抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的制作方法

本申请是申请号为201610183223.5，发明名称为“抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体”的申请的分案申请。申请号为201610183223.5的申请是国际申请日为2005年7月8日、国际申请号为pct/jp2005/013103于2006年3月1日进入中国国家阶段、申请号200580000807.4、发明名称“抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体”的申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明涉及一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，一种含有该抗体作为活性成分的细胞生长抑制剂和抗癌药物。

相关技术描述

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族中的一种。一些人认为gpc3可能与发育中的细胞分裂或癌细胞生长有关，然而，其功能目前仍没有得以较好的阐明。

人们已发现某种类型的结合于gpc3的抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性以及补体-依赖的细胞毒性(cdc)活性具有细胞生长-抑制活性(国际专利申请wo2003/000883)。此外，已表明gpc3在体内裂解并以gpc3的分泌形式分泌到血液中，且利用能够检测分泌形式gpc3的抗体可以进行肿瘤诊断(国际专利申请wo2004/022739，wo03/100429和wo2004/018667)。

当开发基于抗体的细胞毒性活性的抗癌药物时，优选使用具有高adcc活性或cdc活性的抗体。因此，具有高细胞毒性活性的gpc3抗体已被期待作为识别gpc3的抗体。

本发明的目的是提供一种与传统抗体相比具有较高adcc活性和cdc活性的抗-gpc3抗体。

发明概述

本发明人成功获得了与常规的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体相比具有较高细胞毒性活性的抗体。此外，他们分析了这种抗体的表位并成功确定了由具有高细胞毒性活性的抗体识别的gpc3上的区域。

一方面，本发明提供了含有具有下述(1)-(12)任一项的cdrs1，2和3的重链可变区的抗体∶

(1)含有seqidno：123所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：124所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：125所示氨基酸序列的cdr3；

(2)含有seqidno：109所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：110所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：111所示氨基酸序列的cdr3；

(3)含有seqidno：106所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：107所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：108所示氨基酸序列的cdr3；

(4)含有seqidno：132所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：133所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：134所示氨基酸序列的cdr3；

(5)含有seqidno：106所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：135所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：136所示氨基酸序列的cdr3；

(6)含有seqidno：126所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：127所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：128所示氨基酸序列的cdr3；

(7)含有seqidno：129所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：130所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：131所示氨基酸序列的cdr3；

(8)含有seqidno：103所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：104所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：105所示氨基酸序列的cdr3；

(9)含有seqidno：118所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：121所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：122所示氨基酸序列的cdr3；

(10)含有seqidno：115所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：116所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：117所示氨基酸序列的cdr3；

(11)含有seqidno：112所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：113所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：114所示氨基酸序列的cdr3；或

(12)含有seqidno：118所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：119所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：120所示氨基酸序列的cdr3；

在另一个方面，本发明提供了含有具有如下(1)-(13)任一项的cdrs1，2和3的轻链可变区的抗体∶

(1)含有seqidno：143所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(2)含有seqidno：143所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：145所示氨基酸序列的cdr3；

(3)含有seqidno：140所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：141所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：142所示氨基酸序列的cdr3；

(4)含有seqidno：167所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：168所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：169所示氨基酸序列的cdr3；

(5)含有seqidno：170所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：171所示氨基酸序列的cdr3；

(6)含有seqidno：159所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：160所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：161所示氨基酸序列的cdr3；

(7)含有seqidno：162所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：147所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：163所示氨基酸序列的cdr3；

(8)含有seqidno：164所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：165所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：166所示氨基酸序列的cdr3；

(9)含有seqidno：137所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：138所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：139所示氨基酸序列的cdr3；

(10)含有seqidno：155所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：156所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：157所示氨基酸序列的cdr3；

(11)含有seqidno：149所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：150所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：151所示氨基酸序列的cdr3；

(12)含有seqidno：146所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：147所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：148所示氨基酸序列的cdr3；或

(13)含有seqidno：152所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：153所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：154所示氨基酸序列的cdr3；

优选地，本发明的抗体选自如下(1)-(13)的任一项∶

(1)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：143，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(2)包括具有分别含有seqidno：109,110和111所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：143，144和145所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(3)包括具有分别含有seqidno：106,107和108所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：140，141和142所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(4)包括具有分别含有seqidno：132,133和134所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：167，168和169所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(5)包括具有分别含有seqidno：106,135和136所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：170，144和171所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(6)包括具有分别含有seqidno：126,127和128所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：159，160和161所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(7)包括具有分别含有seqidno：129,130和131所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：162，147和163所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(8)包括具有分别含有seqidno：129,130和131所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：164，165和166所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(9)包括具有分别含有seqidno：103,104和105所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：137，138和139所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(10)包括具有分别含有seqidno：118,121和122所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：155，156和157所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(11)包括具有分别含有seqidno：115,116和117所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：149，150和151所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(12)包括具有分别含有seqidno：112,113和114所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：146，147和148所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(13)包括具有分别含有seqidno：118,119和120所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：152，153和154所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

在另一个方面，本发明提供了含有具有如下(1)-(7)任一项的重链可变区的抗体∶

(1)包括seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区；

(2)包括seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区；

(3)包括seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区；

(4)包括seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区；

(5)包括seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区；

(6)包括seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区；或

(7)包括seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区。

在另一个方面，本发明提供了具有包含seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

优选地，本发明的抗体选自如下(1)-(7)任一项的抗体∶

(1)包括含有seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；

(2)包括含有seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；

(3)包括含有seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno:92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；

(4)包括含有seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno:92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；

(5)包括含有seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno:92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；

(6)包括含有seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno:92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及

(7)包括含有seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区以及含有seqidno:92所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

在另一个方面，本发明提供了含有具有如下(1)-(15)任一项的cdrs1，2和3的轻链可变区的抗体∶

(1)含有seqidno：174所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(1)含有seqidno：175所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(3)含有seqidno：176所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(4)含有seqidno：177所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(5)含有seqidno：178所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(6)含有seqidno：179所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(7)含有seqidno：180所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(8)含有seqidno：181所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(9)含有seqidno：182所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(10)含有seqidno：183所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(11)含有seqidno：184所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(12)含有seqidno：185所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(13)含有seqidno：186所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；

(14)含有seqidno：187所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3；或

(15)含有seqidno：188所示氨基酸序列的cdr1，含有seqidno：144所示氨基酸序列的cdr2，以及含有seqidno：158所示氨基酸序列的cdr3。

在另一个方面，本发明提供了选自抗体如下(1)-(15)的抗体∶

(1)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：174，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(2)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：175，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(3)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：176，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(4)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：177，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(5)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：178，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(6)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：179，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(7)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：180，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(8)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：181，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(9)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：182，144和159所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(10)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：183，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(11)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：184，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(12)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：185，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(13)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：186，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；

(14)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：187，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体；和

(15)包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：188，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体。

在另一方面，本发明提供了具有选自如下(1)-(15)的轻链可变区的抗体∶

(1)含有seqidno：191所示氨基酸序列的轻链可变区；

(2)含有seqidno：192所示氨基酸序列的轻链可变区；

(3)含有seqidno：193所示氨基酸序列的轻链可变区；

(4)含有seqidno：194所示氨基酸序列的轻链可变区；

(5)含有seqidno：195所示氨基酸序列的轻链可变区；

(6)含有seqidno：196所示氨基酸序列的轻链可变区；

(7)含有seqidno：197所示氨基酸序列的轻链可变区；

(8)含有seqidno：198所示氨基酸序列的轻链可变区；

(9)含有seqidno：199所示氨基酸序列的轻链可变区；

(10)含有seqidno：200所示氨基酸序列的轻链可变区；

(11)含有seqidno：201所示氨基酸序列的轻链可变区；

(12)含有seqidno：202所示氨基酸序列的轻链可变区；

(13)含有seqidno：203所示氨基酸序列的轻链可变区；

(14)含有seqidno：204所示氨基酸序列的轻链可变区；和

(15)含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区。

在另一个方面，本发明提供了具有选自如下(1)-(15)的轻链可变区以及选自如下(1)-(7)的重链可变区的抗体∶

其中所述轻链可变区选自：

(1)含有seqidno：191所示氨基酸序列的轻链可变区；

(2)含有seqidno：192所示氨基酸序列的轻链可变区；

(3)含有seqidno：193所示氨基酸序列的轻链可变区；

(4)含有seqidno：194所示氨基酸序列的轻链可变区；

(5)含有seqidno：195所示氨基酸序列的轻链可变区；

(6)含有seqidno：196所示氨基酸序列的轻链可变区；

(7)含有seqidno：197所示氨基酸序列的轻链可变区；

(8)含有seqidno：198所示氨基酸序列的轻链可变区；

(9)含有seqidno：199所示氨基酸序列的轻链可变区；

(10)含有seqidno：200所示氨基酸序列的轻链可变区；

(11)含有seqidno：201所示氨基酸序列的轻链可变区；

(12)含有seqidno：202所示氨基酸序列的轻链可变区；

(13)含有seqidno：203所示氨基酸序列的轻链可变区；

(14)含有seqidno：204所示氨基酸序列的轻链可变区；和

(15)含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区；

其中所述重链可变区选自∶

(1)包括seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区；

(2)包括seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区；

(3)包括seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区；

(4)包括seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区；

(5)包括seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区；

(6)包括seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区；和

(7)包括seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区。

cdrs1,2和3的重链可变区，轻链可变区和氨基酸序列，以及seqidnos概括在下表中。

本发明也描述了具有相当于如上所述抗体活性的抗体，其中如上所述氨基酸序列的一或多个氨基酸残基被取代、缺失或添加和/或插入。

优选地，本发明的抗体是人源化抗体。

因此，在另一个方面，本发明提供了能够结合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人源化抗体。

在进一步的方面，本发明提供了能够结合于含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基524-563序列的肽的抗体。

优选地，本发明的抗体能够结合于含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基537-563序列的肽。更优选地，本发明的抗体不结合于含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基550-563序列的肽。

优选地，本发明的抗体能够结合于含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基544-553序列的肽或含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基546-551序列的肽。

在另一个方面，本发明提供了一种能够结合于与第二抗体能够结合的表位的抗体，其中所述第二抗体包括具有分别含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有分别含有seqidno：143，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区。即，本发明的抗体能够与第二抗体竞争结合于gpc3。

在一优选的实施方案中，本发明的抗体能够结合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3并具有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达细胞的高cdc活性和/或具有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达细胞的高adcc活性。

在另一个方面，本发明提供了编码本发明抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。

优选地，本发明的多核苷酸具有seqidnos:11-21,33-43，55-59，65-70和77-83所示的序列。

在另一个方面，本发明提供了含有本发明抗体作为活性成分的细胞-生长抑制剂和抗癌药物。优选地，本发明的抗癌药物用于治疗肝细胞瘤。

在另一方面，本发明提供了含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基524-563序列，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基537-563序列，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基544-553序列或磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸残基546-551的氨基酸序列的肽。

附图说明

图1显示了抗-gpc3抗体与cho细胞的结合活性，cho细胞表达全长的gpc3，hepg2和huh-7，其通过流式细胞术进行评价。m1e7(实线)和m11f1(虚线)分别以5μg/ml的浓度使用。

图2为显示通过竞争性elisa对表位进行分类的结果的表。抗生物素酰化抗-gpc3抗体的结合的竞争性抑制的程度用百分比表示。根据竞争性抑制图谱将表位归类为a至e五个组。

图3显示了通过western印迹法评价抗-gpc3抗体是否结合于gpc3核心蛋白的40kda可溶性形式的n-末端片段或其30kda的c-末端片段的结果。发现l9g11结合于n-末端片段而m3c11结合于c-末端片段。

图4显示了通过夹心elisa检测gpc3的分泌形式存在于hepg2的培养上清液中的结果。强烈地检测到了结合于n-末端片段诸如m6b1、m18d4或m19b11的抗体的组合，且没有强烈地检测到结合于c-末端片段诸如m3c11、m13b3或m3b8的抗体。

图5显示了使用抗-gpc3抗体的hepg2的培养上清液的免疫沉降以及gpc3分泌形式的检测结果。培养基作为对照(泳道1和3)且hepg2的培养上清液(泳道2和4)利用m1e7(泳道1和2)和m10d2(泳道3和4)被免疫沉降。通过结合于n-末端片段的m10d2检测分泌的gpc3。

图6显示了通过western印迹法利用gpc3的c-末端肽和gst的融合蛋白分析结合于gpc3的c-末端片段的抗体的表位的结果。gpc3核心蛋白的可溶性形式(泳道1)，gst(泳道2)，gc-1(泳道3)，gc-2(泳道4)，gc-3(泳道5)，gc-4(泳道6)和gc-5(泳道7)在还原条件下进行sds电泳，并利用m3c11和m11f1通过western印迹法进行检测。

图7显示了评价抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体对表达gpc3的cho细胞的cdc活性的结果。

图8显示了评价抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体对表达gpc3的cho细胞和hepg2的adcc活性的结果。

图9显示了利用获自效应细胞的小鼠骨髓评价gc33对人肝癌细胞系，huh-7的adcc活性的结果。

图10显示了评价gc33抗体对用人肝细胞瘤移植的小鼠模型的抗肿瘤活性的结果。

图11显示了评价小鼠-人嵌合抗体gc33对表达gpc3的cho细胞的cdc活性的结果。

图12显示了评价小鼠-人嵌合抗体gc33对hepg2的adcc活性的结果。

图13显示了用于分析gc33表位制备的gst-融合蛋白所包含的gpc3-衍生序列(gc-4，5,6，7，8，9，11，12，13和14)。

图14显示了通过sds-page在还原条件下分离gst,gc-7，8，9，11，12，13和14后利用gc33进行western印迹的结果。

图15显示了通过elisa评价人源化gc33对gpc3的结合活性的结果。

图16显示了概括同种型的抗体组以及对获自用gpc3的可溶形式免疫的小鼠的克隆进行elisa，biacore，facs和表位分析和免疫沉淀试验的结果。

图17显示了概括了同种型以及对获自用gc-3免疫的小鼠的克隆进行elisa，biacore，facs和表位分析的结果的抗体组。

图18显示了通过elisa评价修饰的抗体对gpc3核心蛋白的可溶性形式的结合活性的结果。用除了cys和met之外的17种氨基酸中的任一种取代位于人源化gc33轻链可变区中的cdr1内的gly34。

