一种动物蛋白的多级酶解方法及应用与流程

本发明涉及蛋白酶解
技术领域：
，具体涉及一种动物蛋白的多级酶解方法及应用。
背景技术：
：随着生物技术的发展和广泛应用，从天然动植物体提取特定天然物质的技术成为获取天然营养原料的重要手段，植物提取物技术多采用亚临界、超临界、酒精或乙醚萃取的方案，可以高效的分离特定特征分子。而动物提取领域主要以酶解技术和发酵技术为主要手段，一般的酶解技术关注于活性和平均分析量，而不考虑分子量分布。以胶原蛋白生产为例，由于常规大规模生产难以达到均匀稳定的分子量分布，从而限制了小分子产品的纯化和提取，因此限制了小分子蛋白市场的发展，很多研究由于无法得到大量的准确分子量的产品而无法实现工业化转化和技术研发。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种动物蛋白的多级酶解方法及应用。本发明相对于现有动物蛋白酶解方法，具有酶解效果稳定，分子量统一性高，目标分子收成率高，相对成本低等优势。本发明提供了一种动物蛋白的多级酶解方法，包括以下步骤：1)将动物源原料依次进行物理撕碎、破碎和胶体磨破壁得到浆料；2)将步骤1)所述浆料和水混合，搅拌，加热至75℃，恒温水解3h，得到初级水解浆料；3)对步骤2)所述初级水解浆料进行温度调节，使温度调节至50～54℃，调节ph值为8.0～9.0，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～50min，得到一级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.04％；4)待步骤3)所述一级生化降解浆料的ph值为7.5，在温度为50～53℃下加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～40min，得到二级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.05％；5)待步骤4)所述二级生化降解浆料的ph值为6.8～7.2，在温度为50～53℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应30～40min，得到三级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.06％；6)待步骤5)所述三级生化降解浆料的ph值为6.4～6.8，在温度为50℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应20～30min，得到四级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.04％；7)待步骤6)所述四级生化降解浆料的ph值为5.5～6.0，在温度为45～50℃下，加入酸性蛋白酶，搅拌，恒温反应30～50min，得到五级生化降解浆料；所述酸性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.05～0.08％；8)待步骤7)所述五级生化降解浆料的ph为4.0～7.0，过滤，得到多级酶解后的蛋白。优选的是，所述动物源原料包括农业渔业加工剩下的动物渣料。优选的是，所述农业渔业加工剩下的动物渣料包括屠宰厂下水渣料、渔业码头捕捞的小鱼小虾和碎鱼杂鱼；所述屠宰场下水渣料包括杀鸡后的鸡肠和/或水产厂杀鱼剩下的鱼肠鱼渣。优选的是，步骤2)所述浆料和水混合的质量比为1:1。优选的是，步骤3)所述温度调节的方法包括将初级水解浆料和冷水混合。优选的是，步骤8)所述过滤包括袋滤或半框压滤，通过滤网或滤布过滤除渣料。优选的是，步骤8)所述过滤的次数为2次，第一次过100目，第二次过200目。优选的是，所述碱性蛋白酶的酶活为20万u/g。优选的是，所述木瓜蛋白酶的酶活为20万u/g。优选的是，所述酸性蛋白酶的酶活为10万u/g。本发明提供了一种动物蛋白的多级酶解方法。本发明采用分步酶解，通过分散系的控制，提高对酶解进程的控制，从而改变了酶解工艺的理解，从根本上改变了传统酶解工艺的思路，是一种全新的尝试和探索。本发明更注重分子量分布，通过更准确的控制酶解进程和强度，从而提高酶解分子量的统一性，提高目标分子段收成率，且本发明精确地采用分步分级式酶解工艺可以更好的在工业上实现生产。具体的，本发明在传统技术基础上，采用3酶，多次多级控制，采用简单设备实现生物酶解的精准控制，提高了酶的活性效果，通过降低酶解反应的副反应率，从而提高酶解效果的稳定性；通过多级酶解，使得蛋白质分子酶解切点同步率高，目标分子的收成率提高20％左右；同时由于采用了分级分步酶解，使用的酶量下降，从而降低了生产成本。因此，本发明多级酶解体系，可以有效生产指定特征(特定范围分子量)的蛋白肽，具有广泛的应用空间，如农业饲料添加、有机肥料、营养提取等领域。