一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及其应用的制作方法

本发明涉及一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及其应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

2-苯乙醇(2-pe)是一种具有玫瑰香味的高级芳香醇，由于这个特点，使得2-苯乙醇成为香水、化妆品和食品工业中最常用的芳香化合物之一，作为最终产品的感官增强剂。然而2-pe还显示出其他有趣的特性，如它的抗真菌和抗菌性能，使这种化合物在消毒剂、害虫控制、清洁和个人护理产品中成为受欢迎的添加剂。此外2-pe可以很容易地酯化生成一种重要的风味物质，2-苯乙酸乙酯，它也有花香和玫瑰般的气味，用途与2-pe类似。目前，2-pe的生产方法主要有化学合成、植物提取。

大多2-pe是由化学法合成而来，主要通过苯或苯乙烯的化学合成获得。然而化学合成法通常对环境不利，并且产生副产物，从而降低效率和下游成本。并且化学合成的2-pe在许多行业是禁止使用的，尤其是食品行业中。天然2-pe是消费者首选。它存在于许多花卉和植物精油中，如风信子、茉莉、玫瑰和百合，尤其是玫瑰。而从花卉中提取的天然2-pe价格昂贵，由于原材料稀缺，提取效率低、过程复杂，成本较高，无法满足市场需求。因此2-pe的生物合成受到广泛关注。

细菌、丝状真菌和酵母等各种微生物都具有合成2-pe的能力。在已报道的2-pe生产菌中，有saccharomycescerevisiae，kluyveromycesmarxianus和yarrowialipolytica是合成2-pe效率较高的菌。在酵母中，存在两条2-pe生物合成途径:莽草酸途径和埃利希途径。莽草酸盐途径是一种具有多分支和多种反馈抑制的长生物合成途径，以这种方式生产2-pe非常低，一般只能生产400-500mg/l。当l-苯丙氨酸作为唯一氮源时，2-pe可通过埃里希途径进行合成。zhaoyuewang等(regulationofcrucialenzymesandtranscriptionfactorson2-phenylethanolbiosynthesisviaehrlichpathwayinsaccharomycescerevisiae.2017)通过对s.cerevisiae的埃里希途径中的关键酶和转录因子来调控2-pe生物合成，产量达3.73g/l。通过培养优化，使k.marxianus的2-pe产量从0.39提高到0.5g/l。yanggu等(refactoringehrlichpathwayforhigh-yield2-phenylethanolproductioninyarrowialipolytica.2020)在y.lipolytica中通过阻断预处理竞争途径和减缓脂肪酸合成，2-pe产量为2669.54mg/l。jinbinliu等(mimickinganew2-phenylethanolproductionpathwayfromproteusmirabilisjn458inescherichiacoli.2018)从proteusmirabilisjn458中获得一条产2-pe的新途径，通过在重组e.colie-paeakag中，以10g/l的l-苯丙氨酸为底物，经过16h的转化，获得3.21±0.10g/l的2-pe。虽然生物合成2-pe得到人们的重视，但2-pe对大多微生物有一定的毒性，由此限制了2-pe的产量。为了降低毒性，将原位产物回收(ispr)应用于2-pe生产，并将2-pe的产量提高了。但利用有机相进行提取，被证明是不经济的。因此，发展2-pe生物技术生产的第一个具有挑战性的目标是鉴定高产菌株，筛选一株野生菌且高产2-pe将是一种更经济可行的方法。

根据文献报道，2-苯乙醇在微生物中代谢途径主要有三种：莽草酸/苯丙酮酸途径、埃里希途径和苯乙胺途径。

1、埃里希途径(ehrlichpathway)

在这三个途径中，最重要的是埃里希途径，在氮不足情况下，l-苯丙氨酸(l-苯丙氨酸)通过三个酶促步骤转化为2-pe。l-苯丙氨酸首先被转氨酶(aro8，aro9，bat1/twt1和bat2/twt2)氨基化为丙酮酸，然后被苯基丙酮酸脱羧酶(ydr380w/aro10，ydl080c/thi3，pdc1，pdc5，和pdc6)，最后通过醇脱氢酶(adh1，adh2，adh3，adh4和adh5)或甲醛脱氢酶(sfa1)还原为2-pe。

2、莽草酸/苯丙酮酸途径(shikimatepathway/phenylpyruvatepathway)