图19显示了评价小鼠-人嵌合抗体gc33，m3c11和m1e7对表达全长gpc3的cho细胞的cdc活性的结果。

图20显示了评价小鼠-人嵌合抗体gc33，m3c11和m1e7对表达全长gpc3的人肝细胞瘤细胞系sk-03的adcc活性的结果。

发明详述

抗体

本发明提供了如下(i)至(xi)中描述的抗体。

(i)包括具有含有下列seqidnos:(1)至(12)任一项中所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区的抗体∶

(1)seqidnos：123，124和125(gc33)，

(2)seqidnos：109，110和111(m11f1)，

(3)seqidnos：106，107和108(m3b8)，

(4)seqidnos：132，133和134(gc199)，

(5)seqidnos：106，135和136(gc202)，

(6)seqidnos：126，127和128(gc179)，

(7)seqidnos：129，130和131(gc194)，

(8)seqidnos：103，104和105(m13b3)，

(9)seqidnos：118，121和122(l9g11)，

(10)seqidnos：115，116和117(m6b1)，

(11)seqidnos：112，113和114(m5b9)，以及

(12)seqidnos：118，119和120(m10d2)。

在(1)至(12)所述的抗体中，优选(1)至(8)中所述的抗体，更优选(1)至(5)中所述的抗体，且尤其优选(1)中所述的抗体。(1)至(8)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的c-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第374个氨基酸至第580个氨基酸的肽)；且可作为治疗抗体。此外，(9)至(12)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的n-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第1个氨基酸至第373个氨基酸的肽)；且可作为诊断抗体。

(ii)包括具有含有下列seqidnos:(1)至(13)任一项中所示氨基酸序列的cdrs1，2和3的轻链可变区的抗体∶

(1)seqidnos：143，144和158(gc33)，

(2)seqidnos：143，144和145(m11f1)，

(3)seqidnos：140，141和142(m3b8)，

(4)seqidnos：167，168和169(gc199)，

(5)seqidnos：170，144和171(gc202)，

(6)seqidnos：159，160和161(gc179)，

(7)seqidnos：162，147和163(gc194(1))，

(8)seqidnos：164，165和166(gc194(2))，

(9)seqidnos：137，138和139(m13b3)，

(10)seqidnos：155，156和157(l9g11)，

(11)seqidnos：149，150和151(m6b1)，

(12)seqidnos：146，147和148(m5b9)，以及

(13)seqidnos：152，153和154(m10d2)。

在(1)至(13)所述的抗体中，优选(1)至(8)中所述的抗体，更优选(1)至(5)中所述的抗体，且尤其优选(1)中所述的抗体。(1)至(8)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的c-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第374个氨基酸至第580个氨基酸的肽)；且可作为治疗抗体。此外，(9)至(13)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的n-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第1个氨基酸至第373个氨基酸的肽)；且可作为诊断抗体。

(iii)选自下面(1)至(13)所述抗体的抗体∶

(1)包括具有含有seqidno：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：143，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc33)；

(2)包括具有含有seqidno：109,110和111所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：143，144和145所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m11f1)；

(3)包括具有含有seqidno：106,107和108所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：140，141和142所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m3b8)；

(4)包括具有含有seqidno：132,133和134所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：167，168和169所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc199)；

(5)包括具有含有seqidno：106,135和136所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：170，144和171所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc202)；

(6)包括具有含有seqidno：126,127和128所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：159，160和161所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc179)；

(7)包括具有含有seqidno：129,130和131所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：162，147和163所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc194(1))；

(8)包括具有含有seqidno：129,130和131所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：164，165和166所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(gc194(2))；

(9)包括具有含有seqidno：103,104和105所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：137，138和139所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m13b3)；

(10)包括具有含有seqidno：118,121和122所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：155，156和157所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(l9g11)；

(11)包括具有含有seqidno：115,116和117所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：149，150和151所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m6b1)；

(12)包括具有含有seqidno：112，113和114所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：146，147和148所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m5b9)；

(13)包括具有含有seqidno：118,119和120所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：152，153和154所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体(m10d2)；

在(1)至(13)所述的抗体中，优选(1)至(8)中所述的抗体，更优选(1)至(5)中所述的抗体，且尤其优选(1)中所述的抗体。(1)至(8)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的c-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第374个氨基酸至第580个氨基酸的肽)；且可作为治疗抗体。此外，(9)至(13)中所述的抗体识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的n-末端肽(含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第1个氨基酸至第373个氨基酸的肽)；且可作为诊断抗体。

(iv)具有下列(1)至(7)任一项所述重链可变区的抗体∶

(1)包括seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.a)；

(2)包括seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.c)；

(3)包括seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.f)；

(4)包括seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区(gc44vhver.h)；

(5)包括seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区(gc55vhver.i)；

(6)包括seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区(gc66vhver.j)；和

(7)包括seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区(gc77vhver.k)。

(1)至(7)所述的抗体中，尤其优选的是(2)至(7)所述的抗体。

(v)具有含有seqidno：90所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc33vlver.a)。

(vi)选自下面(1)至(7)所述抗体的抗体∶

(1)具有含有seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.a)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，

(2)具有含有seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.c)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，

(3)具有含有seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.f)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，

(4)具有含有seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.h)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，

(5)具有含有seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.i)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，

(6)具有含有seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.j)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体，和

(7)具有含有seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区(gc33vhver.k)和含有seqidno：92所示氨基酸序列的轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体。

(1)至(7)所述的抗体中，尤其优选的是(2)至(7)所述的抗体。

(vii)下列(15)至(7)任一项所述的抗体∶

(1)包括具有含有seqidnos：174，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(2)包括具有含有seqidnos：175，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(3)包括具有含有seqidnos：176，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(4)包括具有含有seqidnos：177，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(5)包括具有含有seqidnos：178，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(6)包括具有含有seqidnos：179，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(7)包括具有含有seqidnos：180，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(8)包括具有含有seqidnos：181，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(9)包括具有含有seqidnos：182，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(10)包括具有含有seqidnos：183，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(11)包括具有含有seqidnos：184，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(12)包括具有含有seqidnos：185，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(13)包括具有含有seqidnos：186，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(14)包括具有含有seqidnos：187，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，和

(15)包括具有含有seqidnos：188，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体。

(1)至(15)所述的抗体中，优选(15)中所述的抗体。

(viii)下列(1)至(15)任一项所述的抗体∶

(1)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：174，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(2)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：175，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(3)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：176，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(4)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：177，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(5)包括具有含有seqidnos：123,125和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：178，155和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(6)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：179，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(7)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：180，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(8)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：181，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(9)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：182，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(10)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：183，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(11)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：184，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(12)包括具有含有seqidnos：123,124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：185，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(13)包括具有含有seqidnos：123，124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：186，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，

(14)包括具有含有seqidnos：123，124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：187，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体，和

(15)包括具有含有seqidnos：123，124和125所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的重链可变区以及具有含有seqidno：188，144和158所示氨基酸序列的cdrs1,2和3的轻链可变区的抗体。

(1)至(15)所述的抗体中，优选(15)中所述的抗体。

(ix)下列(1)至(15)任一项所述的抗体∶

(1)具有含有seqidno：191所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(2)具有含有seqidno：192所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(3)具有含有seqidno：193所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(4)具有含有seqidno：194所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(5)具有含有seqidno：195所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(6)具有含有seqidno：196所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(7)具有含有seqidno：197所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(8)具有含有seqidno：198所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(9)具有含有seqidno：199所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(10)具有含有seqidno：200所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(11)具有含有seqidno：201所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(12)具有含有seqidno：202所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(13)具有含有seqidno：203所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(14)具有含有seqidno：204所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(15)具有含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体，

(1)至(15)所述的抗体中，优选(15)所述的抗体。

(x)具有选自下面(1)至(15)所述轻链可变区以及(1)至(7)所述重链可变区的抗体∶

(1)含有seqidno：191所示氨基酸序列的轻链可变区，

(2)含有seqidno：192所示氨基酸序列的轻链可变区，

(3)含有seqidno：193所示氨基酸序列的轻链可变区，

(4)含有seqidno：194所示氨基酸序列的轻链可变区，

(5)含有seqidno：195所示氨基酸序列的轻链可变区，

(6)含有seqidno：196所示氨基酸序列的轻链可变区，

(7)含有seqidno：197所示氨基酸序列的轻链可变区，

(8)含有seqidno：198所示氨基酸序列的轻链可变区，

(9)含有seqidno：199所示氨基酸序列的轻链可变区，

(10)含有seqidno：200所示氨基酸序列的轻链可变区，

(11)含有seqidno：201所示氨基酸序列的轻链可变区，

(12)含有seqidno：202所示氨基酸序列的轻链可变区，

(13)含有seqidno：203所示氨基酸序列的轻链可变区，

(14)含有seqidno：204所示氨基酸序列的轻链可变区，和

(15)含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区，

且重链可变区选自下述(1至(7)∶

(1)含有seqidno：84所示氨基酸序列的重链可变区，

(2)含有seqidno：85所示氨基酸序列的重链可变区，

(3)含有seqidno：86所示氨基酸序列的重链可变区，

(4)含有seqidno：87所示氨基酸序列的重链可变区，

(5)含有seqidno：88所示氨基酸序列的重链可变区，

(6)含有seqidno：89所示氨基酸序列的重链可变区，和

如上所述抗体中，抗体优选地具有含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区和含有seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区。

(xi)抗体，其中上述(i)至(x)任一项的氨基酸序列中的一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入，且其具有相当于任一(i)至(x)所述抗体的活性。

在本发明中，相当于(i)至(x)任一项所述抗体的活性是指与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的结合活性或对表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞的细胞毒性活性(例如，hepg2或表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的重组cho细胞，等)是相当的。

人源化抗体

本发明抗体的一个优选实施方案是结合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人源化抗体。人源化抗体可通过利用已知的方法制备。

人源化抗体也称为改造的人抗体，其通过将非-人哺乳动物的抗体例如小鼠抗体的互补决定区(cdr)移植到人抗体的cdr中进行制备。制备这种抗体的常规重组dna技术也是已知的(参见欧洲专利申请ep125023和国际专利申请wo96/02576)。

具体地，例如，在其中cdr获自小鼠抗体的情况下，通过pcr方法利用几个寡核苷酸作为引物来合成被设计用于将小鼠抗体的cdrs与人抗体的框架区(fr)连接的dna序列，引物已被制备使得具有与cdr和fr的两个末端彼此重叠的部分(参见国际专利申请wo98/13388中所述的方法)。

对于与cdr相连接的人抗体的框架区而言，选择允许互补决定区形成良好的抗原结合位点的那些。必要时，可取代抗体可变区的框架区中的氨基酸使得改造的人抗体的互补决定区可形成合适的抗原结合位点(sato,k.等,cancerres.(1993)53,851-856)。

人抗体的c区域可用作嵌合抗体或人源化抗体的c区域，例如，cγ1，cγ2，cγ3和cγ4可用于h链中，并且cκ和cλ可用于l链中。人抗体的c区也可被修饰以提高抗体的稳定性或其产量。用于人源化的人抗体可以是人抗体的任意同种型，例如，igg，igm，iga，ige和igd，优选为igg，更优选为igg1或igg3，且尤其优选为igg1。当抗体用作具有高细胞毒性活性的抗癌药物时，本发明的igg1是有效的(chemicalimmunology,65：88(1997))。

此外，制备人源化抗体后，可变区(例如，fr)或保守区中的氨基酸可以被另一个氨基酸取代。

人源化抗体中cdr的来源没有特别限制，且cdr可获自任意的动物。例如，可以利用获自小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、骆驼抗体等的序列。优选小鼠抗体的cdr序列。

对于抗体的人源化而言，当其保持原始抗体激动剂活性时通常难以进行人源化。然而在本发明中，成功获得了具有相当于原始小鼠抗体的激动剂活性的人源化抗体。由于人源化抗体在人体中的抗原性降低了，因此可用于将其施用于人用于治疗目的。

本发明中人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的优选实例包括，例如，具有seqidno：84(gc33vhver.a)，seqidno：85(gc33vhver.c)，seqidno：86(gc33vhver.f)，seqidno：87(gc33vhver.h)，seqidno：88(gc33vhver.i)，seqidno：89(gc33vhver.j)或seqidno：90(gc33vhver.k)所述的重链可变区的抗体或具有seqidno：92所示轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体。尤其优选的实例包括具有seqidno：84(gc33vhver.a)，seqidno：85(gc33vhver.c)，seqidno：86(gc33vhver.f)，seqidno：87(gc33vhver.h)，seqidno：88(gc33vhver.i)，seqidno：89(gc33vhver.j)或seqidno：90(gc33vhver.k)所示重链可变区和具有seqidno：92所示轻链可变区(gc33vlver.a)的抗体。

此外，人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的优选实例包括具有含有seqidno：90所示氨基酸序列的重链可变区和含有seqidno：205所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

本发明抗体的优选实施方案为结合于下列(1)至(8)任一项阐述的抗体结合的表位的抗体∶

(1)含有具有seqidno：62所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：73所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc33)，

(2)含有具有seqidno：26所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：48所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(m11f1)，

(3)含有具有seqidno：25所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：47所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(m3b8)，

(4)含有具有seqidno：60所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：71所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc199)，

(5)含有具有seqidno：61所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：72所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc202)，

