RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用与流程

rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430及其构建方法和应用
技术领域
[0001]
本发明属重组减毒沙门菌领域，具体涉及一种rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430及其构建方法和应用。


背景技术：

[0002]
乳腺肿瘤是患肿瘤疾病的雌性动物中患病率最高的，特别是小动物的重要临床疾病之一。诸如牛、羊、马、犬、猫等雌性个体中均有较高的概率罹患此病，其中犬最高，只有29％的未绝育的母犬不会发病。采用常规肿瘤治疗方法后，高风险乳腺癌病畜仍会死于肿瘤复发和转移。因此，寻找合适的载体和治疗药物将会极大改善乳腺癌对雌性动物的伤害。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430及其构建方法和应用，将rgd、tat和gel基因克隆至真核表达载体pegfp-n1的多克隆位点，转化入减毒伤寒沙门菌lh430中。构建双靶向调控gel基因的重组减毒沙门菌lh430/pegfp-rgd-tat-gel，拟通过双靶向表达治疗基因来实现诱导肿瘤细胞凋亡的试验目的。
[0004]
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
[0005]
一种rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430的构建方法，包括下述步骤：
[0006]
1)设计rgd-tat-gel基因seq id no.5；rgd-gel基因seq id no.6；tat-gel基因seq id no.7；gel基因seq id no.8；
[0007]
2)rgd-tat-gel基因、rgd-gel基因、tat-gel基因、gel基因pcr扩增：以rgd-f seq id no.1和gel-r seq id no.2为引物，扩增rgd-tat-gel基因和rgd-gel基因；以tat-f seq id no.3和gel-r seq id no.2为引物，扩增tat-gel基因；以gel-f seq id no.4和gel-r seq id no.2为引物，扩增gel基因；
[0008]
3)将获得的目的基因克隆到pmd-18-t载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pegfp-rgd-tat-gel，并用其转化感受态lh430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门菌lh430。
[0009]
本发明还包括一种根据所述的rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430的构建方法得到的rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430。
[0010]
本发明还包括一种所述的rgd、tat、gel三基因重组减毒沙门菌lh430的应用，应用于防治人乳腺癌生物制品方面。
[0011]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0012]
本发明将rgd对肿瘤细胞的靶向性、tat对细胞的穿透性、gel基因的细胞凋亡作用和减毒沙门菌lh430可携带外源基因靶向肿瘤微环境的厌氧区的特性结合起来，构建出能够融合表达上述基因的重组减毒沙门菌，使得rgd-tat-gel基因能够更好地发挥靶向性及
cancer)。这种恶性疾病在雄性动物身上发生概率不到1％，99％病发于雌性动物。现阶段分子生物学、基因学等相关学科已成为肿瘤治疗的热门，其中基因治疗尤为突出。此处使用的减毒菌株为鼠伤寒沙门菌(lh430，pho p/pho q基因缺失)，该菌株毒力与亲本菌株相比大为降低，仍保留亲本菌株的侵袭力，是适宜的疫苗及载体候选菌株。肿瘤靶向肽rgd可有效识别肿瘤血管整合素αvβ3，由于乳腺癌细胞表面存在整合素αvβ3，rgd能够高度靶向乳腺癌细胞，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。tat是一种11聚体的细胞穿膜肽(cpps)，来源于人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)编码的转录反式激活蛋白，可有效地内化细胞，携带偶联药物进入细胞的小肽，且不引起细胞毒性反应。白树毒素(gelonin，简称gel)是一种-型核糖体失活蛋白(rips)，可专一性水解真核细胞核糖体28s rrna，从而抑制蛋白质生物合成导致细胞死亡。此处选择白树毒素基因作为人乳腺癌的治疗基因。同时，利用减毒沙门菌载体和rgd的双靶向调控作用在降低对正常组织伤害作用的同时保持gel基因治疗效果，充分发挥抑癌作用。
[0028]
本发明将rgd、tat和gel基因导入减毒沙门菌lh430，包括以下步骤：
[0029]
1)rgd-tat-gel基因片段、rgd-gel基因片段、tat-gel基因片段和gel基因片段的扩增与克隆；
[0030]
2)靶向表达rgd-tat-gel基因的真核表达载体的构建；
[0031]
3)携带重组真核表达载体的减毒沙门菌菌株的构建与鉴定；
[0032]
4)重组减毒沙门菌lh430诱导人乳腺癌细胞mda-mb-231凋亡的体外抑制效果。