附图说明图1为本发明提供的最佳ph值控制曲线图；图2为本发明提供的最佳温度控制曲线图；图3为本发明提供的最佳酶用量控制曲线图。具体实施方式本发明提供了一种动物蛋白的多级酶解方法，包括以下步骤：1)将动物源原料依次进行物理撕碎、破碎和胶体磨破壁得到浆料；2)将步骤1)所述浆料和水混合，搅拌，加热至75℃，恒温水解3h，得到初级水解浆料；3)对步骤2)所述初级水解浆料进行温度调节，使温度调节至50～54℃，调节ph值为8.0～9.0，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～50min，得到一级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.04％；4)待步骤3)所述一级生化降解浆料的ph值为7.5，在温度为50～53℃下加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～40min，得到二级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.05％；5)待步骤4)所述二级生化降解浆料的ph值为6.8～7.2，在温度为50～53℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应30～40min，得到三级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.06％；6)待步骤5)所述三级生化降解浆料的ph值为6.4～6.8，在温度为50℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应20～30min，得到四级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.04％；7)待步骤6)所述四级生化降解浆料的ph值为5.5～6.0，在温度为45～50℃下，加入酸性蛋白酶，搅拌，恒温反应30～50min，得到五级生化降解浆料；所述酸性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.05～0.08％；8)待步骤7)所述五级生化降解浆料的ph为4.0～7.0，过滤，得到多级酶解后的蛋白。本发明将动物源原料依次进行物理撕碎、破碎和胶体磨破壁得到浆料。在本发明中，所述动物源原料优选包括农业渔业加工剩下的动物渣料。在本发明中，所述农业渔业加工剩下的动物渣料优选包括屠宰厂下水渣料、渔业码头捕捞的小鱼小虾和碎鱼杂鱼；所述屠宰场下水渣料优选包括杀鸡后的鸡肠和/或水产厂杀鱼剩下的鱼肠鱼渣。本发明对所述物理撕碎、破碎和胶体磨破碎的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的动物源原料物理撕碎、破碎和胶体磨破碎的常规操作方法即可。经破碎的原料水解更充分，可以缩短水解时间和调节误差。得到浆料后，本发明将所述浆料和水混合，搅拌，加热至75℃，恒温水解3h，得到初级水解浆料。在本发明中，所述浆料和水混合的质量比优选为1:1。本发明所述水解条件的设置可以降低蛋白质在水解过程中过度水解造成的营养损失。得到初级水解浆料后，本发明对所述初级水解浆料进行温度调节，使温度调节至50～54℃，调节ph值为8.0～9.0，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～50min，得到一级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.04％，更优选为0.026％。在本发明中，所述温度调节的方法优选包括将初级水解浆料和冷水混合，混合后，本发明优选进行搅拌，所述搅拌优选搅拌均匀。本发明对所述ph值的调节方法没有特殊限定，采用常规ph调节方法即可，如采用盐酸或氢氧化钠溶液进行调节。本发明整个动物蛋白的多级酶解方法中，仅进行这一次人工ph值的调节。在本发明中，所述温度更优选为53.8℃，ph值更优选为8.8，恒温反应的时间更优选为40min。本发明优选的方案通过实测可以避免蛋白分子在酶解生化反应过程中被过度解离，并为最终控制提高目标为特定范围分子量(本发明特定分子量、特定范围分子量是指具有一定生物功能活性蛋白肽的分子量或分子量范围，如已分离的有470道尔顿、490～520道尔顿和690～740道尔顿区间等，具有抑制减慢微生物生长、快速进入细胞大分子通道等特性)的蛋白肽在产物中的含量具有决定性影响。在本发明中，所述碱性蛋白酶的酶活优选为20万u/g。待所述一级生化降解浆料的ph值为7.5，本发明在温度为50～53℃下加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应20～40min，得到二级生化降解浆料；所述碱性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.02～0.05％。