(6)含有具有seqidno：63所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：74所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc179)，

(7)含有具有seqidno：64所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：75所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc194(1))，和

(8)含有具有seqidno：64所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：76所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc294(2)。更优选为结合于(1)至(5)任一项所述抗体结合的表位的抗体，且尤其优选为结合于(1)所述抗体结合的表位的抗体。

结合于上述任一项抗体结合的表位的抗体是有用的，因为其具有尤其高的细胞毒性。

(1)至(7)任一项所述的抗体结合于人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第524氨基酸到580氨基酸的区域。尤其是，其结合于第524氨基酸到第563氨基酸的区域。(1)至(5)任一项所述的抗体结合于人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第537氨基酸到第563氨基酸的区域。(1)所述的抗体结合于人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第544氨基酸到第553氨基酸的区域。尤其是，其结合于第546氨基酸到第551氨基酸的区域。

识别上述表位的抗体具有高细胞毒性，因此可用于治疗诸如癌症的疾病。尤其是，结合于从第546氨基酸到第551氨基酸的区域的抗体由于其具有特别高的细胞毒性因此是有用的。

因此，本发明包括结合于由人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第524氨基酸至第580氨基酸的区域，优选第524氨基酸至第563氨基酸的区域，更优选地537氨基酸至第563氨基酸的区域，进一步优选地第544氨基酸至第553氨基酸的区域，特别优选地第546氨基酸到第551氨基酸的区域的表位的抗体。

本发明另一个优选的实施方案是识别人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第524个氨基酸到第563个氨基酸的区域且不识别第537氨基酸到第563氨基酸的区域的抗体。

本发明进一步优选的实施方案是识别人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的第537个氨基酸到等563个氨基酸的区域且不识别第550氨基酸到第563氨基酸的区域的抗体。

可通过本领域技术人员已知的方法，例如，通过下述实施例所述的western印迹法进行抗体识别的表位的分析。

可通过本领域技术人员公知的方法来获得识别上述区域作为表位的抗体。例如，其可通过制备含有基于人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列的靶区域的氨基酸序列的肽以及利用肽作为免疫原制备抗体来获得，或通过常规方法制备抗体并测定获得抗体识别的表位，然后选择识别靶表位的抗体来获得。

本发明抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的优选实例为对表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞具有高adcc活性的抗体或具有高cdc活性的抗体。

这里所述的术语“高adcc活性”或“高cdc活性”是指本发明的抗体比已知的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体具有更高的adcc活性或更高的cdc活性。已知的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体包括例如，国际专利申请wo2004/22739中所述的m3c11和m1e07。

adcc活性或cdc活性可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，可通过铬释放实验测定。用于测定adcc活性的铬释放实验的具体条件没有特别限制，然而，例如可以利用下述实施例中所述的条件进行测定。

表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞的实例包括，例如肝细胞瘤细胞系诸如hepg2，在其中插入了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3编码基因的cho细胞系等等。为测定adcc活性，优选使用hepg2细胞系，且为测定cdc活性，优选使用表达gpc3的重组cho细胞系。表达gpc3的重组cho细胞系可以通过任意方法制备，其可以通过例如下述实施例所述方法进行制备。

在抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体用作抗癌药物的情况下，优选其与含有具有seqidno：62所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：73所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc33)具有相同水平的adcc活性。在抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体用作抗癌药物的情况下，优选其与含有具有seqidno：62所示氨基酸序列的重链可变区和具有seqidno：73所示氨基酸序列的轻链可变区的抗体(gc33)具有相同水平的cdc活性。

此外，本发明包括具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高结合活性的抗体。

在本发明中，抗体对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合活性可通过利用本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，可通过利用与biacore的表面等离子体共振进行测定。具体而言，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白固定在传感器芯片上与抗体反应，并且可将抗体和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3之间的相互作用计算为来自测定值的反应速度常数。此外，对于评价结合活性而言，可利用酶联免疫吸附测定(elisa)，酶免疫分析法(eia)，放射免疫测定法(ria)或荧光抗体技术。例如，当利用酶免疫分析法时，将含有待测抗体的样品，例如，产生待测抗体的细胞培养上清液或纯化的抗体添加到已经涂布有与此待测抗体结合的抗原的平板上。然后，添加用酶诸如碱性磷酸酶标记的二级抗体，并且温育和冲洗该平板。然后，添加酶底物诸如p-硝基苯基磷酸盐并测定吸光度，由此可评价抗原结合活性。结合活性的上限没有特别限制。然而，例如，上限可被限定在本领域技术人员能够确定的技术上合理的范围之内。可以理解该技术上合理的范围可随技术的发展而进一步扩大。

此外，在本发明中，待脱去酰氨基的氨基酸或邻近于待脱去酰氨基氨基酸的氨基酸可被另一个氨基酸取代，以例如抑制脱酰氨作用来增加抗体的稳定性。待脱去酰氨基的氨基酸包括，天冬酰胺和谷氨酰胺，优选天冬酰胺。邻近于天冬酰胺的氨基酸没有特别的限制且可以是任意的氨基酸。众所周知，天冬酰胺-甘氨酸序列对脱酰氨作用尤其敏感，因此，甘氨酸是优选作为邻近于天冬酰胺的氨基酸。用于取代的氨基酸没有特别的限制且可以是除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外的任意氨基酸。优选为除了缬氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。因此，在本发明中，当其中抗体被脱去酰氨基时，优选用除了天冬酰胺，谷氨酰胺，缬氨酸和脯氨酸之外的氨基酸进行取代。可参考例如国际专利申请wo03/057881进行通过氨基酸取代抑制脱酰氨作用。进行氨基酸取代来抑制脱酰氨作用时，优选保持取代之前的抗原结合活性。

抗体稳定化的另一个实施方案包括用另一个氨基酸取代谷氨酸。此外，在本发明中，发现当抗体重链的第6个氨基酸为谷氨酸时，抗体可通过用谷氨酰胺取代谷氨酸被显著地稳定化。因此，本发明也涉及一种通过取代用谷氨酰胺取代抗体重链的第6位的谷氨酸来稳定抗体的方法。抗体的氨基酸编号是本领域技术人员公知的(例如，kabat,e.a.等,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest",usdept.healthandhumanservices1983)。

本发明的抗体可以是结合抗体，其中抗体与多种分子诸如聚乙二醇(peg)、放射性物质和毒素相结合。这种结合抗体可通过对上述获得的抗体进行化学修饰来制备。现有技术中已形成了修饰抗体的方法。本发明的抗体包括这种结合的抗体。

本发明的抗体也可以是双特异性抗体(参见，例如，journalofimmunology，1994,152,5368-5374)。双特异性抗体可识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和其它抗原，或可以识别gpc3分子上的不同表位。

此外，本发明的抗体可携带融合于抗体的n-或c-末端的某些蛋白(clinicalcancerresearch,2004,10,1274-1281)。本领域技术人员可方便地选择融合于抗体的蛋白。

此外，本发明的抗体包括具有增强细胞毒性的抗体。具有增强细胞毒性的抗体的实例包括缺少海藻糖的抗体，具有附着于其糖链的二等分n-乙酰基氨基葡萄糖(glcnac)的抗体，以及具有通过取代fc区域中的一或多个氨基酸获得的改变的fcγ受体结合活性的抗体。这种具有增强细胞毒性的抗体可通过本领域已知的方法制备。

制备抗体的方法

可通过本领域技术人员公知的方法来制备结合于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗体。例如，可基本利用已知方法如下所述制备产生单克隆抗体所杂交瘤。也就是说，通过利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白或表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞作为致敏性抗原根据常规免疫方法免疫哺乳动物来制备杂交瘤。通过常规的细胞融合方法将由此获得的免疫细胞与已知的亲本细胞融合，然后通过常规筛选方法选择产生单克隆抗体的细胞。

具体而言，可如下所述制备单克隆抗体。首先，基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因/seqidnos:3和4所示的氨基酸序列获得磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白，将其用作致敏抗原来获得抗体。更具体地说，将编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入已知的表达载体系统中，并用载体转化合适的宿主细胞，然后通过已知的方法由宿主细胞或培养上清液纯化目的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白。

随后，将这些纯化的3蛋白用作致敏性抗原。或者，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的部分肽可用作致敏抗原。在这种情况下，也可以根据人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列通过化学合成来获得部分肽。

由本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位不局限于特定的表位。抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可识别任意的表位，只要该表位存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上。因此，任意的片段也可用作用于产生本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗原，只要其含有存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位。

用致敏性抗原免疫的哺乳动物没有特别的限制，但是优选地考虑其与用于细胞融合的亲本细胞的相容性进行选择。例如，通常使用啮齿类动物，诸如小鼠，大鼠和仓鼠，兔或猴。

根据已知的方法用致敏性抗原免疫动物。例如，通过一般方法进行免疫，其中哺乳动物用致敏性抗原进行腹膜内或皮下注射。具体而言，致敏性抗原用合适量的pbs(磷酸缓冲盐水)、生理盐水等稀释或悬浮在其中，必要时与产物混合合适量的标准佐剂诸如freund’s完全佐剂，然后乳化溶液以及每4到21天施用于哺乳动物若干次。此外，当用致敏性抗原免疫后还可以使用合适的载体。

如上所述免疫哺乳动物，然后确定血清中目的抗体增加的水平。随后，由哺乳动物收集免疫细胞，然后用于细胞融合。尤其优选的免疫细胞为脾细胞。

作为与上述免疫细胞融合的亲本配对细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。在这里优选使用的骨髓瘤细胞细胞系的实例包括各种已知的细胞系诸如p3(p3x63ag8.653)(j.immnol.(1979)123,1548-1550)，p3x63ag8u.1(currenttopicsinmicrobiologyandimmunology(1978)81,1-7)，ns-1(kohler.g.和milstein,c.eur.j.immunol.(1976)6,511-519),mpc-11(margulies.d.h.等,cell(1976)8,405-415)，sp2/0(shulman,m.等,nature(1978)276,269-270)，fo(dest.groth,s.f.等,j.immunol.methods(1980)35,1-21)，s194(trowbridge,i.s.j.exp.med.(1978)148,313-323)以及r210(galfre,g.等,nature(1979)277,131-133)。

上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可基本上根据已知的方法例如kohler和milstein等的方法来进行。(kohler.g.和milstein,c.,methodsenzymol.(1981)73,3-46)。

更具体地，上述细胞融合在标准的营养培养液中例如细胞-融合促进剂的存在下来进行。作为细胞-融合促进剂，例如，使用聚乙二醇(peg)，日本仙台病毒(hvj)。如需要，可添加佐剂诸如二甲亚砜来进一步提高融合效率。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例可适当地选择。例如，优选免疫细胞的数量大于骨髓瘤细胞的数量1到10倍。用于上述细胞融合的培养液包括，例如，适于上述骨髓瘤细胞系生长的rpmi1640培养液或mem培养液，或用于此类细胞培养的标准培养液。此外，血清补充物诸如胎牛血清(fcs)可用于此混合物中。

如下所述进行细胞融合。在上述培养液中充分地混合预先确定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，添加已被预加热为约37℃的peg(例如，具有约1000到6000的平均分子量)溶液(30到60％(w/v)的常规浓度)，然后混合溶液，由此形成了目的融合细胞(杂交瘤)。随后，依次添加合适的培养液，然后重复通过离心除去上清液的步骤来除去不利于杂交瘤生长的用于细胞融合等的试剂。

通过在标准选择培养溶液诸如hat培养液(一种含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养杂交瘤筛选由此获得的杂交瘤。将在上述hat培养液进行的培养持续足以使得除了目的杂交瘤之外的细胞(未融合的细胞)死亡的一段时间(通常，几天至几周)。随后，进行标准极限稀释法来筛选产生目的抗体的单克隆的杂交瘤。

除用抗原免疫非-人动物来获得杂交瘤的方法之外，具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合活性的目的人抗体还可以通过用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3体外致敏人淋巴细胞，以及使致敏的淋巴细胞与具有永久分裂潜能的人骨髓瘤细胞融合来获得(参见jp-b-1-59878)。在另一方法中，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗原施用于具有所有人抗体基因的转基因动物来获得产生抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞，然后进行无限增殖，且可从无限增殖化的产生抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞获得磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的人抗体(参见国际专利申请wo94/25585，wo93/12227,wo92/03918和wo94/02602)。

由此制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在标准培养溶液中传代培养，或可以在液氮中长时间保藏。

由杂交瘤获得单克隆抗体的方法的一个实例包括培养杂交瘤和根据标准方法由培养上清液获得单克隆抗体。另一方法包括将杂交瘤施用于与杂交瘤相容的哺乳动物来使其增殖，以及由腹水中获得单克隆抗体。前一方法适于获得高纯度抗体，而后一方法适于抗体的批量生产。

通过遗传工程方法由杂交瘤克隆抗体基因、将基因插入到合适的载体中、将载体引入到宿主体内、然后使宿主产生重组抗体也可以制备重组抗体(例如，参见vandamme,a.m.等,eur.j.biochem.(1990)192，767-775,1990)。

具体地说，由产生抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的杂交瘤分离编码抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的可变(v)区的mrna。通过已知的方法诸如胍超离心法(chirgwin,j.m.等,biochemistry(1979)18,5294-5299)或agpc法(chomczynski,p.等,anal.biochem.(1987)162,156-159)分离mrna，且制备总rna，然后利用mrna纯化试剂盒(pharmacia)等制备目的mrna。此外还可以利用quickprepmrna纯化试剂盒(pharmacia)直接制备mrna。

利用逆转录酶从由此获得的mrna合成抗体v区的cdna。可利用amv逆转录酶第一链cdna合成试剂盒(seikagakucorporation)等合成cdna。此外，例如5'-amplifinderrace试剂盒(clontech)，利用pcr的5'-race法(frohman,m.a.等,proc.natl.acad.sci.usa(1988)85,8998-9002,belyavsky,a.等,nucleicacidsres.(1989)17,2919-2932)可用于合成和扩增cdna。