莽草酸/苯丙酮酸途径将碳水化合物代谢与芳香族化合物合成联系起来，包括三种芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和其他芳香族次生代谢物，直接从葡萄糖生成2-pe。据文献报道，a.oryzae、k.marxianus和s.cerevisiae表现出从葡萄糖中生产2-pe的能力，但由于复杂的生物合成途径、多分支和多种反馈抑制，产量很低。在最佳生长条件下，芳香氨基酸的胞内浓度足以使对phe和tyr敏感的同工酶大量失活。因此，寻找具有增加l-苯丙氨酸或苯基丙酮酸盐的更健壮的菌株是提高莽草酸盐生产2-pe途径效率的关键。

3、苯乙胺途径(phenylethylaminepathway)

苯乙胺途径与埃里希途径平行，在植物中起着更重要的作用，如西红柿。这条途径首先在酿酒酵母(s.cerevisiae)和米曲霉(a.oryzae)中发现。在这个过程中，l-苯丙氨酸首先脱羧为苯乙胺，然后氧化脱氨为苯乙醛，最后还原为2-pe。在矮牵牛和玫瑰花瓣中已发现了该途径的替代方法，其中的l-苯丙氨酸可以通过苯乙醛合酶(phenylacetaldehydesynthase，paas)一步转化为l-苯乙醛，然后进一步合成2-pe。

在这三种途径中，大多利用埃里希途径，即以苯丙氨酸为底物进行全细胞转化生产2-苯乙醇。但是目前以苯丙氨酸为底物，利用全细胞转化法生产2-苯乙醇的产量还比较低，无法满足工业化生产的需求。因此获得一株对苯丙氨酸利用率且转化率都较高的野生菌株，对合成2-苯乙醇才具有重要作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)1d6，已于2020年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020333。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有异常威克汉姆酵母1d6。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中异常威克汉姆酵母的含量不低于1.0×10⁶cfu/ml或1.0×10⁶cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中异常威克汉姆酵母的含量不低于1.0×10⁸cfu/ml或1.0×10⁸cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：取200～600μl的威克汉姆酵母1d6接种于10～30mlypd液体培养基中，28℃下活化2至3代，待异常威克汉姆酵母1d6达到1.0×10⁸cfu/ml以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度不低于1.0×10⁶cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

在本发明的一种实施方式中，待细胞浓度不低于1.0×10⁷cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为生理盐水或ph值为5～8的0.1～1m磷酸盐缓冲液，所述保护剂为浓度为10～25g/100ml的蔗糖溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为双蒸水和/或生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液，所述冷冻保护剂为15～20g/100ml的蔗糖溶液。

本发明提供了一种生产2-苯乙醇的方法，是在含有l-苯丙氨酸的发酵体系中，以异常威克汉姆酵母1d6为发酵菌株，或加入所述微生物菌剂，生产2-苯乙醇。

在本发明的一种实施方式中，将od600为0.1～4的异常威克汉姆酵母1d6以10～30ml/250ml的接种量接种至发酵体系。

本发明提供了一种提高2-苯乙醇转化率的方法，利用异常威克汉姆酵母1d6，在以l-苯丙氨酸为底物的体系中，转化生成2-苯乙醇。

在本发明的一种实施方式中，l-苯丙氨酸的浓度为5～7g/l。

在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述体系中还含有葡萄糖，葡萄糖浓度为20～40g/l。

在本发明的一种实施方式中，反应时间为24～72h。

在本发明的一种实施方式中，反应时间为24～48h。

本发明提供一种提高2-苯乙醇产量的方法，将所述异常威克汉姆酵母1d6在l-苯丙氨酸为底物的体系中生产2-苯乙醇。

在本发明的一种实施方式中，l-苯丙氨酸的浓度为5～7g/l。

在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述体系中还含有葡萄糖，葡萄糖浓度为20～40g/l。

在本发明的一种实施方式中，反应时间为24～72h。

在本发明的一种实施方式中，反应时间为24～48h。

本发明还保护所述异常威克汉姆酵母1d6或微生物菌剂在生产2-苯乙醇中的应用。

本发明还保护所述生产2-苯乙醇的方法，或提高2-苯乙醇转化率的方法，或提高2-苯乙醇产量的方法在生产2-苯乙醇中的应用。

本发明的有益效果：

本发明筛选得到的异常威克汉姆酵母1d6具有较高的l-苯丙氨酸转化率，并且对反应体系中葡萄糖含量需求较低，葡萄糖浓度在20～40g/l就能达到较好的产量效果，并且对底物l-苯丙氨酸的浓度要求低，仅需5～7g/l，在摇瓶发酵条件下，产量就能够达到2500mg/l以上。通过在发酵罐中扩大培养，产量可达到4727.29mg/l，具备良好的应用前景。