当所述ph值为7.5，反映出蛋白质的一级解离达到60～65％，达到目标进程，此位点介入二级酶解，可控制最终产物特定分子量蛋白肽产量的稳定，避免过度分解，且避免由于过度分解导致的后面多级酶解的失控。在本发明中，所述碱性蛋白酶的酶活优选为20万u/g。本发明经过两次碱性蛋白酶处理后，能够使蛋白质酶解的切口释放出足够的氢离子，使溶液ph值回落到中性区，离开碱性蛋白酶的最佳反应区域，且本发明两次碱性蛋白酶酶解的操作能够有效避免碱性蛋白酶的添加过量，避免在投放时，瞬间底物局部接触大量高浓度酶(而搅拌均匀需要时间)，局部的高酶量将导致部分蛋白过度酶解，导致最终所有蛋白质的酶解进程差别太大；同时过量剩余的碱性蛋白酶进入中性区后，反应速度和效果都不高，并没有发挥应有的作用，反而会形成生物酶浪费，本申请碱性蛋白酶酶解具有节约生物酶用量，同时更好的提高酶解效果。待所述二级生化降解浆料的ph值为6.8～7.2，本发明在温度为50～53℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应30～40min，得到三级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.06％。根据提高特定分子量目标蛋白的设计目的，本发明监测ph值变化至6.8～7.2时，开启三级生化降解；本发明优选按照下述方法以及ph的数值，决定酶添加量：ph越小，则表示反应进程更深，小分子蛋白数量越多，需要投入的三级生物酶解的酶量越要少，反应时间相应要缩短，以保障不过度酶解。在本发明中，所述木瓜蛋白酶的酶活优选为20万u/g。待所述三级生化降解浆料的ph值为6.4～6.8，本发明在温度为50℃下加入木瓜蛋白酶，搅拌，恒温反应20～30min，得到四级生化降解浆料；所述木瓜蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.03～0.04％。在本发明中，所述木瓜蛋白酶的酶活优选为20万u/g。本发明分次加入木瓜蛋白酶，能够避免一次加入过多，木瓜酶过量而导致的酶解过度的问题，既节省了生物酶施用量，又可以提高酶解进程的控制度，避免最终产品的蛋白肽碎片化现象。本发明进行两次木瓜蛋白酶酶解，能够实现对反应进程进行监控，避免局部过度酶解、同时，通过分次投放生物酶，对酶解反应进行进程控制，提高了酶消耗量的控制度，避免传统酶解工艺中使用过量酶量而后面又要通过灭酶终止酶解反应的情况，从而提高整体反应精度，降低木瓜酶使用量，可比传统复合酶解少用10～15％的生物酶量。待所述四级生化降解浆料的ph值为5.5～6.0，本发明在温度为45～50℃下，加入酸性蛋白酶，搅拌，恒温反应30～50min，得到五级生化降解浆料；所述酸性蛋白酶的质量为所述动物源原料质量的0.05～0.08％。在本发明中，所述酸性蛋白酶的酶活优选为10万u/g。在完成前四级生化降解反应后，浆料中主要蛋白质已经降解为中小分子量(1500～3500道尔顿)的多肽，反应体系的ph值也已经进入微酸区间，这时碱性蛋白酶和木瓜酶的生物活性和反应条件都已经不是最佳状态，要完成最后部分的酶解进程需要使用酸性蛋白酶进行。鉴于在酸性条件下，酸性蛋白酶的活性表现优异，而酸性条件下蛋白多肽的稳定性较好，可以控制避免过度酶解，本发明选择使用一次性酸性蛋白酶降解完成酶解最后阶段。其控制关键点在于温度和时间的控制。本发明酶解温度和时间的设置能够确保最终产品分子量集中度较好，且能够进一步降低生物酶施用量。待所述五级生化降解浆料的ph为4.0～7.0，本发明过滤，得到多级酶解后的蛋白。在本发明中，所述过滤优选包括袋滤或半框压滤，通过滤网或滤布过滤除渣料。在本发明中，所述过滤的次数为2次，第一次优选过100目，第二次优选过200目，本发明所述过滤条件的设定能够高效过滤掉杂质。本发明得到的多级酶解后的蛋白富含蛋白质营养，非常容易滋生细菌，导致蛋白液腐化，本发明后续优选可以配合防腐技术制作相应产品，如果是作为半成品，提供给下游厂生产，也可以采用冷冻等手段进行储存和运输，避免成品变质。本发明进行从一级到五级的酶解，本发明碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶的使用能够实现动物蛋白的充分酶解，更好的切割蛋白质，酶解条件的具体设置，使得本发明不至于过度酶解，采用分次加入的方法，能够实现每种酶的最佳酶解作用的发挥。从碱性蛋白酶到木瓜蛋白酶，再到酸性蛋白酶的使用过程能够避免二次或多次调节反应溶液的ph值(本发明进入酶解阶段后，通过ph值的变化，跟踪反应进程，通过改变酶的量、温度、反应时间，来进行分步酶解，底物随着反应进程的控制而变化，ph值根据反应进程而变化)，破坏反应体系的目的。