从由此获得的pcr产物纯化目的dna片段，然后连接于载体dna。由产物制备重组载体，然后将载体导入到ecoli等中，并筛选菌落，由此制备目的重组载体。然后通过已知的方法诸如二脱氧核苷酸链终止法测定目的dna的核苷酸序列。

获得编码目的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的v区的dna之后，将此dna整合到含有编码目的抗体的恒定区(c区)的dna的表达载体中。

为产生本发明所用的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，将抗体基因整合到表达载体中使基因在包括例如增强子和启动子的基因表达调控区域的调控下表达。然后，用表达载体转化宿主细胞，由此使宿主表达抗体。

可通过将编码h链的多核苷酸或编码l链的多核苷酸整合到表达载体中，然后同时用载体转化宿主细胞，或通过将编码h链和l链的多核苷酸整合到单个表达载体中，然后用载体转化宿主细胞来表达抗体基因(参见国际专利申请wo94/11523)。

多核苷酸

在另一个方面，本发明提供了编码本发明抗体的重链可变区或轻链可变区的多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸具有seqidnos:11-21,33-43，55-59，65-70和77–83任一所示的核苷酸序列。此外，与上述多核苷酸在严谨条件下杂交以及编码具有相当于本发明抗体活性的抗体的多核苷酸也在本发明的范围内。

本发明的多核苷酸没有特别的限制，只要其编码本发明的抗体即可。其是由大量核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)组成的聚合物。其可含有除了天然存在的碱基之外的碱基。本发明的多核苷酸可用于通过遗传工程方法来产生抗体。此外，本发明的多核苷酸可用作探针来筛选具有相当于本发明抗体的功能的抗体。也就是说，编码本发明的抗体的多核苷酸或其部分片段可用作探针，通过诸如杂交技术、基因扩增技术(例如,pcr)来获得在严谨条件下杂交于多核苷酸以及编码具有相当于本发明抗体的活性的抗体的dna。此类dna也包括在本发明的多核苷酸之内。

杂交技术(sambrook,j.等,molecularcloning2nded.,9.47-9.58,coldspringharborlab.press,1989)是本领域技术人员公知的。杂交条件的实例包括，例如，低度严谨条件。低度严谨条件是，杂交后进行冲洗时，例如，42℃，0.1xssc和0.1％sds的条件，优选50℃，0.1xssc和0.1％sds的条件。更优选的杂交条件的实例包括，例如，高度严谨条件。高度严谨条件是，例如，65℃，5xssc和0.1％sds的条件。在这些条件下，可预期在较高温度下有效地获得具有高同源性的多核苷酸。顺便提及，有很多影响杂交严谨性的因素，诸如温度和盐的浓度，且本领域技术人员可通过适当地选择这些因素来获得类似的严谨性。

由通过这种杂交技术和基因扩增方法获得的多核苷酸编码的本发明抗体的抗体功能等同物通常与抗体具有氨基酸序列的高度同源性。本发明的抗体也包括与本发明抗体功能等同以及与抗体的氨基酸序列具有高度同源性的抗体。高度同源性是指通常在氨基酸水平具有至少50％或更高同一性，优选75％或更高的同一性，更优选85％或更高的同一性，且进一步更优选95％或更高的同一性。为测定多肽的同源性，可使用在文献(wilbur，w.j.和lipman,d.j.,proc.natl.acad.sci.usa(1983)80,726-730)中所描述的算法。

本发明也提供了含有本发明多核苷酸的载体。此载体可用于制备本发明的抗体。至于本发明的载体，当e.coli用作宿主时，例如，其没有特别的限制只要其具有用于在e.coli中扩增以在大量的e.coli(例如，jm109，dh5α，或xllblue)中产生和扩增载体的"ori"，以及具有用于选择转化的e.coli的标记基因(例如，可通过药物诸如氨苄青霉素，四环素，卡那霉素或氯霉素鉴定的耐药基因)。载体的实例包括m13-系列载体，puc–系列载体，pbr322，pbluescript，pcr-script等等。此外，pgem–t，pdirect以及pt7也可用于亚克隆和提取如上所述的cdna和载体。

对于本发明的载体而言，表达载体是尤其有用的。例如，用于在e.coli中表达的表达载体应具有上述在e.coli扩增的特性。此外，当ecoli，诸如jm109，dh5α，hb101，或xl1-blue被用作宿主细胞时，载体必需具有一个启动子，例如，lacz启动子(ward等，nature(1989)341，544-546；fasebj.(1992)6，2422-2427)，arab启动子(better等，science(1988)240，1041-1043)，t7启动子等等，其可在e.coli中有效地表达目的产物。这种载体的实例包括pgex-5x-1(pharmacia)，“qiaexpress系统”(qiagen)，pegfp，pet(在这种情况下，宿主优选为表达t7rna聚合酶的bl21)等，以及如上所述的载体。

此外，载体也可含有用于多肽分泌的信号序列。对于用于蛋白分泌的信号序列，当其中多肽在e.coli的周质中产生时，可使用pelb信号序列(leis.p.等,j.bacteriol(1987)169,4379)。可通过利用，例如，氯化钙法和电穿孔法将载体导入到宿主细胞中。

除e.coli之外，例如，获自哺乳动物的表达载体(例如，pcdna3(invitrogen)和pegf-bos(nucleicacidsres.(1990)18(17)，p5322)，pef和pcdm8)，获自昆虫细胞的表达载体(例如，“bac-到-bac杆状病毒表达系统”(gibcobrl)和pbacpak8)，获自植物的表达载体(例如，pmh1和pmh2)，获自动物病毒的表达载体(例如，phsv，pmv和padexlcw)，获自逆转录病毒的表达载体(例如，pzipneo)，获自酵母的表达载体(例如，“pichia表达试剂盒”(invitrogen)，pnv11和sp-q01)以及获自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如，ppl608和pkth50)可用作本发明的载体。

为在动物细胞诸如cho细胞，cos细胞，nih3t3细胞等中表达载体，载体中必须具有细胞中表达所需的启动子，诸如sv40启动子(mulligan等，nature(1979)277,108)，mmtv-ltr启动子，eflα启动子(mizushima等,nucleicacidsres.(1990)18，5322)，cmv启动子等等，且更优选地具有用于选择转化细胞的标记基因(诸如可通过药物诸如新霉素或g418鉴定的耐药基因)。具有这种特性的载体实例包括，例如，pmam,pdr2,pbk-rsv,pbk-cmv,poprsv和pop13。

此外，为在细胞稳定地表达基因和同时扩增基因拷贝数，将具有dhfr基因的载体(例如，pchoi，等等)导入到缺乏该核酸合成途径的cho细胞中来弥补该缺陷，并且用氨甲喋呤(mtx)扩增。使用此外，为了基因的瞬时表达，利用在染色体上具有表示sv40t抗原的基因的cos细胞用具有sv40复制起点的载体(诸如pcd)实现转化。作为复制起点，可以使用获自多形瘤病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒(bpv)等的复制起点。此外，为在宿主细胞系统中扩增基因的拷贝数，表达载体可包括，选择性标记，氨基苷转移酶(aph)基因，胸苷激酶(tk)基因，e.coli黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(ecogpt)基因，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等等。

为制备本发明的抗体，将载体导入到宿主细胞中。对载体所导入的宿主细胞没有特别限制，但包括例如，e.coli或任意的各种动物细胞。例如，宿主细胞可用作本发明抗体的产生或表达的生产系统。至于多肽制备的生产系统，有体外生产系统和体内生产系统。体外生产系统包括利用真核细胞的生产系统和利用原核细胞的生产系统。

使用真核细胞时，例如，可使用动物细胞，植物细胞或真菌细胞。已知的动物细胞包括哺乳动物细胞诸如cho细胞(j.exp.med.(1995)108,945),cos细胞，3t3细胞，骨髓瘤细胞，幼仓鼠肾脏(bhk)细胞，hela细胞和vero细胞，两栖动物细胞诸如非洲蟾蜍卵母细胞(valle,等,nature(1981)291,358-340)，或昆虫细胞诸如sf9，sf21和tn5。在本发明中，优选地使用cho-dg44，cho-dxb11，cos7细胞，bhk细胞。在动物细胞中，为了进行大量的表达，尤其优选cho细胞。可通过例如磷酸钙法，deae-葡聚糖法，阳离子核糖体dotap(boehringermannheim)，电穿孔法，脂转染法等将载体导入到宿主细胞中。

对于植物细胞而言，例如，获自烟草的细胞被作为蛋白质生产系统，其可用于愈伤组织培养。真菌细胞的实例包括酵母诸如酵母属，更具体地为酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(saccharomycespombe)，以及丝状真菌诸如曲霉，更具体地为黑曲霉。

使用原核细胞时，可以利用细菌细胞生产系统。细菌细胞的实例包括大肠杆菌(e.coli)诸如jm109，dh5α和hb101，以及枯草芽孢杆菌。

重组抗体的制备

本发明的抗体可通过培养上述宿主细胞来制备。通过体外培养用目的多核苷酸转化的细胞来获得抗体。培养可根据已知的方法进行。动物细胞的培养基包括，例如dmem，mem，rpmi1640和imdm。血清补充物诸如fbs或胎牛血清(fcs)可组合使用，或可以使用无血清培养基。培养期间的ph值优选为约6至8。培养通常在约30至40℃进行约15到200小时，如果需要更换培养基，通风和搅拌。

另一方面，在体内产生多肽的系统包括例如利用动物的生产系统和利用植物的生产系统。将目的多核苷酸导入到此动物或植物中，且在动物或植物的体内产生多肽并且回收。在这里使用的术语“宿主细胞”包括此类动物和植物。

当使用动物时，可以获得利用哺乳动物或昆虫的生产系统。可使用山羊，猪，羊，小鼠和牛等哺乳动物(vickiglaser,spectrumbiotechnologyapplications，1993)。转基因动物也可用作哺乳动物。

例如，目的多核苷酸被制备作为与编码在奶中先天产生的多肽诸如山羊β酪蛋白的基因融合的基因。然后，将含有这些融合基因的dna片段注入山羊胚胎中，并将胚胎移植到雌性山羊体内。从由接收胚胎的山羊所产的转基因山羊或其后代产生的奶中获得目的抗体。为增加含有由转基因山羊产生的抗体的奶的量，可将激素给予所需的转基因山羊。(ebert,k.m.等,bio/technology(1994)12,699-702)。

此外，对于昆虫，例如，可使用蚕。使用蚕时，用已插入编码目的抗体的多核苷酸的杆状病毒感染蚕。目的抗体可获自蚕的体液(susumu,m.等,nature(1985)315,592-594)。

使用植物时，例如，可使用烟草。当使用烟草时，将编码目的抗体的多核苷酸插入到用于植物的表达载体，例如pmon530，然后将载体导入到细菌诸如根癌土壤杆菌中。然后，用细菌感染诸如花烟草的烟草，由此可从烟草的叶子中获得目的抗体(julian,k.-c.ma等,eur.j.immunol.(1994)24,131-138)。

由此获得的抗体可从宿主细胞的内部或外部(培养基，等等)分离，然后可纯化为基本上纯的和均一的抗体。通过多肽纯化中通常使用的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过任意方法包括层析柱，过滤，超滤，盐析，溶剂沉淀，溶剂萃取，蒸馏，免疫沉淀，sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点聚焦，透析，重结晶，及其组合来进行多肽的分离和纯化。

色谱层析的实例包括，例如，亲和层析，离子交换色谱，疏水层析，凝胶-过滤，反相层析，吸附色谱(strategiesproteinpurificationandcharacterization∶alaboratorycoursemanual.eddanielr.marshak等,coldspringharborlaboratorypress,1996)。这些色谱层析可利用液相色谱诸如hplc和fplc来进行。用于亲和层析的柱的实例包括a蛋白柱或g蛋白柱。a蛋白柱的一个实例为hyperd，poros，琼脂糖f.f.(pharmacia)。

此外，抗体纯化之前或之后，如需要可通过合适的蛋白-修饰酶的作用来修饰抗体或部分切除肽。用于此目的的蛋白-修饰酶包括，例如，胰蛋白酶，糜蛋白酶，赖氨酰内肽酶，蛋白激酶，葡糖苷酶。

诊断方法

在另一方面，本发明提供了一种通过利用本发明的抗体检测试验样品中的gpc3蛋白来诊断诸如肿瘤的疾病的方法。

在这里使用的检测包括定量检测和非-定量检测。非-定量检测包括，例如，仅仅确定是否存在gpc3蛋白，确定是否存在特定量或更多的gpc3蛋白，测定gpc3蛋白量与另一样品(例如，对照样品)的gpc3量的对比。定量检测包括测定gpc3蛋白的浓度，测定gpc3蛋白的量。

试验样品没有特别的限制，只要其是可能含有gpc3蛋白的样品即可，然而优选的为由活生物体诸如哺乳动物收集的样品，且更优选的为由人收集的样品。试验样品的具体实例可包括，例如血液，组织液，血浆，血管外液体，脑的液体，滑液，胸膜液，血清，淋巴液，唾液，优选血液、血清和血浆。此外，由诸如活生物体收集的细胞培养液获得的试验样品也包括在本发明的试验样品中。

待诊断的癌症没有特别的限制，且具体的实例可包括肝癌，胰腺癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病和淋巴瘤，优选肝癌。待检测的gpc3没有特别的限制，且可以是全长gpc3或其片段。在检测gpc3的片段时，其可以是n-末端片段或c-末端片段，然而，优选n-末端片段。此外，gpc3蛋白也可以是添加硫酸乙酰肝素的gpc3或gpc3核心蛋白。