[0033]
具体包括步骤如下：
[0034]
1)根据genbank中rgd基因序列(1ful_a)、tat基因(adk70247.1)第47-57氨基酸序列和gelonin基因序列(aab47013.1)设计rgd-tat-gel基因seq id no.5；根据rgd基因序列(1ful_a)和gelonin基因序列(aab47013.1)设计rgd-gel基因seq id no.6；根据tat基因(adk70247.1)第47-57氨基酸序列和gelonin基因序列(aab47013.1)设计tat-gel基因seq id no.7；根据gelonin基因序列(aab47013.1)设计gel基因seq id no.8；
[0035]
2)rgd-tat-gel基因、rgd-gel基因、tat-gel基因、gel基因pcr扩增：以rgd-f seq id no.1和gel-r seq id no.2为引物，扩增rgd-tat-gel基因和rgd-gel基因；以tat-f seq id no.3和gel-r seq id no.2为引物，扩增tat-gel基因；以gel-f seq id no.4和gel-r seq id no.2为引物，扩增gel基因；
[0036]
3)将获得的目的基因克隆到pmd-18-t载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pegfp-rgd-tat-gel，并用其转化感受态lh430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门菌lh430。
[0037]
上述重组减毒沙门菌lh430的制备方法获得的重组减毒沙门菌lh430在制备防治人乳腺癌生物制品方面的应用。
[0038]
也就是说，根据白树毒素基因序列得到的gel基因序列；根据肿瘤靶向肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的rgd-gel基因序列；根据细胞穿膜肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的tat-gel基因序列；根据肿瘤靶向肽蛋白序列、细胞穿膜肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的rgd-tat-gel基因序列。将获得的目的基因克隆到pmd-18-t载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel和pegfp-gel，并用其转化至感受态lh430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门菌
lh430；用上述构建好的重组减毒沙门菌侵染mda-mb-231细胞，通过rt-pcr和western blotting检测重组减毒沙门菌的侵染能力和外源基因的表达情况；采用流式细胞术和cck-8检测重组减毒沙门菌对mda-mb-231细胞的凋亡作用，评价经双靶向调控后表达的gel基因对人乳腺癌细胞mda-mb-231的抑制效果。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
[0039]
1材料与方法
[0040]
根据genbank中rgd基因序列(1ful_a)、tat基因(adk70247.1)第47-57氨基酸序列和gelonin基因序列(aab47013.1)设计rgd-tat-gel基因seq id no.5；根据rgd基因序列(1ful_a)和gelonin基因序列(aab47013.1)设计rgd-gel基因seq id no.6；根据tat基因(adk70247.1)第47-57氨基酸序列和gelonin基因序列(aab47013.1)设计tat-gel基因seq id no.7；根据gelonin基因序列(aab47013.1)设计gel基因seq id no.8，上述基因由上海捷瑞生物工程有限公司优化并合成。
[0041]
1.1rgd基因、tat基因、gel基因的扩增
[0042]
根据rgd-tat-gel基因seq id no.5和rgd-gel基因seq id no.6设计rgd-f引物序列，根据tat-gel基因seq id no.7设计tat-f引物序列，根据gelonin基因seq id no.8设计gel-r引物序列(引物两端引入ecor i和bamh i酶切位点)，pcr分别扩增rgd-tat-gel基因、rgd-gel基因、tat-gel基因和gel基因片段。扩增目的片段的引物见表1，其pcr反应体系见表2。
[0043]
表1
[0044][0045]
表2
[0046][0047]
注：反应程序：95℃，预变性5min；{95℃，30s；60℃，30s；72℃，1min}35个循环，72℃延伸15min。4℃保存备用。
[0048]
1.2重组真核表达载体的构建
[0049]
将获得的rgd-tat-gel基因、rgd-gel基因、tat-gel基因和gel基因与真核表达载
体pegfp-n1用相应的酶进行双酶切(酶切反应体系见表3)，再将其用t
4
连接酶16℃连接过夜(反应体系见表4)。经菌液pcr、酶切及测序鉴定，筛选出正确的重组真核表达载体pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel和pegfp-gel。
[0050]
表3
[0051][0052]
表4
[0053][0054]
1.3携带重组真核表达载体的减毒沙门菌菌株的构建与鉴定