生物材料保藏

本发明所提供的异常威克汉姆酵母1d6，分类命名为wickerhamomycesanomalus1d6，已于2020年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020333，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为ypd发酵液中2-苯乙醇含量比较结果图；

图2为酵母在ypd培养基上菌落形态特征及显微镜下细胞形态特征图；

图3为酵母pcr鉴定电泳结果图；

图4为酵母基于itsii序列及neighbor－joining法构建的系统发育树；

图5酵母在sc培养基中的2-苯乙醇产量图；

图6为酵母在优化后sc培养基中的2-苯乙醇产量图。

具体实施方式

(一)培养基

ypd培养基：酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，固体培养基额外添加2％琼脂。

sc培养基：葡萄糖20g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po45g/l，l-苯丙氨酸5g/l，ynb1.7g/l。

优化后sc培养基：葡萄糖40g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po45g/l，l-苯丙氨酸7g/l，ynb1.7g/l，ph4.5。

上述培养基的灭菌条件均为115℃，15min。

(二)2-苯乙醇检测方法

苯乙醇标准液制备：准确称取50mg2-苯乙醇，以流动相溶解，定容至50ml，配制1.0mg/ml的标准储备液。分别取标准液50ul、100ul、200ul、500ul、1ml和2ml于容量瓶中，定容10ml，分别得浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200ug/ml的工作液。使用配备二极管阵列检测器的hplc，以甲醇:水为1:1为流动相，柱温35℃，进样体积10ul，流速为0.8ml/min。

(三)酵母dna的提取方法

1.取od600＝3左右的酵母菌液500ul，12000g，2min，去上清；

2.加入等体积0.1mm的玻璃珠和100ulstesbuffer，用振荡器频率最大状态下，震荡15min，或用fast-prep两个循环；

3.加入200ul无菌水和200ul苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，震荡30s，4℃，13500g，5min；

4.去上清200ul至新的ep管，加20ul3m的醋酸锂溶液，再加550ul的预冷过夜的100％乙醇，混匀，4℃，13500g，5min；

5.小心去上清，再用500ul预冷过夜的70％乙醇洗涤一次，4℃，13500g，5min；

6.去上清，60℃，15-30min,烘干，加适量无菌水重悬，测浓度。

实施例1：菌株的筛选和分离

(1)称取1g药曲，加入9ml无菌水，浸泡15min后充分振荡，制成菌悬液；在无菌操作条件下，用无菌水逐级稀释至10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1梯度的菌悬液；取各梯度菌悬液100μl涂布于ypd平板上，每个稀释梯度做三个平行；将培养基平板倒置于30℃恒温培养箱中培养2d，挑选平板上表面突起、乳白色、边缘不规则、不透明的单菌落，划线于ypd平板上，至长出单菌落，在平板上重复划线至每个平板均长出一种单一菌落(即每个平板上的菌落形态一致)；从每个平板上挑取单菌落并保存于ypd斜面培养基上。

(2)菌株初筛：将步骤(1)筛选获得的菌株接于ypd培养基中，于30℃，转速为220r/min的摇床中培养16h，再以初始od600值为0.1的接种量转接于ypd新鲜培养基中，于30℃，转速为220r/min，培养48h。分别取培养24h和48h的发酵液，发酵液于4℃，12000r/min离心5min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行hplc分析2-苯乙醇含量。

(3)菌株复筛：将步骤(2)获得的菌株接于ypd培养基中，于30℃，转速为220r/min的摇床中培养16h，再以初始od600值为0.1的接种量转接于sc培养基中，于30℃，转速为220r/min，培养48h。分别取培养24h和48h的发酵液，发酵液于4℃，12000r/min离心5min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行hplc分析2-苯乙醇含量。结果见图1。

(4)菌落形态观察及显微结构观察

将复筛选获得的高产2-苯乙醇菌株(1d6)接种到ypd培养基上进行活化，30℃下，培养48～72h，2d后进行形态观察。

挑取上述中ypd平板上单菌落的少量菌体，轻柔、均匀涂布在载玻片中的无菌水液滴中，固定后，制作临时装片，于40×100油镜下观察，记录细胞形态特征、细胞大小、出芽情况。置于荧光显微镜下进行观察。结果见图2。酵母1d6在ypd培养基上菌落呈乳白色，边缘不规则，中间突起(图2a)。其在显微镜下细胞呈圆形，且有椭圆形的细胞，生殖方式为顶端出芽，属典型酵母特征(图2b)。

