浓度10mg/ml阿霉素，即可复制大鼠心肌损伤模型；治疗组在相同时间尾静脉注射等体积阿霉素，在第二次注射阿霉素一周后，治疗组经腹腔注射分别给予药物治疗，利用0.9％生理盐水将gpx4m和mpeg-gpx4m样品的浓度调整为200μg/ml(按gpx4m蛋白含量计)，经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，gpx4m组给予终浓度为100μg/kg的gpx4m,mpeg-gpx4m组给予终浓度为100μg/kg(按gpx4m蛋白含量计)的mpeg-gpx4m，空白对照组和模型组每天相同时间腹腔注射等体积0.9％生理盐水。各组于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96h经眼眶取血，每次取血量为200μl。离心获取大鼠血清，通过elisa双夹心法测定血药浓度。

采用非房室模型方法拟合计算主要药代动力学参数。采用excel2010对均值、标准差等数据进行统计分析。

血药浓度随时间变化的规律见图15。

药代动力学各参数的计算结果见表4。

由图16和表4看出，mpeg-gpx4m在注射后8h达到最大血药浓度(cmax)，其值为5.61μg/ml，而gpx4m在注射2h后血药浓度达到峰值。gpx4m的循环半衰期(t1/2)为15.11h，比gpx4m的t1/2增加了约3.4倍。而gpx4m的肾清除率(cl)是mpeg-gpx4m的cl的2.2倍，mpeg-gpx4m的药时曲线下面积(auc)约为gpx4m的auc的4倍。上述分析表明，gpx4m经聚乙二醇化单修饰后，其在体内的循环半衰期显著延长，肾清除率明显降低，最大血药浓度和药时曲线下面积有所增大。