基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用的制作方法

本发明涉及ssr分子标记技术领域，具体涉及一种基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用。

背景技术：

芍药(paeonialactiflorapall.)隶属于芍药科芍药属，是栽培历史非常悠久的传统名花，不仅作为园林绿化美化植物广泛应用于庭园，而且是国际花卉市场的重要切花。在芍药育种领域，国内外育种工作也非常活跃，新品种层出不穷。然而，目前，不同芍药产区、不同生产单位的品种命名并不完全相同。在芍药流通领域，同物异名、同名异物现象也非常泛滥，严重影响了芍药种质资源的生产、保护及进一步开发应用。

一直以来，我国芍药品种鉴定工作进展非常缓慢。行业机构的品种鉴定仅局限于花期的表型鉴定，时间非常短促；而有些芍药品种，即使是在花期，其形态特征也非常相似，因此对于经验丰富的鉴定者也往往会构成严峻挑战。传统的表型鉴定不仅耗费大量人力、物力和财力，而且鉴别难度较大。

目前，分子标记技术如rapd、srap、aflp、ssr已经应用于芍药种质资源研究，其中，ssr(simplesequencerepeat，简单重复序列)因其具有数量丰富、多等位基因、可提供的信息量高以及呈共显性等特点，被广泛应用于植物遗传进化、育种等研究中。但传统的ssr标记引物设计过程较慢，需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等环节，ssr引物的获得花费的时间长、费用高、效率低。表达序列标签微卫星(est-ssr)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具有多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。目前est-ssr已在大白菜、棉花、文心兰属、芹菜、桃、丹参、莲雾、杨梅等多种植物中得到应用。也有报道利用est-ssr标记和形态性状检测31个芍药品种的遗传多样性，但其利用的是来源于牡丹的est-ssr标记，而针对芍药的est-ssr特异性引物较少。为更好地保护和利用芍药种质资源，亟需开发更多的特异性引物。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用。本发明的est-ssr引物组不仅能够明显扩增多态性条带，还具有扩增稳定、重复性好等特点；利用本发明的est-ssr引物组可实现芍药种质的分子鉴定，具有快速、精准、实用、不受花期影响等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组，所述est-ssr引物组包括以下13对引物：

引物对ple2，其序列如seqidno.1和seqidno.2所示；

引物对ple6，其序列如seqidno.3和seqidno.4所示；

引物对ple12，其序列如seqidno.5和seqidno.6所示；

引物对ple20，其序列如seqidno.7和seqidno.8所示；

引物对ple22，其序列如seqidno.9和seqidno.10所示；

引物对ple23，其序列如seqidno.11和seqidno.12所示；

引物对ple31，其序列如seqidno.13和seqidno.14所示；

引物对ple33，其序列如seqidno.15和seqidno.16所示；

引物对ple37，其序列如seqidno.17和seqidno.18所示；

引物对ple39，其序列如seqidno.19和seqidno.20所示；

引物对ple49，其序列如seqidno.21和seqidno.22所示；

引物对ple53，其序列如seqidno.23和seqidno.24所示；

引物对ple56，其序列如seqidno.25和seqidno.26所示。

本发明的第二方面，提供上述est-ssr引物组在如下(1)-(4)任一项中的应用：

(1)芍药品种分子鉴定；

(2)芍药品系纯度鉴定；

(3)芍药品种的遗传多样性分析；

(4)芍药分子育种。

本发明的第三方面，提供一种利用上述est-ssr引物组进行芍药分子鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)提取芍药叶样品中基因组dna；

(2)以步骤(1)提取的芍药叶样品中基因组dna为模板，利用est-ssr引物组中的至少一个引物对进行pcr扩增，用于pcr扩增的引物对的上游引物采用生物荧光基团进行修饰；

(3)将pcr扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取电泳条带数据，统计检测位点；根据检测位点进行芍药分子鉴定。

优选的，步骤(2)中，est-ssr引物组中的引物对的优先利用顺序依次为：ple20、ple23、ple49、ple22、ple31、ple2、ple6、ple12、ple37、ple33、ple53、ple56、ple39。