(5)分子生物学鉴定

its2rdna基因的pcr扩增与序列测定：以提取的基因组dna为模板扩增its2rdna，以通用pcr引物扩增its2区域序列750bp。pcr扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外成像系统上拍照分析(图3)。将验证后的pcr扩增产物送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序，将测序结果在ncbi上进行blast，与现有的基因序列比对，并使用mega7.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbor－joining方法构建系统发育树结果见图4。结果表明，酵母1d6与异常威克汉姆酵母(wickerhamomycesanomalus)的its2rrna序列同源性最高，相似度达到99％。使用分子软件mega7.0对与酵母1d6相似度较高的10株菌株进行多序列比对分析，并利用neighbor-joining方法构建系统发育树。由图可以看出酵母1d6与异常威克汉姆酵母同源性最高，鉴定为异常威克汉姆酵母(w.anomalus)。

its2-f：5'-gcatcgatgaagaacgcagc-3'；

its2-r：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。

实施例2：酵母菌摇瓶培养生产2-苯乙醇

(1)菌株在sc培养基中的发酵培养

将筛选得到的异常威克汉姆酵母1d6在ypd液体培养基中活化，以初始od600值为0.1、30ml/250ml的接种量接种于sc培养基中，于30℃，转速为220r/min下，每8h取一次发酵液，培养56h。发酵液于4℃，12000r/min离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行hplc分析。

结果显示培养24h后产量基本趋于稳定，2-pe产量最高达2274.73mg/l(图5)。

(2)sc培养基中葡萄糖浓度对2-苯乙醇产量的影响

具体方式见步骤(1)，区别在于，将sc培养基中的葡萄糖浓度进行替换，发酵48h，测定2-苯乙醇产量。

表1培养基中不同葡萄糖浓度中2-苯乙醇产量

(3)sc培养基中l-苯丙氨酸浓度对2-苯乙醇产量的影响

具体方式见步骤(1)，区别在于，将sc培养基中的葡萄糖浓度确定为40g/l，将l-苯丙氨酸的浓度替换，发酵48h，测定2-苯乙醇产量。

表2培养基中不同l-苯丙氨酸浓度中2-苯乙醇产量

(4)菌株在优化条件下实时生产2-苯乙醇

将异常威克汉姆酵母1d6在ypd液体培养基中活化，以初始od600值为0.1、30ml/250ml的接种量接种于优化后sc培养基中(葡萄糖40g/l，l-苯丙氨酸7g/l)，于30℃，转速为220r/min下，培养56h，每8h取一次发酵液。结果显示2-pe产量在40h后趋于稳定，最高产量达3040.84mg/l(图6)。

实施例3：酵母菌发酵罐培养生产2-苯乙醇

将异常威克汉姆酵母1d6进行放大培养，在ypd平板上培养2-3天。然后挑取单菌落接种到含100ml/500mlypd培养基中，于30℃，220rpm/min摇床培养24h为种子液。分批和补料分批发酵均在装有2.5l发酵培养基(即优化后sc培养基)的5l发酵罐中进行。

将od600为4.0为种子液，以10ml/100ml的接种量接种至发酵培养基中，搅拌速度为400rpm，通气率为2.0vvm。使用无菌4mol/lnaoh溶液和4mol/lhcl溶液控制发酵培养基的ph为4.5所有培养均在30℃下进行。每隔12小时发酵液测定2-苯乙醇含量，结果见表3。在发酵24h时，进行一次性补料添加终浓度为5g/l的l-苯丙氨酸，发酵至48h时2-pe产量达4727.29mg/l。

表3发酵罐全细胞转化生产2-苯乙醇

实施例4：酵母菌的遗传稳定性

检测异常威克汉姆酵母1d6的传代稳定性，分别在ypd平板上进行传代培养，于30℃，培养2-3天。然后分别挑取单菌落接种到ypd培养基中，于30℃，220rpm/min摇床培养16h为种子液。转接到sc培养基，培养48h。从以下结果看，在传至第六代后，产量仍有2765.36mg/l，应用于工业生产的菌株，在传至5-6代后，其产量维持在5％左右就视其稳定性较好，因此，异常威克汉姆酵母1d6具有工业生产的价值。

表4菌株遗传稳定性

实施例5：酵母菌的微生物菌剂的制备

取200～600μl的异常威克汉姆酵母1d6接种于10～30mlypd液体培养基中，28℃下活化2至3代，待异常威克汉姆酵母1d6达到1.0×10⁸cfu/ml以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水或ph值为7的0.2m磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(15～20g/100ml的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于10⁷cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。