在本发明中，所述ph值范围的设定为监控反应进程的重要数据指标。在本发明的多级酶解方法中，ph的变化，是通过酶解反应过程不断释放氨基酸端头，在溶液中形成氢离子，不断降低ph值的结果，本发明在对初级水解浆料进行人工ph调节后，后续无需进行ph值的调节，而是将ph作为何时进行温度和酶解条件改变的指标。本发明还同时避免了由于多次ph调节造成的工艺过度繁琐，容错率下降，不便于工业化生产控制的问题。本发明在一定程度上保留了操作工容错空间，更便于工业化生产中工人培训上手工作。本发明得到的多级酶解后的蛋白富含天然蛋白多肽和小肽(优选为350道尔顿到1880道尔顿之间的有2～10个氨基酸组成的小分子肽，这一分子量的蛋白肽粉子可以被细胞直接通过细胞膜上的特别通道直接吸收)，含有多种动植物所需的天然游离氨基酸(左旋氨基酸：甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸脯氨酸、羟脯氨酸等)，更含有部分天然矿物质(主要是植物必须的17种必要元素中除氮、磷、硫、碳、氢、氧、氯以外的矿物元素：钙、镁、锌、铁、硼、铜、钾、钼、锰、镍，以及少量的硅和钠)，通过检测，蛋白酶解液含有蛋白质多肽(以有机氮计算)≤210mg/l。游离氨基酸≤120mg/l，镁、锌、钙、硼等微量元素量≥20mg/l，可以供应饲料添加、有机肥原料、营养蛋白产品原料等。相对于传统蛋白酶解技术采用模糊的平均分子量的描述不同，本发明的技术优势在于可以更好的控制小分子蛋白肽的分布集中化，使得生物功能更好的小分子蛋白在总体产品中的含量大幅增加。而其控制的方法在于本发明中从起始反应的ph值控制，到多级酶解过程中根据ph值变化的关键时机点开启下一级酶解，到各级酶解中的温度、时间和酶的投放量的精准控制，这涉及到大量的生产数据和实验数据的积累和实测。如实施例中使用起始ph值9.0可以让最终产物中蛋白分子的分子量最小值变小，即可以得到更小的肽分子；而二级和三级酶解控制进程稳定，可以控制酶解不过度反应，为四级酶解和五级酶解留有足够的发挥空间；最后阶段的酶施用量和酶解时间决定了最终段大分子蛋白肽的大小，即最终产品中大分子蛋白的含量和分子量控制。下面结合具体实施例对本发明所述的一种动物蛋白的多级酶解方法及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1原料：鱼肠下水100kg；预处理：将动物源原料进行物理撕碎、破碎、胶体磨破壁至浆状；初级水解：将浆料加1倍质量的水，搅拌均匀，物料加热到75℃恒温水解3h；一级生化降解：加适当冷水，搅拌均匀使浆液在50℃，调节ph值9.0，加入原料质量0.04％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；二级生化降解：调节浆液ph值到7.5，温度53℃，加入原料质量0.05％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；三级生化降解：调节浆液ph值到6.8，温度50℃，加入原料质量0.05％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；四级生化降解：调节浆液ph值到6.4，温度50℃，加入原料质量0.03％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；五级生化降解：调节浆液ph值到6.0，温度48℃，加入原料质量0.08％的酸性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；过滤：使用袋滤机或板框压滤，通过滤网滤布将渣料过滤出来；调配：调整ph值在5.0，添加适当防腐剂或通过巴氏消毒机做防护处理；灌装入库：根据规格进行灌装和包装密封，入库保存。通过高效液相色谱质谱联动检测，分子量分布在365～1740道尔顿之间，相对平均分子量为1204道尔顿。实施例2原料：碎鸡肉(含皮和软骨)100kg；预处理：将动物源原料进行物理撕碎、破碎、胶体磨破壁至浆状；初级水解：将浆料加1倍质量的水，搅拌均匀，物料加热到75℃恒温水解3h；一级生化降解：加适当冷水，搅拌均匀使浆液在53℃，调节ph值9.0，加入原料质量0.04％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应50min；二级生化降解：调节浆液ph值到7.5，温度53℃，加入原料质量0.05％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；三级生化降解：调节浆液ph值到7.0，温度50℃，加入原料质量0.06％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；四级生化降解：调节浆液ph值到6.4，温度50℃，加入原料质量0.04％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；五级生化降解：调节浆液ph值到5.7，温度48℃，加入原料质量0.08％的酸性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；过滤：使用袋滤机或板框压滤，通过滤网滤布将渣料过滤出来；调配：调整ph值在4.5，添加适当防腐剂或通过巴氏消毒机做防护处理；灌装入库：根据规格进行灌装和包装密封，入库保存。