检测试验样品所含gpc3蛋白的方法没有特别的限制，然而，优选地通过利用抗-gpc3抗体的免疫方法进行检测。免疫方法的实例包括，例如，放射免疫测定，酶免疫分析，荧光免疫测定，发光免疫测定，免疫沉淀，比浊免疫测定。优选为酶免疫分析，且尤其优选酶联免疫吸附测定(elisa)(例如，夹心elisa)。可通过本领域技术人员公知的方法来识别上述的免疫方法诸如elisa。

利用抗-gpc3抗体的常规检测方法包括在支持体上固定抗-gpc3抗体，向该处添加试验样品，温育该支持体来允许抗-gpc3抗体和gpc3蛋白彼此结合，冲洗支持体，以及检测gpc3蛋白与支持体通过抗-gpc3抗体的结合来试验样品中的gpc3蛋白。

抗-gpc3抗体和gpc3蛋白之间的结合通常在缓冲液中进行。本发明中使用的缓冲液包括，例如，磷酸盐缓冲液，tris缓冲液。通常利用例如，在4℃至室温下1小时至24小时的条件下进行温育。可通过任意方法进行温育后的冲洗，只要其不抑制gpc3蛋白和抗-gpc3抗体之间的结合，利用例如含有表面活性剂诸如吐温20的缓冲液。

在本发明检测gpc3蛋白的方法中，除用于gpc3蛋白测定的试验样品之外可提供对照样品。对照样品包括不含有gpc3蛋白的阴性对照样品和含有gpc3蛋白的阳性对照样品。在这种情况下，可以通过比较由不含有gpc3蛋白的阴性对照样品获得的结果与含有gpc3蛋白的阳性对照样品获得的结果来检测试验样品中的gpc3蛋白。也可通过获得对照样品和试验样品的检测结果数值以及比较这些数值来定量检测试验样品中所含的gpc3蛋白。

检测gpc3蛋白质与支持体通过抗-gpc3抗体结合的一个优选实施方案的是利用用可检测标记标记的抗-gpc3抗体的方法。例如，通过将试验样品与固定在支持体上的抗-gpc3抗体接触，冲洗支持体，然后利用特异性结合于gpc3蛋白的标记的抗体检测gpc3来检测gpc3蛋白。

抗-gpc3抗体的标记可通过已知的常规方法来进行。本领域技术人员公知的可检测标记的实例包括荧光染料，酶，辅酶，化学发光物质或放射性物质。具体的实例可包括放射性同位素(³²p，¹⁴c，¹²⁵i，³h，¹³¹i等等)，荧光素，若丹明，丹磺酰氯，伞形酮，荧光素酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，辣根过氧化酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，微过氧化物酶，生物素等等。其中生物素被用作可检测的标记时，优选添加生物素标记的抗体，然后进一步添加与酶诸如碱性磷酸酶结合的抗生物素蛋白。

具体而言，将含有抗-gpc3抗体的溶液添加给支持体诸如微板以使抗-gpc3抗体被固定。冲洗后，微板用例如bsa封闭以防止蛋白的非特异性结合。再次冲洗微板，然后将试验样品添加于微板。温育后，冲洗微板，然后添加标记的抗-gpc3抗体。适当地温育后，冲洗微板，然后检测微板上保留的标记的抗-gpc3抗体。可通过本领域技术人员公知的方法检测蛋白。例如，在抗体用放射性物质标记的情况下，蛋白通过液体闪烁法或ria法进行检测。在其中抗体用酶标记的情况下，可通过添加底物以及用吸光度读数器检测底物的酶促变化诸如显色来检测蛋白。在抗体用荧光物质标记的情况下，可通过荧光计检测蛋白。

本发明的gpc3蛋白检测方法的特别优选的实施方案为利用用生物素和抗生物素蛋白标记的抗-gpc3抗体的方法。特定地，将含有抗-gpc3抗体的溶液添加给支持体诸如微板以使得抗-gpc3抗体被固定在其上。冲洗后，平板用例如bsa封闭以防止蛋白的非特异性的结合，再次冲洗平板，然后将试验样品添加于平板。温育后，冲洗微板，然后添加生物素标记的抗-gpc3抗体。适当温育后，冲洗微板，然后添加结合于酶诸如碱性磷酸酶或过氧化物酶的抗生物素蛋白。温育后，冲洗微板，然后添加结合于抗生物素蛋白的酶的底物。然后，通过底物的酶促变化作为指示的方式检测gpc3蛋白。

本发明检测gpc3蛋白的方法的另一实施方案为利用特异性结合于gpc3蛋白的初级抗体和特异性结合于初级抗体的次级抗体的方法。例如，通过将试验样品与固定在支持体上的抗-gpc3抗体接触，温育和冲洗支持体，然后利用初级抗-gpc3抗体和特异性结合于初级抗体的次级抗体来检测冲洗后的结合gpc3蛋白。在这种情况下次级抗体优选地用可检测的标记进行标记。

具体地，将含有抗-gpc3抗体的溶液添加给支持体诸如微板以使抗-gpc3抗体被固定在其上。冲洗后，平板用例如bsa封闭以防止蛋白的非特异性的结合。再次冲洗平板，然后将试验样品添加于平板。温育后，冲洗微板，然后添加初级抗-gpc3抗体。适当地温育后，冲洗微板，然后添加特异性初级抗体的次级抗体。适当地温育后，冲洗微板，然后检测微板上保留的次级抗体。次级抗体的检测可通过上述方法来进行。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供了含有本发明抗体的药物组合物。含有本发明抗体的药物组合物可用于与细胞增殖有关的疾病诸如癌症的治疗和/或预防，且对肝癌的治疗和/或预防是尤其有用的。在本发明的抗体被用作药物组合物时，本领域技术人员可通过公知的方法将抗体配制成剂型。例如，药物组合物可以以无菌注射溶液或与水的悬浮液或其它药用溶液的形式注射使用。例如，抗体可通过与药用载体或溶剂，诸如无菌水，生理盐水，植物-油，乳化剂，悬浮液，表面活性剂，稳定剂，香料，赋形剂，载体，防腐剂，粘合剂等适当地混合制备成药物实施细则普遍接受的所需单位剂型配制成剂型。选择这些制剂中活性成分的量来施用所示范围内的合适剂量。

根据普通药物实施细则通过利用载体诸如注射用蒸馏水配制注射用无菌组合物。

注射用水溶液的实例包括例如，生理盐水，葡萄糖，及其它包括助剂，诸如d-山梨糖醇，d-甘露糖，d-甘露糖醇和氯化钠的等渗液体。它们可与合适的增溶剂诸如醇，具体为乙醇，多元醇诸如丙二醇和聚乙二醇，以及非离子表面活性剂诸如聚山梨酸酯80(tm)和hco-50一起组合使用。

麻油或豆油可用作油质的液体且可与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苯甲醇相组合使用。其可以与缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液，镇痛剂诸如盐酸普鲁卡因，稳定剂诸如苯甲醇或苯酚，或抗氧化剂一起配制。制备的注射剂通常注入到合适的安瓿瓶中。

施用方法优选地为非肠道的，且其特定的实例包括注射，经鼻施用，经肺部施用，透皮施用等等。注射制剂可通过静脉注射，肌肉注射，腹膜内注射，皮下注射等系统地或局部地施用。

施用的方法可根据患者的年龄和症状适当地选择。例如，含有抗体或编码该抗体的多核苷酸的药物组合物的一个剂量可选择0.0001mg到1,000mg/公斤体重的范围。或者，例如，剂量可选自0.001mg到100,000mg/患者体重的范围，尽管其并不局限于这些数值。施用的剂量和方法可根据患者的体重、年龄和症状进行变化，且由本领域技术人员适当地选择。

所有在此说明书中引用的专利和参考文献都引入作为参考。在本申请要求优先权的日本专利申请no.2004-203637的说明书和图中公开的所有内容都在这里引入作为参考。

实施例

本发明参考下述实施例进行更详细的描述。然而，本发明不局限于这些实施例。

实施例1

人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)的cdna克隆

利用通过常规方法由结肠癌细胞系caco2制备的第一链cdna作为模板，通过pcr反应用advantage2试剂盒(clontech)扩增编码人gpc3的全长cdna。更具体地，将50μl的含有2μl获自caco2的cdna，1μl的正义引物(gatatc-atggccgggaccgtgcgcaccgcgt∶seqidno:1)，1μl的反义引物(gctagc-tcagtgcaccaggaagaagaagcac∶seqidno:2)，5μl的advantage210xpcr缓冲液，8μl的dntp混合物(1.25mm)和1.0μl的advantage聚合酶混合物的反应混合物用于包括94℃1分钟，63℃30秒和68℃3分钟的35个循环。利用pgem-teasy载体系统i(promega)将pcr反应的扩增产物插入ta载体，pgem-teasy。利用abi3100dna测序仪测定序列。以这种方法，分离了编码全长人gpc3的cdna。seqidno:3所示序列表示人gpc3基因的核苷酸序列且seqidno:4所示序列表示人gpc3蛋白的氨基酸序列。

实施例2

可溶性gpc3的制备

作为用于产生抗-gpc3抗体的免疫蛋白质，制备gpc蛋白的可溶形式，其中c-末端侧的疏水性区域(564-580氨基酸)被缺失。

通过利用全长人gpc3cdna作为模板，利用反义引物(atagaattccaccatggccgggaccgtgcgc∶seqidno:5)和正义引物进行pcr反应，向其中添加ecori识别顺序和kozak序列(ataggatcccttcagcggggaatgaacgttc∶seqidno:6)。获得的pcr片段(1711bp)被克隆到pcxnd2-flag中。通过将用于pchoi的dhfr基因表达的区域(hirata等，febsletter1994；356；244-248)插入到pcxn2的hindiii位点(niwa等，gene1991；108；193-199)以及添加flag标记序列到多克隆位点的下游，来设计pcxnd2-flag使其能表达flag-标记的蛋白。构建的表达质粒dna导入到cho细胞系，dxb11中，且通过用500μg/ml遗传霉素选择来获得高水平表达gpc3可溶形式的cho细胞系。利用1700-cm²滚瓶进行高水平表达gpc3可溶形式的cho细胞系的大规模培养，以及回收培养上清液用于抗体纯化。培养上清液被用于deae琼脂糖速流柱(amersham)以及，冲洗后，用含有500mmnacl的缓冲液洗脱抗体，以及利用抗-flagm2琼脂糖亲合凝胶(sigma)亲合纯化。用200μg/mlflag肽进行洗脱。用centriprep-10(millipore)浓缩洗脱物之后，通过利用superdex200hr10/30(amersham)凝胶过滤除去flag肽。最后，利用deae琼脂糖速流柱浓缩滤液以及用无吐温20的pbs(含有500mmnacl)洗脱来进行缓冲液更换。

实施例3

可溶性gpc3核心蛋白的制备

通过硫酸乙酰肝素修饰gpc3使其成为巨大分子。为除去抗-gpc3抗体筛选中的抗硫酸乙酰肝素的抗体，制备在硫酸乙酰肝素-结合部位具有点突变的gpc3核心蛋白的可溶形式并用于筛选中。

利用上述可溶性的gpc3(1-563)作为模板，通过装配pcr法制备用ala取代第495和第509位置处ser残基的cdna，其中设计引物来在c-末端添加his标记。将获得的cdna克隆到pcxnd3载体中。通过在pcxn2的hindiii位点插入表达pchoi的dhfr基因区域来构建pcxnd3。构建的表达质粒dna被导入到dxb11细胞系中且通过用500μg/ml遗传霉素选择获得了高水平表达可溶性gpc3核心蛋白的cho细胞系。

利用1700-cm²滚瓶进行大规模培养以及回收培养上清液用于抗体纯化。培养上清液被用于q琼脂糖速流柱(amersham)。冲洗之后，抗体用含有500mmnacl的磷酸盐缓冲液洗脱，以及利用螯合琼脂糖速流柱(amersham)进行亲合性纯化。用10到150mm梯度的咪唑洗脱抗体。最后，利用q琼脂糖速流柱浓缩洗脱物以及用含有500mmnacl的磷酸盐缓冲液洗脱。

还原条件下的sds聚丙烯酰胺凝胶电泳显示70kda，40kda和30kda的三个条带。利用abi492蛋白测序仪(appliedbiosystems)进行氨基酸测序的结果表明30kda条带对应于gpc3的第359及其下游或第375及其下游的氨基酸序列，此表明gpc3在arg358和ser359之间或lys374和val375之间被裂解，因此，其被分离成40kda的n-末端片段和30kda的c-末端片段。

实施例4

表达全长人gpc3的cho细胞系的制备

为获得利用流式细胞术评价结合活性的细胞系，建立了表达全长gpc3的cho细胞系。

将10微克的全长人gpc3基因表达载体和60μl的superfect(qiagen)混合。形成复合体之后，通过将其添加于cho细胞系，dxb11,进行基因导入。在co2温育箱中培养24小时之后，利用含有0.5mg/ml最终浓度的遗传霉素和10％fbs的αmem(gibcobrl)开始进行选择。收集产生的遗传霉素-抗性菌落以及通过有限稀释法进行细胞克隆。溶解各细胞克隆以及利用抗-gpc3抗体通过western印迹法证实全长的人gpc3。以这种方法，获得了稳定表达的细胞系。

实施例5

通过elisa评价结合活性

用包被缓冲液(0.1mol/lnahco3(ph9.6)，0.02％(w/v)nan3)将可溶性gpc3核心蛋白稀释到1μg/ml并添加至免疫微板中以及置于4℃过夜来包被微板。用稀释缓冲液(50mmol/ltris-hcl(ph8.1),1mmol/lmgcl2,150mmol/lnacl,0.05％(v/v)tween20,0.02％(w/v)nan3,1％(w/v)bsa)封闭微板之后,添加抗-gpc3抗体并置于室温下1小时。用冲洗缓冲液(0.05％(v/v)吐温20，pbs)冲洗之后，添加用碱性磷酸酶标记的抗-小鼠igg抗体(zymed)并维持在室温1小时。用冲洗缓冲液冲洗之后，添加用底物缓冲液(50mmol/lnahco3(ph9.8)，10mmol/lmgcl2)稀释为1mg/ml的sigma104(sigma)并维持在室温1小时进行显色。然后利用benchmarkplus(bio-rad)测定吸光度(405nm处，参考波长655nm)。