优选的，步骤(2)中，每对引物的上游引物分别采用fam、hex、tamra和rox4种生物荧光基团进行修饰。

优选的，步骤(2)中，pcr扩增的体系为20μl，包括：1μl30ng/μl的模板dna、10μl2×m5pagetaqmix、10μm的上下游引物各0.5μl、8μlddh2o。

优选的，步骤(2)中，pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃～59℃退火温度下复性30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min；得到扩增产物。

更优选的，步骤(2)中，引物对ple2的退火温度为58℃；引物对ple6的退火温度为53℃；引物对ple12的退火温度为52℃；引物对ple20的退火温度为51℃；引物对ple22的退火温度为55℃；引物对ple23的退火温度为56℃；引物对ple31的退火温度为52℃；引物对ple33的退火温度为55℃；引物对ple37的退火温度为55℃；引物对ple39的退火温度为59℃；引物对ple49的退火温度为53℃；引物对ple53的退火温度为53℃；引物对ple56的退火温度为58℃。

优选的，步骤(4)中，在进行芍药分子鉴定时，将每个引物对在芍药样品中的扩增位点赋以相应代码，两个样品代码完全相同时即判定为同一品种；反之，则判定为不同品种。

本发明的有益效果：

本发明基于芍药转录组序列开发设计了est-ssr引物组，其由13对引物组成，具有多态性丰富、扩增稳定、通用性高、重复性好等优点，丰富了芍药est-ssr引物数量。利用本发明的est-ssr引物组可以进行芍药分子鉴定，具有快速、可靠、实用等特点，对于芍药种质资源的引种、生产及新品种dus测试提供了重要的技术保障。

附图说明

图1：芍药品种‘遍地红’利用est-ssr引物组中13个引物对扩增后获得的代码。

图2：芍药品种‘富士’在引物对ple2上的扩增位点图。

图3：芍药某待测样品在引物对ple2上的扩增位点图。

图4：芍药品种‘富士’在引物对ple6上的扩增位点图。

图5：芍药某待测样品在引物对ple6上的扩增位点图。

图6：芍药品种‘富士’在引物ple31上的扩增位点图。

图7：芍药某待测样品在引物ple31上的扩增位点图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，我国芍药品种鉴定工作进展非常缓慢，虽然芍药是我国的传统花卉，具有很高的应用价值。但我国素来‘重牡丹，轻芍药’，导致芍药在新品鉴定、保护以及分子水平的研究一直落后于牡丹。传统的表型鉴定不仅耗费大量人力、物力和财力，而且仅局限于花期的表型鉴定，时间非常短促，鉴别难度较大。est-ssr具有多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，可用于植物品种的分子鉴定，但有关芍药est-ssr引物开发较少。然而，芍药品种却远大于牡丹，必然需要开发更多的引物以满足品种鉴定需求。

基于此，本发明的目的是基于芍药的转录组序列开发针对于芍药的est-ssr特异性引物。ests数据库提供了一个ssrs序列的来源，但并非全部的ests都可用来设计ssr引物，这需要从ests中发现合适的简单重复序列。在设计ssr引物时，为提高检测的效率，需要选择那些重复次数较多的ssr。此外，由于编码区域较保守，应使用不同材料间变异较大的3′或5′端utr内的ssr，但需除去那些不能满足引物设计标准的ssr旁邻序列过短的est。在引物设计过程中为能够使每对引物能够和目标区域特异性的结合，还需要对gc含量、退火温度、引物长度、产物长度等进行考察和优化。在引物设计之后，还需要对est-ssr的引物的有效性进行验证。