[0055]
减毒沙门菌感受态细胞lh430的制备：
[0056]
将减毒沙门菌lh430菌种接种于固体lb培养基中过夜培养，后挑取单菌落接种至液体lb培养基中，170rpm振荡培养至od600＝0.35～0.4时，停止培养，冰上遇冷2h，4℃4000rpm离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤菌体2次，悬于1ml冰预冷的无菌去离子水。
[0057]
质粒转化感受态细胞：
[0058]
将制备好的感受态细胞于冰上解冻，取50μl感受态细胞，加入5μl连接产物，于冰上孵育30min后42℃水浴90s，并迅速于冰上放置2min。向其中加入无抗lb培养基，37℃振荡培养1h，4000rpm离心后去适量上清，涂布含有卡那霉素的lb固体平板培养基，37℃过夜培养。
[0059]
1.4重组减毒沙门氏菌lh430侵染mda-mb-231细胞。
[0060]
将人乳腺癌细胞mda-mb-231于完全dmem培养基中培养，待细胞融合度达70％时，用pbs洗涤2次并用无抗dmem培养液培养2小时，随后每孔接种重组减毒沙门菌lh430(细胞：细菌＝1：10)于37℃孵箱中共孵育3h，用pbs洗涤细胞3次，之后每孔加入2ml完全dmem培养基，于37℃再孵育3h后加无抗dmem培养液培养24-72h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照。
[0061]
利用rt-pcr检测目的基因mrna转录，western blotting检测目的蛋白的表达，通
rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp gel组均在约29kda处出现特异性条带，与预期egfp融合表达的目标蛋白分子质量大小相当(见图9)。
[0079]
2.7重组减毒沙门氏菌lh430介导mda-mb-231细胞凋亡的体外实验结果
[0080]
将经重组减毒沙门菌pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp gel、pegfp-n1组和pbs对照组侵染24h后，用流式细胞仪检测mda-mb-231细胞凋亡的变化。结果显示：重组减毒沙门菌组pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp-gel组pegfp-n1组和pbs组对mda-mb-231细胞的抑制率分别为8.02
±
2.7％，5.37
±
2.24％，4.15
±
2.55％，2.98
±
2.24％，3.86
±
2.53％和2.77
±
1.87％。用one-way anova统计方法对各组的凋亡率进行多重比较，表明重组减毒沙门菌pegfp-rgd-tat-gel诱导mda-mb-231细胞的凋亡作用最为显著(p<0.05)(见图10、11)。
[0081]
将经重组减毒沙门菌pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp gel侵染24h、48h、72h后的mda-mb-231细胞和hek293细胞经cck-8发检测，结果显示：重组减毒沙门菌对mda-mb-231细胞和hek293细胞的抑制能力未呈现出时间和剂量的依赖性。随着药物剂量和作用时间的增加，重组减毒沙门菌pegfp-rgd-tat-gel对mda-mb-231细胞的抑制率显著高于其他对照组(p<0.05)(图12)。
[0082]
3结论
[0083]
3.1成功扩增出rgd-tat-gel基因、rgd-gel基因、tat-gel基因和gel基因，并成功连接到pmd18-t载体上，获得pmd-rgd-tat-gel/pmd-rgd-gel/pmd-tat-gel/pmd-gel克隆质粒。
[0084]
3.2成功获得重组真核表达质粒pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp gel。
[0085]
3.3pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp gel质粒成功转化感受态lh430；
[0086]
3.4重组减毒沙门菌能够很好的表达目的基因并能成功表达目的蛋白。
[0087]
3.5经流式细胞术检测细胞凋亡，以pe/7aad荧光检测，证实重组减毒沙门菌lh430能够在体外对mda-mb-231细胞的生长起到抑制作用：重组减毒沙门氏菌组pegfp-rgd-tat-gel、pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel、pegfp-gel组pegfp-n1组和pbs组，对mda-mb-231细胞的凋亡率分别为：8.02
±
2.7％，5.37
±
2.24％，4.15
±
2.55％，2.98
±
2.24％，3.86
±
2.53％和2.77
±
1.87％。分析结果表明重组减毒沙门菌pegfp-rgd-tat-gel诱导mda-mb-231细胞的凋亡作用最为显著，pegfp-rgd-gel、pegfp-tat-gel组对mda-mb-231细胞的凋亡作用相较于pbs对照组也较为显著(p<0.05)。重组减毒沙门氏菌各组未出现药物剂量依赖性，对mda-mb-231细胞最佳抑制时间为48h，浓度为10
8
cfu/μl，对正常细胞损伤较小，说明其靶向效果良好。
[0088]
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。