实施例6

用可溶性的gpc3免疫以及杂交瘤的选择

因为人gpc3和小鼠gpc3在氨基酸水平显示出94％的高度同源性，其被认为如果免疫标准的小鼠难以获得抗-gpc3抗体。因此，自身免疫性疾病小鼠，mrl/mpjummcrj-lpr/lpr小鼠，(以下简称mrl/lpr小鼠，购自charlesriverjapan,inc)被用作免疫动物。在7周或8周龄时开始免疫。为进行第一次免疫，制备100μ/头的gpc3的可溶形式和利用freund’s完全佐剂(fca,bectondickinson)乳化以及皮下施用。两周后，以50μg/头制备gpc3的可溶形式和利用freund’s不完全佐剂(fia,bectondickinson)乳化以及进行皮下施用。然后，每周进行另外的免疫总计5次。对于免疫小鼠中的两个来说，用pbs稀释gpc3的可溶形式为50μg/头，然后通过尾部静脉内施用作为最后免疫。在最后免疫后的第4天，切除脾来获得脾脏细胞，其与小鼠骨髓瘤细胞，p3-x63ag8u1(p3u1，购自atcc)以2:1的比例混合。通过逐步添加peg1500(rochediagnostic)进行细胞融合。将rpmi1640培养基(gibcobrl)小心地添加至稀释的peg1500中，且通过离心除去peg1500后，将细胞悬浮在含有10％fbs的rpmi1640培养基中并且以100μl/孔接种到96-孔培养平板中。在第二天，将含有10％fbs，1xhat培养基补充物(sigma)和0.5xbm-condimedh1杂交瘤克隆补充物(rochediagnostic)(以下简称hat培养基)的rpmi1640以100μl/孔添加。2，3和5天后，用hat培养基取代一半的培养液。7天后，利用培养上清液进行筛选。通过elisa利用包被有gpc3核心蛋白的可溶形式的免疫微板进行筛选。通过有限稀释法单克隆阳性克隆。结果，获得了11个具有强结合活性的抗gpc3的抗体克隆(m3c11，m13b3,m1e7,m3b8,m11f1,l9g11,m19b11,m6b1,m18d4,m5b9和m10d2)。

实施例7

抗-gpc3抗体的同种型测定和纯化

通过抗原-依赖的elisa利用immunopuremonoclonalantibodyisotyping试剂盒i(pierce)测定同种型。抗体的纯化进行如下。将用补充fbs(ultralowigg)(gibcobrl)的hat培养基培养的杂交瘤的培养上清液吸附于hitrapproteinghp(amersham)，并用结合缓冲液(20mm磷酸钠(ph7.0))冲洗。用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸-hcl(ph2.7))洗脱抗体。洗脱物立即用中和缓冲液(1mtris-hcl(ph9.0))中和，以及抗pbs渗析一昼夜时间以进行缓冲液更换。

实施例8

通过elisa评价结合活性

为了方便地评价由此获得的抗-gpc3抗体的结合活性，检测抗体抗含有固定在其上的核心蛋白可溶形式的免疫微板的依赖浓度-的结合。添加10μg/ml浓度的3-倍系列稀释(总计12个稀释度)的纯化抗体，并添加抗-小鼠igg抗体作为次级抗体。利用sigma104进行显色。因为显色程度的变化取决于显色时间，分析1小时后准确测定的数据。所有抗体显示出浓度-依赖的显色。绘制抗体的浓度和显色程度之间的相互关系图且通过利用分析软件graphpadprism获得近似的曲线。测定其ec50值作为结合活性的指数。所有克隆的ec50值显示于图16中。

实施例9

通过流式细胞术评价结合活性

用1mmedtaph8.0(gibco)/pbs分离细胞并以1×10⁶细胞/ml悬浮在facs缓冲液(1％fbs/pbs)中。悬浮液以100μl/孔分配到multiscreen–hvfilterplate(millopre)中并通过离心除去上清液。添加稀释到合适浓度的抗-gpc3并在冰上反应30分钟。用facs缓冲液冲洗细胞一次并添加fitc-标记的抗-小鼠igg抗体并在冰上反应30分钟。反应后，以500rpm离心细胞1分钟，并除去上清液。将细胞悬浮在400μl的facs缓冲液中并用于流细胞计数。epicseliteesp(beckmancoulter)被用作流式细胞仪。用正向散射和侧向散射的柱状图设置活细胞群体的门控。如图1所示，抗-gpc3抗体(m3c11，m11f1)强烈地结合表达gpc3的cho细胞且不结合亲本cho细胞，此表明抗体特异性结合于存在于细胞膜上的gpc3。此外，抗体显示出对肝细胞瘤细胞系，hepg2(购自atcc)和huh-7(购自healthscienceresearchresourcesbank)的结合活性，表明抗体可特异性识别肝细胞瘤。通过流式细胞术测定的获自用gpc3的可溶形式免疫的小鼠的克隆的结合活性显示于图16，其中显示了柱状图的5μg/ml抗体浓度的x-轴的值。

实施例10

通过竞争性elisa进行表位分类

通过竞争性elisa对获得的抗体按照表位进行分类。抗体被利用生物素标记试剂盒(roche)进行生物素酰化。用包被缓冲液将gpc3核心蛋白的可溶形式稀释至1μg/ml并以100μl/孔添加至微板中以及4℃保藏过夜来包被微板。在第二天，添加200μl的底物缓冲液进行封闭。将微板置于4℃过夜或更长时间并将抗-gpc3抗体以100μl/孔添加于微板以及在室温下反应1小时。然后，不冲洗微板，添加10μl的10μg/ml的生物素标记的抗-gpc3抗体并进一步反应1个小时。微板用300μl/孔的冲洗缓冲液冲洗3次。用稀释缓冲液稀释ap-链霉亲和素结合物(zymed)至1000-倍并以100μl/孔添加以及在室温下反应1小时。微板用300μl/孔的冲洗缓冲液冲洗5次。用底物缓冲液将sigma104稀释至1mg/ml并以100μl/孔添加。在室温下温育1小时后，测定吸光度(在405nm处，参考波长655nm)。

竞争性elisa的结果显示于图2中。对竞争性抑制50％或更多的生物素酰化抗体结合的抗体而言，人们认为其表位在三维构象中紧密靠近。作为根据抗8种类型生物素酰化抗体的结合显色的竞争性抑制模式进行分类的结果，将获自用gpc3的可溶形式免疫的小鼠的11个克隆分成5个组(a,b,c,d和e)(图16)。

实施例11

通过western印迹法进行表位分类

gpc3核心蛋白的可溶形式在还原条件下被用于10％sds-pagemini(tefco)和电泳。利用trans-blotsd半干电泳转移细胞(bio-rad)将其转入immobilon-p(millipore)。用tbs-t(0.05％吐温20，tbs)简单地冲洗膜之后，在含有5％脱脂乳的tbs-t中振荡1小时。膜在tbs-t中振荡约10分钟，然后添加用含有1％脱脂乳的tbs-t稀释的各抗-gpc3抗体并且振荡膜1小时。膜用tbs-t冲洗并且在用含1％脱脂乳的tbs-t稀释的hrp-抗-小鼠igg抗体(amersham)的溶液中振荡1小时，然后用tbs-t冲洗。利用ecl-plus(amersham)进行显色并且利用hyperfilmecl(amersham)检测。

如图3所示，l9g11被鉴定为结合于n-末端侧的抗体，因为其结合于约40kda的条带。m3c11被鉴定为结合于c-末端侧的抗体，因为其结合于约30kda的条带。所有基于竞争性elisa属于c,d或e组的抗体结合于n-末端侧，且所有属于a或b组的这些抗体结合于c-末端侧(图16)。l9g11在western印迹中比结合于n-末端侧的其它抗体具有更高的检测灵敏度，表明此抗体可用于通过western印迹检测n-末端片段。

实施例12

gpc3的分泌形式的检测

因为据发现gpc3是在第358氨基酸残基或第374氨基酸残基处裂解，本发明人猜测gpc3的分泌形式被分泌到患有肝癌的患者的血液中。因此，构建gpc3夹心elisa系统来检测gpc3的分泌形式。

免疫微板被用10μg/ml的抗-gpc3抗体包被并且通过底物缓冲液进行封闭。免疫微板在室温下保藏几个小时或在4℃过夜保藏之后，添加hepg2的培养上清液并且在室温下温育1小时。免疫微板用300μl/孔的冲洗缓冲液冲洗3次，并且添加稀释到10μg/ml的生物素标记的抗-gpc3抗体以及在室温下温育1小时。免疫微板用300μl/孔的冲洗缓冲液冲洗3次，并添加ap-链霉亲和素以及在室温下温育1小时。用300μl/孔的冲洗缓冲液冲洗免疫微板5次。利用ampak(dako)根据所附的规程进行显色以及利用微板读数器测定吸光度。结合于n-末端侧的抗体(m6b1,m19b11和m18d4)和结合于c-末端侧的抗体(m3c11,m13b3和m3b8)被组合构建五个夹心elisa系统。这些组合中的每一个在利用gpc3的分泌形式的标准曲线中显示出相当的敏感性。利用hepg2的培养上清液评价这些系统。以约1μg/ml的高浓度与结合于n-末端侧的抗体的组合检测gpc3的分泌形式(图4)。用结合于c-末端侧的抗体的组合检测的浓度是低的，表明n-末端片段主要存在于gpc3的分泌形式中。

随后，利用抗-gpc3抗体免疫沉淀hepg2的培养上清液来检测gpc3的分泌形式。在使用结合于n-末端片段的m10d2的情况中，检测到40kda的gpc3的分泌形式(图5)。另一方面，在使用结合于c-末端片段的m1e7的情况中，没有检测到gpc3的分泌形式。对所有获得的gpc3抗体进行免疫沉淀试验。所有结合于n-末端片段的抗体强烈地检测到gpc3的分泌形式，而利用结合于c-末端片段的抗体没有检测到或微弱地检测到gpc3的分泌形式(图16)。通过免疫沉淀可检测gpc3的分泌形式的抗体被期望用作诊断肝细胞瘤的抗体。此外，几乎不能检测gpc3的分泌形式的抗体被期望可用于开发具有adcc活性和cdc活性的治疗抗体，因为此抗体可迁移至肝细胞瘤病变组织而没有被捕获在血液存在的gpc3的分泌形式中。

实施例13

抗-gpc3抗体的可变区的克隆

利用由产生抗-gpc3抗体的杂交瘤提取的总rna通过rt-pcr扩增抗-gpc3抗体的可变区。利用rneasyplantmini试剂盒(qiagen)由杂交瘤的1×10⁷个细胞提取总rna。通过利用1μg的总rna，利用smartracecdna扩增试剂盒(clontech)和下列的任一合成的寡核苷酸扩增5’-末端基因片段∶

互补于小鼠igg1恒定区序列的合成的寡核苷酸mhc-igg1∶

gggccagtggatagacagatg(seqidno:7)；

互补于小鼠igg2a恒定区序列的合成的寡核苷酸mhc-igg2a∶

caggggccagtggatagaccgatg(seqidno:8)；

互补于小鼠igg2b恒定区序列的合成的寡核苷酸mhc-igg2b∶

caggggccagtggatagactgatg(seqidno:9)；以及

互补于小鼠κ链恒定区序列的合成的寡核苷酸κ∶

gctcactggatggtgggaagatg(seqidno:10)。

在42℃进行反转录反应1小时和30分钟。pcr混合物(50μl)含有5μl的10×advantage2pcr缓冲液，5μl的10×通用引物amix，0.2mmdntps(datp,dgtp,dctp和dttp),1μl的advantage2polymerasemix(均来自clontech)，2.5μl的反转录反应产物和10pmol的合成寡核苷酸mhc-igg1，mhc-igg2a，mhc-igg2b或κ。进行pcr：5个包括94℃30秒，94℃5秒和72℃3分钟的循环，5个包括94℃5秒，70℃10秒和72℃3分钟的循环，以及25个包括94℃5秒，68℃10秒和72℃3分钟的循环。最后，反应产物在72℃加热7分钟。利用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)由琼脂糖凝胶纯化各pcr产物，克隆到pgem-teasy载体(promega)中，以及测定核苷酸序列。

m3c11，m13b3,m1e7,m3b8,m11f1,m19b11,m6b1,m18d4,m5b9,m10d2和l9g11的h链可变区的核苷酸序列分别显示于seqidnos:11,12,13,14,15,16,17,18,19,20和21中，其氨基酸序列分别显示于seqidnos:22,23,24,25,26,27,28,29,30,31和32中。其l链的核苷酸序列分别显示于seqidnos:33,34,35,36,37,38,39,40,41,42和43中,且其氨基酸序列分别显示于seqidnos:44,45,46,47,48,49,50,51,52,53和54中。