通过高效液相色谱质谱联动检测，分子量分布在560～1520道尔顿之间，相对平均分子量为1132道尔顿。实施例3原料：小杂鱼和碎鱼肉100kg；预处理：将动物源原料进行物理撕碎、破碎、胶体磨破壁至浆状；初级水解：将浆料加1倍质量的水，搅拌均匀，物料加热到75℃恒温水解3h；一级生化降解：加适当冷水，搅拌均匀使浆液在54℃，调节ph值8.5，加入原料质量0.03％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；二级生化降解：调节浆液ph值到7.5，温度52℃，加入原料质量0.04％的碱性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应25min；三级生化降解：调节浆液ph值到7.0，温度50℃，加入原料质量0.05％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应30min；四级生化降解：调节浆液ph值到6.8，温度50℃，加入原料质量0.03％的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应25min；五级生化降解：调节浆液ph值到5.8，温度46℃，加入原料质量0.06％的酸性蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应40min；过滤：使用袋滤机或板框压滤，通过滤网滤布将渣料过滤出来；调配：调整ph值在4.2，添加适当防腐剂或通过巴氏消毒机做防护处理；灌装入库：根据规格进行灌装和包装密封，入库保存。通过高效液相色谱质谱联动检测，分子量分布在455～1180道尔顿之间，相对平均分子量为670道尔顿。实施例4原料：鱼皮鱼鳞100kg；预处理：将动物源原料进行物理撕碎、破碎、胶体磨破壁至浆状；初级水解：将浆料加4倍质量的水，搅拌均匀，物料加热到95℃恒温水解2h；生化降解：降温至56℃，调节ph值8.5，加入原料质量0.4％的胶原蛋白酶，搅拌均匀，恒温反应2h；灭酶活：料液升温至80℃以上，恒温搅拌15min；脱色：加入质量比1.5％的活性炭，恒温搅拌35min，使物料充分混合；过滤：使用袋滤机或板框压滤，通过滤网滤布将渣料过滤出来；调配：调整ph值在6.5，添加适当防腐剂或通过巴氏消毒机做防护处理；灌装入库：根据规格进行灌装和包装密封，入库保存。通过高效液相色谱质谱联动检测，分子量分布在260～6830道尔顿之间，相对平均分子量为1560道尔顿。对实施例进行分析对比可知，本发明方法很好的解决了蛋白工程工艺中对不同蛋白的选择性难题，同时良好的控制了蛋白酶解分子量分布范围，提高了目标小分子蛋白肽的收成率；降低了生物酶使用量，更好的适应工业化处理。即实施例1～3为使用本发明方法得到的产品，通过质谱检测得到的分子量结果如表1所示。实施例4为现在普通的胶原蛋白提取试验。进行对比可知，本发明通过多级酶解，酶解结果更精准，目标蛋白肽含量更高。同时，通过不同阶段酶解条件的控制，可以进行分子量的控制和调节。从而达到对产品的方向性生产，如实施例3作为小分子蛋白提取，其平均分子量最低，总用酶量最小，成本最优化。表1实施例1～4质谱检测对比分析结果实施例1实施例2实施例3实施例4方法本发明方法本发明方法本发明方法一般胶原蛋白方法蛋白种类鱼肠蛋白肌肉蛋白复合鱼蛋白胶原蛋白分子量分布365～1740d560～1520d455～1180d260～6830d平均分子量1204d1132d670d1560d生物酶用量250g270g200g400g对比例1其它条件与实施例3的操作条件相同，分别设置不同ph值、温度、酶用量、动物园原料种类，通过测量得到不同的变化曲线，在成本最优的条件下，得到更好分子量的产品。将ph值作为可监控指标，可以判断反应进程，从而判断和控制反应进程，确保酶解过程的精准进行，最佳ph值控制曲线图如图1所示；同理，将温度作为可监控指标，最佳温度控制曲线图如图2所示；将酶用量作为可监控指标，最佳酶用量控制曲线图如图3所示；将动物源原料种类作为可监控指标，最终得到的结论为，最佳处理材料是鱼杂料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12