本发明最终优化设计得到了芍药est-ssr引物组，其包括13对引物，具体如下：

ple2f：atggagcaactaacagaggg；(seqidno.1)

r：ggagaaagacacgatgatgag。(seqidno.2)

ple6f：agccagtgtcagggtagtc；(seqidno.3)

r：gttgaagaagaaacagaggg。(seqidno.4)

ple12f：gtcaacgggctccttacca；(seqidno.5)

r：tgcttccaccgcttctca。(seqidno.6)

ple20f：tcaaggcacggtacatct；(seqidno.7)

r：attgcagcatagtaaagtcg。(seqidno.8)

ple22f：ttagcaaggtaaggagaaca；(seqidno.9)

r：catcaaagaggtggggta。(seqidno.10)

ple23f：cggtaatctgtaacacttcatc；(seqidno.11)

r：gcttgtaagaggcgtaactaa。(seqidno.12)

ple31f：tcttgcatctccctaacct；(seqidno.13)

r：attgccaaacctgctgtc。(seqidno.14)

ple33f：ttttatcctcactgtcccctcc；(seqidno.15)

r：tccgcctcaatttccgtc。(seqidno.16)

ple37f：gacgagtaaaaggacaaacg；(seqidno.17)

r：cagaaactgccgcaagag。(seqidno.18)

ple39f：aatccgcagttacaagcc；(seqidno.19)

r：cgacgagcacatacacca。(seqidno.20)

ple49f：caaaataagtagggagtgagtg；(seqidno.21)

r：gaatggagggaagaagataa。(seqidno.22)

ple53f：attgaaacctttggacgaac；(seqidno.23)

r：caccactaatgtcagacgatg。(seqidno.24)

ple56f：ctgtcgttgttattggagttag；(seqidno.25)

r：ggagacctacacccttgct。(seqidno.26)

本发明最终优化得到的芍药est-ssr引物组具有多态性丰富、扩增稳定、鉴定效率高、通用性高的优点，特别是在鉴定效率和通用性方面，本发明的芍药est-ssr引物组更具有显著的优势。在鉴定效率方面，本发明的芍药est-ssr引物在品种间的扩增中0等位基因频率更低，13对引物平均0等位基因频率为0.059(据报道，引物0等位基因频率一般在0.2-0.4之间)；其中，11对0等位基因频率小于0.03(7对等于0)，仅两对引物的0等位基因频率在0.2-0.4；因此，本发明的芍药est-ssr引物组能够高效鉴定不同芍药品种。在通用性方面，本发明的芍药est-ssr引物中，ple2、ple12、ple22、ple23、ple31、ple33、ple37、ple39、ple53等9对引物还可以用于牡丹品种的鉴定，因此具有通用性高的优点。

基于开发的芍药est-ssr引物组，本发明的另一实施方案中给出了基于est-ssr引物组进行芍药分子鉴定的方法，包括如下步骤：

1)提取芍药叶样品中基因组dna；

2)在每对引物的上游引物分别采用fam(蓝)、hex(绿)、tamra(黑)和rox(红)4种生物荧光基团进行修饰；具体为：引物对ple2、ple6上游引物的5’端修饰fam荧光基团；引物对ple22、ple31、ple33、ple37、ple39上游引物的5’端修饰hex；引物对ple20、ple49、ple53、ple56上游引物的5’端修饰rox；引物对ple12、ple23上游引物的5’端修饰tamra。

3)以样品dna为模板，以荧光修饰引物及下游引物进行pcr扩增，扩增体系为20μl，包括1μl30ng/μl的模板dna、10μl2×m5pagetaqmix、10μm的上下游引物各0.5μl、8μlddh2o，扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃～59℃退火温度下复性30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min；得到扩增产物；相比三引物法，本发明利用两条引物进行pcr扩增，背景清晰，检测效率更高。

4)将pcr扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取电泳条带数据，统计检测位点；

5)根据检测位点进行芍药分子鉴定。

进行芍药分子鉴定时，有时不必利用全部13个引物对，可按照如下引物对顺序利用至少一个引物对，引物对的优先利用顺序依次为：ple20、ple23、ple49、ple22、ple31、ple2、ple6、ple12、ple37、ple33、ple53、ple56、ple39。

按上述引物对顺序依次进行pcr扩增，扩增后确定检测位点，然后比较检测位点是否相同，如果相同，则继续用下一引物对进行pcr扩增。若检测位点完全相同，则判定为同一品种；反之，则判定为不同品种。