实施例14

利用gst-融合蛋白进行表位分类

为进行结合于c-末端片段的抗体表位的具体分析，制备gpc3的依次缩短的c-末端肽与gst的融合蛋白，即gc-1(由ser495至lys563)，gc-2(由gly510到lys563)，gc-3(由ala524到lys563)，gc-4(由gly537到lys563)和gc-5(由ser550到lys563)。将gpc3的c-末端区域克隆到pgex-4t-3(amersham)中来构建质粒dna，其中gpc3的c-末端区域被连接于gst的c-末端侧。将质粒dna导入到dh5α中，由此获得了转化体。然后，添加1mm的iptg于对数生长期的转化体的培养物中来诱导gst-融合蛋白的表达。培养2小时之后收集细菌细胞。通过超声处理搅匀细胞，并用xl-80超离心机(beckman,70.1ti转子)以35,000rpm离心30分钟。然后，回收培养物上清液并用gstpurificationmodules(amersham)纯化。通过sds-page在还原条件下分离由此纯化的gst-融合蛋白，并用抗-gpc3抗体进行western印迹(图6)。m3c11和m1e7检测到gc-1和gc-2，而它们没有检测到gc-3，gc-4和gc-5，此表明这些抗体的表位包含在gc-2的区域中，且gc-3的区域是不充分的。m3b8和m11f1检测到gc-1，gc-2，gc-3和gc-4，而它们没有检测到gc-5，此表明这些抗体的表位包含在gc-4的区域中，且gc-5的区域是不充分的。各抗体可结合的gst-融合蛋白的最小区域列于图16的“western印迹”的列中。

实施例15

抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体的制备

将抗-gpc3抗体的h链和l链的序列连接于人igg1和κ链恒定区的序列。通过利用互补于各抗体的h链可变区的5'-末端核苷酸序列且具有一个kozak序列的合成寡核苷酸，以及互补于3’-末端核苷酸序列并具有nhei位点的合成的寡核苷酸进行pcr。将获得的pcr产物克隆到pb-ch载体中，其中人igg1恒定区被插入到pbluescriptks(+)载体(toyobo)中。小鼠h链可变区和人h链(γ1链)恒定区通过nhei位点连接。将制备的h链基因片段克隆到表达载体pcxnd3中。另一方面，通过利用互补于各抗体的l链可变区的5'-末端核苷酸序列且具有一个kozak序列的合成寡核苷酸，以及互补于3’-末端核苷酸序列并具有bsiwi位点的合成的寡核苷酸进行pcr。将获得的pcr产物克隆到pb-cl载体中，其中人κ链恒定区被插入到pbluescriptks(+)载体(toyobo)中。人l链可变区和恒定区通过bsiwi位点连接。将制备的l链基因片段克隆到表达载体pucag中。通过将由用限制性酶bamhi降解pcxn(niwa等，gene1991；108∶193-200)获得的2.6kbp片段克隆到puc19载体(toyobo)的bamhi位点中获得了此pucag载体。

为制备用于抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体的表达载体，通过用限制性酶hindiii(takarashuzo)降解含有l链基因片段的pucag载体获得基因片段，并且克隆到含有h链基因的pcxnd3的hindiii位点中。此质粒将在动物细胞中表达新霉素-抗性基因，dhfr基因和抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体。

稳定表达抗体的cho细胞系(dg44细胞系)de制备如下。通过电穿孔法利用genepulserii(bio-rad)将基因导入到细胞中。在冰上冷却通过将25μg的各抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体的表达载体和0.75ml的悬浮在pbs中的cho细胞溶液(1×10⁷细胞/ml)混合获得的混合物10分钟时间，并转入透明小容器。然后，施加1.5kv和25μfd电容的脉冲。在室温下恢复10-分钟后，将电穿孔细胞悬浮在40ml的含有1×ht补充物(invitrogen的)cho-s-sfmii培养基(invitrogen)中。用相同培养基稀释悬浮液至50-倍，并以100μl/孔分配到96-孔培养微板中。在co2恒温箱(5％co2)中培养24-小时后，添加0.5mg/ml的遗传霉素(invitrogen)并且培养细胞2周时间。由具有遗传霉素抗性转化的细胞群落的孔获取培养上清液并且通过如下所述的浓度测定法测定igg的量。连续扩大培养高产的细胞系来获得稳定表达抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体的细胞系。大规模培养细胞系并收集培养上清液。利用hitrapproteinghp(amersham)纯化各抗-gpc3小鼠-人嵌合抗体。

实施例16

补体-依赖的细胞毒性活性(cdc活性)的测定

16.1人白蛋白佛罗拿缓冲液(havb)的制备

在milli-q水中，溶解12.75g的nacl(最高级，wakopurechemicals)，0.5625g的na-巴比妥(最高级，wakopurechemicals)和0.8625g的巴比妥(最高级，wakopurechemicals)至终体积200ml并且在121℃高压灭菌20分钟。然后，添加100ml的高压灭菌的热milli-q水。ph为7.43(推荐ph∶7.5)。溶液被用作5×佛罗拿缓冲液。在50ml的milli-q水中，溶解0.2205g的cacl2·2h2o(最高级，junseichemical)至终浓度0.03mol/l，其被用作cacl2溶液。在50ml的milli-q水中，溶解1.0165g的mgcl2·6h2o(最高级，junseichemical)至终浓度0.1mol/l，其被用作mgcl2溶液。在milli-q水中，溶解100ml的5×佛罗拿缓冲液，4ml的人血清白蛋白(25％buminate(注册商标)，人血清白蛋白的浓度∶250mg/ml，baxterhealthcare)，2.5ml的cacl2溶液，2.5ml的mgcl2溶液，0.1g的kcl(最高级，junseichemical)0.5g的葡萄糖(d(+)-葡萄糖，无水葡萄糖，最高级，wakopurechemicals)至500ml的终体积，其被用作havb。过滤灭菌后，havb保藏在5℃的预定温度。

16.2靶细胞的制备

将在实施例4中制备的表达全长人gpc3的cho细胞培养在含有核酸(+)(gibco)补充10％fbs和0.5mg/ml遗传霉素(gibco)的α-mem培养基中。利用细胞解离液(invitrogencorp)由平皿分离细胞，以1×10⁴细胞/孔分配到96-孔平底微板(falcon)的各孔中，并培养3天时间。培养后，添加5.55mbq的铬-51，并将细胞培养在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中1小时时间。用havb冲洗这些细胞两次，添加50μl的havb并用作靶细胞。

16.3铬释放试验(cdc活性)

用havb稀释各嵌合抗体来制备40μg/ml的抗体溶液。向靶细胞添加50μl的各抗体溶液，并在冰上保持15分钟。随后，向各孔中添加100μl已经用havb稀释的来自健康志愿者外周血液的人血清至25％的终浓度(抗体的终浓度∶10μg/ml)，并维持在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中90分钟。离心微板后，由各孔收集100μl的上清液，利用γ计数器测定放射性。通过下列公式获得特定的铬释放速率。

特定的铬释放速率(％)＝(a-c)×100/(b-c)

“a”表示各孔中的放射性(cpm)，“b”表示在将100μl的2％np-40水溶液(nonidetp-40，编号no.252-23,nacalaitesque)和50μl的havb添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值，且“c”表示将150μl的havb添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值。试验一式三份并计算cdc活性(％)的平均值和标准偏差。

结果显示于图7中。抗-gpc3嵌合抗体的9种类型中，m3b8和m11f1，其为识别c-末端侧的抗体，显示出强烈的抗表达gpc3的cho细胞的cdc活性，然而，在其它抗体中没有观察到cdc活性。m3b8和m11f1属于基于竞争性elisa称为“b”的组，且可发现显示出强烈cdc活性的重要的表位。

实施例17

利用获自人外周血液的pbmc测定adcc活性

17.1人pbmc的制备

获自健康志愿者的肝素化外周血液用pbs(-)稀释至2-倍，并覆盖在ficoll-paquetmplus(amersham)上。在20℃以500×g离心30分钟后，收集为单核白血球级分的中间层。冲洗细胞3次，悬浮在10％fbs/rpmi中并用作人pbmc溶液。

17.2靶细胞的制备

利用胰蛋白酶-edta(invitrogen)由平皿分离在10％fbs/rpmi1640培养基中培养的hepg2细胞，以1×10⁴细胞/孔分配到96-孔u型底微板(falcon)的各孔中，并培养2天时间。将在实施例4中制备的表达全长人gpc3的cho细胞培养在补充10％fbs和0.5mg/ml遗传霉素(gibco)的α-mem培养基(gibco)中。利用细胞解离液(invitrogencorp)由平皿分离细胞，以1×10⁴细胞/孔分配到96-孔平底微板(falcon)的各孔中，并培养3天时间。将铬-51(5.55mbq)添加于各细胞中并将细胞在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中培养1小时。这些细胞用培养基冲洗一次，添加50μl的10％fbs/rpmi1640培养基并用作靶细胞。

17.3铬释放试验(adcc活性)

向靶细胞中添加50μl的以不同浓度制备的抗体，并在冰上反应15分钟。随后，以5×10⁵细胞/孔添加100μl的人pbmc溶液，并将细胞在37℃培养在5％二氧化碳气体培养箱中4小时。培养后，离心微板，并利用γ计数器测定100μl培养上清液中的放射性。通过下列公式获得特定的铬释放速率。

特定的铬释放速率(％)＝(a-c)×100/(b-c)

“a”表示各孔中的放射性(cpm)，“b”表示在将100μl的2％np-40水溶液(nonidetp-40，编号no.252-23,nacalaitesque)和50μl的10％fbs/rpmi培养基添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值，且“c”表示将150μl的10％fbs/rpmi培养基添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值。试验一式三份并计算cdc活性(％)的平均值和标准偏差。结果显示于图8中。抗-gpc3嵌合抗体的9种类型中，识别c-末端侧的抗体具有显示强烈的adcc活性的倾向。

实施例18

用gc-3免疫以及杂交瘤的选择

在获得的抗-gpc3抗体中，仅仅m11f1和m3b8显示强烈的cdc活性，表明cdc活性为表位依赖的。为获得具有adcc活性和cdc活性两者的抗体，含有m11f1和m3b8表位的gst-融合蛋白，称为gc-3，被用于免疫。通过上述方法纯化大量的gc-3。通过利用superdex75(amersham)凝胶过滤将缓冲液转变为pbs。获得的产物被用作免疫蛋白质。用gc-3根据上述方法免疫三只balb/c小鼠(购自charlesriverjapan,inc)和三只mrl/lpr小鼠。为进行第一次免疫，以100μg/头制备gc-3并利用fca进行乳化，其被进行皮下施用。两周后，以50μg/头制备gc-3并利用fia乳化，其被皮下施用。第5次免疫后，通过尾部经静脉内施用免疫蛋白质进行最后免疫(50μg/头)。细胞融合后，通过elisa利用包被gpc3核心蛋白的可溶形式的免疫微板进行杂交瘤的筛选。通过有限稀释法单克隆阳性克隆。结果，获得了5个具有抗gpc3的强结合活性的抗体克隆(gc199,gc202,gc33,gc179和gc194)。

利用hitrapproteinghp由杂交瘤的培养上清液中纯化抗体，并根据上述方法进行分析。通过elisa利用包被gpc3核心蛋白的可溶形式的免疫微板计算ec50值，以及通过流式细胞术测定5μg/ml的柱状图的x-轴的值(图17)。根据通过竞争性elisa进行的表位分类，抗体被分类到b组(gc199,gc202和gc33)以及新的表位组f(gc179和gc194)。利用gst-融合蛋白进行的表位分类表明gc199,gc202和gc33检测到gc-1，gc-2，gc-3和gc-4，而它们没有检测到gc-5，此表明这些抗体的表位以与m11f1和m3b8表位的相同方式包含在gc-4的区域中，且gc-5的区域是不充分的。另一方面，gc179和gc194检测到gc-1，gc-2和gc-3，而它们没有检测到gc-4和gc-5，此表明这些抗体的表位包含在gc-3的区域中，且gc-4的区域是不充分的。各抗体可结合的gst-融合蛋白的最小区域列于图17的“western印迹”的列中。

根据上述方法克隆gc199,gc202,gc33,gc179和gc194的h链和l链可变区，并测定它们的序列。对于gc194的l链，克隆了2种类型的序列。gc199,gc202,gc33,gc179和gc194的h链可变区的核苷酸序列分别显示于seqidnos:55,56,57,58和59中，且其氨基酸序列分别显示于seqidnos:60,61,62,63和64中。gc199,gc202,gc33,gc179，gc194(1)以及gc194(2)的l链可变区的核苷酸序列分别显示于seqidnos:65,66,67,68,69和70中，且其氨基酸序列分别显示于seqidnos:71,72,73,74,75和76中。

此外，通过与已知抗体的氨基酸序列的数据库相比较来寻找这些氨基酸序列的同源性，由此测定它们的cdr区域如下。

实施例19

利用获自小鼠骨髓的效应细胞测定adcc活性

19.1获自小鼠骨髓的效应细胞的溶液的制备

由scid小鼠(cleajapan,inc,雄性，10周龄)的股骨收集骨髓细胞，并以5×10⁵细胞/ml悬浮在10％fbs/rpmi1640培养基中。分别添加10ng/ml和50ng/ml的小鼠gm-csf(peprotech)和人il-2(peprotech)，并将细胞在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中培养5天。培养后，用刮刀刮取细胞并用培养基一次。然后，将细胞以5×10⁶细胞/ml悬浮在10％fbs/rpmi1640培养基中，并用作获自小鼠骨髓的效应细胞溶液。

19.2靶细胞的制备

人肝细胞瘤细胞系，huh-7，用含有10％fbs(thermotrace)的dmem培养基(sigma)维持和继代培养。利用细胞解离液(invitrogen)由平皿分离细胞，以1×10⁴细胞/孔分配到96-孔u型底微板(falcon)的各孔中，并培养1天时间。培养后，添加5.55mbq的铬-51，并将细胞培养在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中1小时时间。这些细胞用培养基冲洗一次，添加50μl的10％fbs/rpmi1640培养基并用作靶细胞。

19.3铬释放试验(adcc活性)

向靶细胞中添加50μl的以不同浓度制备的抗体，并在冰上反应15分钟。随后，以5×10⁵细胞/孔添加100μl的得自小鼠骨髓的效应细胞溶液(5×10⁵细胞/孔)，并将细胞在37℃5％二氧化碳气体培养箱中培养4小时。培养后，离心微板，并利用γ计数器测定100μl培养上清液中的放射性。通过下列公式获得特定的铬释放速率。特定的铬释放速率(％)＝(a-c)×100/(b-c)