对于两个样品之间的对比，可以直接通过引物扩增位点的比较。当对大量样品进行对比时，比较其扩增位点会特别繁琐，可以根据每对引物对不同品种扩增片段对应的分子量大小依次进行编号，此时比较编码后的分子身份证会更简单快速。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1：芍药est-ssr引物组的开发

1.引物的设计和合成

(1)芍药转录组数据库来源于发明人课题组对芍药芽高通量测序结果(ncbino.srp059306)；

(2)采用trinity2.4.0软件对步骤(1)所述数据库进行ssr位点的查找、分析，筛选出包含ssr长度在18bp及以上的est序列，具体筛选标准：单核苷酸最少重复次数20次；二核苷酸最少重复次数10次；三、四、五、六核苷酸最少重复次数6次；

(3)利用primerpremier5.0软件对筛选出包含ssr位点的est序列进行上下游引物设计，利用dnaman7.0.2软件的‘self-complementarity’功能进行引物碱基互补性检测，避免错配、引物二聚体和发卡结构影响pcr反应；最终确定了60对候选引物；

2.引物的初步筛选及退火温度的优化

(1)选取12份形态差异大的芍药资源，利用dp305试剂盒(中国天根)提取芍药基因组dna，分别采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计对dna的品质和浓度进行检测；

(2)使用确定的60对候选引物进行pcr扩增，通过8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳初步筛选出扩增稳定、含有清晰的目标条带且具较高多态性的引物；

(3)对步骤(2)筛选出的引物进行退火温度筛选，确定每对引物的最适退火温度；筛选得到以下13对引物及其适宜退火温度(表1)：

表1：13对est-ssr引物信息

实施例2：est-ssr引物组用于芍药分子鉴定时的检测位点编码及各引物对的优先利用排序

(1)提取135个芍药品种的基因组dna；

(2)利用表1中的引物及退火温度进行pcr扩增，扩增后利用abi3730xldnaanalyzer基因分析仪进行检测；

(3)根据基因分析仪检测结果，统计每对引物扩增的特征性谱带、多态性谱带大小；

(4)根据每对引物对不同品种扩增片段对应的分子量大小依次编号为0～9，如果超过9时则赋值为a～z，0表示该泳道由于基因片段丢失而无带的零等位基因(表2)；

需要说明的是，编码基于现有的扩增片段分子量大小顺序，由于编码顺序中‘1,2，3...’不代表明确的大小关系，所以在实际鉴定过程中，出现新的扩增片段长度可以在现有编码基础上增加新的编码。

(5)利用microsatellitetoolkit分析等位基因数和多态性信息含量(pic)，其中，pij表示位点i的第j个等位变异出现的频率，反映每个est-ssr位点的多态性水平；

将13对引物按照pic值由高到低进行排序，即得到本发明的引物对顺序(表3)。

利用est-ssr引物组进行芍药分子鉴定时，可按照引物对顺序对样品进行编码，具体编码规则如‘遍地红’(图1)。

表2：13对引物扩增在135个芍药品种中的扩增位点及位点编码

表3：13对引物在135个芍药样品中的扩增多态性

实施例3：利用est-ssr引物组鉴定某待测植株a是否为芍药品种‘富士’

具体实施方法：

(1)分别提取已知芍药品种‘富士’和待测植株的dna；

(2)利用表1中的13个引物对，每对引物上游分别采用fam(蓝)、hex(绿)、tamra(黑)和rox(红)4种生物荧光基团进行修饰；

(3)荧光修饰后，进行pcr扩增；

(4)扩增产物经毛细管荧光电泳检测，获得扩增电泳条带图，分别统计其检测位点；

(5)依据引物组中各个引物对的顺序，对检测到的位点进行编码，根据编码一致性与否进行品种判定。在本实施例中，已知品种‘富士’的品种代码为：00c29e8153aa5；待测植株的品种代码为：00c2c77153aa5，两者存在3位代码不同，即代表两者在对应3对引物的扩增位点不同(图2-7)，因此判定待测植株不是芍药‘富士’。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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<120>基于芍药转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用

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