“a”表示各孔中的放射性(cpm)，“b”表示在将100μl的2％np-40水溶液(nonidetp-40，编号no.252-23,nacalaitesque)和50μl的10％fbs/rpmi培养基添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值，且“c”表示将150μl的10％fbs/rpmi培养基添加于靶细胞的微孔中的放射性(cpm)的平均值。试验一式三份并计算adcc活性(％)的平均值和标准偏差。

结果显示于图9中。其揭示当抗体浓度为0.1μg/ml或更高时，gc33抗体显示出adcc活性，并显示比gc199抗体更强的活性。

实施例20

gc33抗体对用人肝细胞瘤移植的小鼠模型的抗肿瘤活性

20.1用人肝细胞瘤移植的小鼠模型的制备

在含有1:1比例的dmem培养基和matrigel(bdbioscience)的溶液中制备5×10⁷细胞/ml的人肝细胞瘤细胞系huh-7。在前一天，将100μl的抗-asialogm1抗体溶液(wakopurechemicals，一瓶用1ml的注射蒸馏水溶解然后添加4ml的生理盐水)腹膜内施用于scid小鼠(雄性，5周龄，cleajapan,inc)。用100μl的上述细胞悬液(5×10⁶细胞/小鼠)在腹部区域皮下移植小鼠。

20.2抗体的制备和施用

从细胞移植后20天开始，在抗体溶液制备当天以0.5mg/ml(给药5mg/kg的组)和以0.1mg/ml(给药1mg/kg组)与pbs(-)一起以10ml/kg通过尾部静脉一周一次施用于用人肝细胞瘤细胞移植的小鼠模型，持续3周时间。作为阴性对照，通过类似的方式以10ml/公斤通过尾部静脉一周一次施用pbs(-)(载体)，持续3周时间。两个组各包括6个小鼠。

20.3抗肿瘤效果的评价

用肿瘤体积随时间的变化以及最后施用后1周的肿瘤重量来评价gc33抗体对用人肝细胞瘤细胞移植的小鼠模型的抗肿瘤效果。通过下列公式计算肿瘤体积。

肿瘤体积＝(长轴)×(短轴)×(短轴)/2

如图10所示，与介质组相比较在gc33抗体组中观察到对肿瘤发育的显著抑制。

因此，gc33被显示对用人肝细胞瘤细胞移植的小鼠模型有抗癌作用。

实施例21

gpc3小鼠-人嵌合抗体的制备

利用互补于5’-末端核苷酸序列并具有kozak序列和hindiii位点的合成寡核苷酸，以及互补于3’-末端核苷酸序列并具有bamhi位点的合成寡核苷酸通过pcr扩增gc33的h链和l链。用hindiii和bamhi降解后，将获得的pcr产物克隆到插入了人igg1恒定区的表达载体hefgβ1和插入了人κ链恒定区的表达载体hefgκ中(sato等，molimmunol.1994；371-381)。根据上述方法将载体导入cho细胞(dg44细胞系)，并建立稳定表达的细胞系。由培养上清液利用hitrapproteinghp(amersham)来纯化抗体。通过人igg夹心elisa利用山羊抗-人igg(biosource)和山羊抗-人igg碱性磷酸酶共轭物(biosource)测定培养上清液中igg的浓度，以及通过与市售的人igg(cappel)比较来测定浓度。

实施例22

利用gc33小鼠-人嵌合抗体测定cdc活性和adcc活性

根据实施例16和17中描述的方法，测定gc33,m3c11和m1e7小鼠-人嵌合抗体的cdc活性和adcc活性。作为靶细胞，表达全长gpc3的cho细胞用于测定cdc活性以及hepg2用于测定adcc活性。结果分别显示于图11和图12。其揭示在任一试验系统中，gc33与其它两种抗体相比显示出强烈的cdc活性和adcc活性。

实施例23

gc33的表位分析

为具体测定gc33的表位，制备gpc3和gst的更短的c-末端肽，并通过western印迹进行分析。制备的包含在gst-融合蛋白中的得自gpc3的肽序列显示于图13。因为gc33可结合gc4(aa537-563)，但是不能结合于gc-5(aa550-563)，人们认为表位位于含有至少aa537-550区域部分的区域中。首先，制备肽gc-6(gnsqqatpkdneis(seqidno:93)),gc-7(gnsqqatp(seqidno:94)),gc-8(qqatpkdn(seqidno:95))和gc-9(tpkdneis(seqidno:96))。制备正向寡dna和反向寡dna，其被设计为ecori识别序列的切割位点连接于5’末端以及sali识别序列的切割位点连接于3’末端。通过especoligoservice进行寡dnas的合成。用c-18盒纯化dna，进行5’末端磷酸化并用于分析。将25微升的正向寡dna(10μm)和25μl的反向寡dna(10μm)混合并在94℃反应5分钟，37℃10分钟，室温下反应15分钟，然后维持在4℃10分钟来使正向寡dna和反向寡dna退火。通过测定插入子与载体3:1摩尔比处的吸光度来测定寡核苷酸的浓度。寡核苷酸被克隆到ecori-和sali-降解的pgex4t-3中，并确定核苷酸序列。根据上述方法制备gst-融合蛋白，并利用gluthationesepharose4b进行纯化。通过sds-page在还原条件下分离纯化的蛋白，并通过western印迹利用gc33进行分析。结果，抗体gc33不能强烈地检测任意的gst-融合蛋白，表明c-末端侧的较长序列是gc33的结合所需要的(图14)。基于以上所述预测，以相同的方式制备和评价gc-11(atpkdneist(seqidno:97)),gc-12(pkdneistfh(seqidno:98)),gc-13(dneistfhnl(seqidno:99))和gc-14(eistfhnlgn(seqidno:100))。结果，gc-11,gc-12和gc-13更强烈地结合于gc33，表明其gc33的表位位于由gpc3c-末端的第544到第553(pkdneistfh)的序列内。

实施例24

gc33的人源化

抗体序列数据获自公开的kabat数据库(ftp∶//ftp.ebi.ac.uk/pub/databaseskabat/)以及获自immunogenetics数据库(imgt)。h链可变区l链可变区单独地进行同源性检索。结果发现h链可变区与dn13具有高度同源性(smithson等,molimmunol.1999；36:113-124)，并且发现l链可变区与人免疫球蛋白κ轻链vlj区域，部分的cds，登录号ab064105的克隆∶k64，的igkmrna具有高度同源性。与ab064105具有高度同源性的登录号s40357的信号序列被用作l链的信号序列。gc33的互补决定区(以下简称cdr)被移植到这些人抗体的骨架区域(以下简称fr)来制备人源化抗体。

具体地，大约50个碱基的合成寡核苷酸dnas被设计为它们的约20个碱基是杂交的以及这些合成的寡核苷酸dnas被通过pcr装配在一起来制备编码每一可变区的基因。它们在插入5’-末端合成寡核苷酸dna的末端中的hindiii位点以及插入3’-末端合成的寡核苷酸dna的末端的bamhi位点处被降解。片段被克隆到其中克隆了人igg恒定区的表达载体hefgβ1或其中克隆了人κ链恒定区的表达载体hefgβ1中(sato等,molimmunol.1994；371-381)。人源化gc33构建体的h链和l链如上被分别命名为ver.a。其h链和l链均为ver.a(ver.a/ver.a)的人源化gc33的结合活性比具有小鼠gc33可变区(小鼠/小鼠)的抗体的结合活性低。抗体被构建为其中小鼠gc33序列和ver.a序列在h链和l链是嵌合组合的(小鼠/ver.a，ver.a/小鼠)，以及评价它们的结合活性。结果，观察到在ver.a/小鼠中结合活性下降了，表明结合活性的降低取决于h链的氨基酸取代(图15)。然后，制备修饰的h链ver.c,ver.f,ver.h,ver.i,ver.j,ver.k。所有这些人源化gc33显示出相当于具有小鼠gc33可变区的嵌合抗体的结合活性(图15)。人源化gc33h链可变区ver.a,ver.c,ver.f,ver.h,ver.i,ver.j,ver.k的核苷酸序列分别显示于seqidnos:77,78,79,80,81,82和83中，且其氨基酸序列分别显示于seqidnos:84,85,86,87,88,89和90中。人源化gc33l链可变区ver.a的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示于seqidnos:91和92中。在人源化gc33h链可变区ver.i，ver.j和ver.k中，第6个谷氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。这些抗体的热稳定性显著增加。

实施例25

人源化gc33l链的修饰

对于蛋白的脱酰胺作用而言，已知脱酰胺作用的反应速度常数依赖于初级序列。也已知asn-gly对脱酰胺作用是尤其敏感的(rocinson等，proc.natl.acad.sci.usa2001；98；944-949)。对于seqidno:91所示人源化gc33l链ver.a的cdr1中的asn33而言，初级序列为asn-gly，其被预测对脱酰胺作用非常的敏感。

为评价asn33的脱酰胺作用对结合活性的影响，制备用asp取代asn33的修饰抗体。利用quickchange定点诱变试剂盒(stratagene)引入点突变。更具体地，将50μl的含有125ng的正义引物(cttgtacacagtgacggaaacacctat∶seqidno:172)，125ng的反义引物(ataggtgtttccgtcactgtgtacaag∶seqidno:173)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dntp混合物，10ng的已克隆人源化gc33l链ver.a的hefgκ和1μlpfuturbodna聚合酶的反应混合物用于12个包括95℃30秒，55℃1分钟和68℃9分钟的循环的pcr。随后，添加限制性酶dpni并在37℃降解2小时，以及将降解产物导入到与试剂盒连接的xl1-blue感受态细胞中，由此获得了转化体。由适当引入各突变的克隆中裂解出可变区，并再次克隆到hefgκ中。利用fugene6(roche)和已克隆了人源化gc33h链ver.k的hefgκ1将其导入到细胞中。由培养上清液回收在细胞中瞬间表达的抗体。利用抗-人igg抗体通过夹心elisa测定抗体的浓度。利用包被gpc3核心蛋白的可溶形式的免疫微板通过elisa评价修饰抗体的结合活性。如图18所示，在其中asn33已被asp取代的修饰抗体(n33d)中丧失了结合活性，此表明asn33的脱酰胺作用对结合活性的影响是显著的。

作为抑制asn33脱酰胺作用的方法，已报道(国际专利申请wo03057881a1)了用另一个氨基酸取代gly34。根据上述方法，利用quickchange定点诱变试剂盒用除了cys和met之外的17种氨基酸中任一种取代g34来制备一系列的修饰抗体，也即,g34a,g34d,g34e,g34f,g34h,g34n,g34p,g34q,g34i,g34k,g34l,g34v,g34w,g34y,g34r,g34s和g34t。这些抗体在cos7细胞中瞬间表达，以及利用培养上清液评价其结合活性。据发现即使g34被用除了pro(g34p)和val(g34v)之外的另一个氨基酸取代，其仍然保持结合活性。

上述修饰抗体的轻链cdr1的氨基酸序列分别显示于seqidno:174(g34a),seqidno:175(g34d),seqidno:176(g34e),seqidno:177(g34f),seqidno:178(g34h),seqidno:179(g34n),seqidno:180(g34t),seqidno:181(g34q),seqidno:182(g34i),seqidno:183(g34k),seqidno:184(g34l),seqidno:185(g34s),seqidno:186(g34w),seqidno:187(g34y),seqidno:188(g34r),seqidno:189(g34v)和seqidno:190(g34p)中。上述修饰抗体的轻链可变区的氨基酸序列分别显示于seqidno:191(g34a),seqidno:192(g34d),seqidno:193(g34e),seqidno:194(g34f),seqidno:195(g34h),seqidno:196(g34n),seqidno:197(g34t),seqidno:198(g34q),seqidno:199(g34i),seqidno:200(g34k),seqidno:201(g34l),seqidno:202(g34s),seqidno:203(g34w),seqidno:204(g34y),seqidno:205(g34r),seqidno:206(g34v)和seqidno:207(g34p)中。

本发明的抗体可用作细胞生长抑制剂，抗癌药物或癌症诊断药物。

实施例26

表达全长人gpc3的人肝细胞瘤细胞系(sk-03)的制备

为获得用于评价抗-gpc3抗体的生物活性的细胞系，建立表达全长gpc3的人肝细胞瘤细胞系。

一微克用pvui处理的全长人gpc3基因表达载体与2μl的fugene(roche)混合来形成复合物。将复合物添加于sk-hep-1细胞(购自atcc)用于基因导入。在co2恒温箱中温育24小时后，利用含有1mg/ml终浓度遗传霉素和10％fbs的dulbecco’smem(d-mem,sigma)选择gpc3表达细胞。收集产生的遗传霉素-抗性菌落以及通过有限稀释法进行细胞克隆。通过流式细胞仪利用嵌合抗体gc33和fitc-标记的山羊抗-人igg抗体(icn)测定各细胞克隆的人gpc3的表达。以这种方法，获得了稳定表达的细胞系sk-03。

实施例27

小鼠-人嵌合抗体的cdc活性和adcc活性的比较

为了直接比较实施例22中描述的小鼠-人嵌合抗体gc33,m3c11，和m1e7的cdc活性和adcc活性，根据实施例16和17中描述的方法在相同的试验系统中测定三个抗体的cdc活性和adcc活性。作为靶细胞，表达全长gpc3的cho细胞用于测定cdc活性且sk-03用于测定adcc活性。结果分别显示于图19和图20中。其揭示在任一试验系统中，gc33与其它两种抗体相比显示出更强烈的cdc活性和adcc活性。

工业实用性

本发明的抗体可用作细胞生长抑制剂，抗癌药物以及肿瘤诊断药物。