一种端粒基因治疗产品和哺乳动物广泛性启动子的用途的制作方法

此项发明是根据基因治疗技术领域，和基因工程技术领域的发明的成果。

背景技术：

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。也包括转基因等方面的技术应用。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从dna水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

体细胞基因治疗：体细胞基因治疗是将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用。

病毒介导基因转移，病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。

dna病毒介导载体：有人发现，因缺少e1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达e1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源dna的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向，采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：

①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；

②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；

③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；

④已用于基因治疗的ad5属腺病毒c亚群，无致癌性。

前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输7000bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。

技术实现要素：
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端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段dna-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。

端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。端粒是短的多重复的非转录序列（ttaggg）及一些结合蛋白组成特殊结构，除了提供非转录dna的缓冲物外，它还能保护染色体末端免于融合和退化，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用，并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。当细胞分裂一次，每条染色体的端粒就会逐次变短一些。

构成端粒的一部分基因约50～200个核苷酸，会因多次细胞分裂而不能达到完全复制（丢失），以至细胞终止其功能不稳定。细胞分裂次数越多，其端粒磨损越多，细胞寿命越短。

端粒dna是由简单的dna高度重复序列组成的，染色体末端沿着5'到3'方向的链富含gt。在酵母和人体中，端粒序列分别为c1－3a/tg1－3和ttaggg/ccctaa，并有许多蛋白与端粒dna结合，

端粒酶作用的模式

端粒dna主要功能有：

第一，保护染色体不被核酸酶降解；

第二，防止染色体相互融合；

第三，为端粒酶提供底物，解决dna复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点,常可抑制位于端粒附近基因的转录活性（称为端粒的位置效应，tpe）。

在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的。另外，重组机制也介导端粒的延长。端粒酶在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒dna加至真核细胞染色体末端，把dna复制损失的端粒填补起来，使端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，端粒酶能延长缩短端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，从而可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶的存在，就是把dna复制的缺陷填补起来，即由把端粒修复延长，可以让端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。但是，在正常人体细胞中，端粒酶的活性受到相当严密的调控，只有在造血细胞、干细胞和生殖细胞，这些必须不断分裂的细胞之中，才可以侦测到具有活性的端粒酶。当细胞分化成熟后，必须负责身体中各种不同组织的需求，各司其职，于是，端粒酶的活性就会渐渐的消失，端粒酶是一种由催化蛋白和rna模板组成的酶，可合成染色体末端的dna，赋予细胞复制的永生性，细胞愈老，其端粒长度愈短；细胞愈年轻，端粒愈长，端粒与细胞老化有关系。衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列。当细胞端粒的功能受损时，出现衰老。而当端粒缩短至关键长度后，衰老加速，临近死亡。

本发明用于保健实现逆转衰老疗法关键的一步，延长端粒其难点在于：端粒酶的活性在人体细胞严格控制，是发生癌症的必要条件，端粒酶不具有活性是细胞发生癌变最后的一道屏障，端粒酶活性不受控制，突破这后一道屏障癌症发生几率会提升几十倍，端粒酶在细胞里活性受到严格控制这是所有生物共同特点，癌症是最难以治疗的疾病。人体细胞约有60万亿个，200多种细胞类型，进入细胞还要经过细胞壁和细胞核孔两关，攻克以上难点唯有基因治疗病毒介导法，干细胞再生疗法难以完成200多种细胞的治疗。

衰老细胞特点是端粒dna耗尽，端粒末端有一种包裹蛋白把端粒末端包裹起来，当端粒基因消耗到包裹蛋白无法识别端粒dna序列时，端粒dna末端就会暴露出来，暴露出来的dna就会被atm和atm结合上去并活化，活化的atm和atr蛋白就会抑制mdm2蛋白的活性，使p53不被泛素化增加p53的活性，端粒dna耗尽的细胞启动程序性凋亡，多数细胞衰老发生自杀直接影响人体健康和寿命。

附图说明

图1是启动子为cmv的腺病毒基因载体图谱,

图2是启动子为ef-1a的腺病毒基因载体图谱,

图3是启动子为cag的腺病毒基因载体图谱,

图4是启动子为cbh的型腺病毒基因载体图谱,

图5是启动子为efs的腺病毒基因载体图谱,

图6是启动子为mscv的型腺病毒基因载体图谱,

图7是启动子为hpgk的型腺病毒基因载体图谱,

图8是启动子为sv40的型腺病毒基因载体图谱,

图9是启动子为ubc的型腺病毒基因载体图谱,

图10是启动子为pgk的型腺病毒基因载体图谱，

图11是腺病毒颗粒外部特征和包含基因治疗载体结构图，

图12是腺病毒衣壳骨架蛋白基因载体图谱。

本发明构建端粒酶活性受限制安全可靠的腺病毒载体，腺病毒是一种大分子36kb双链无包膜dna病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中，载体只保留了腺病毒包装必须元件ad5ψ，用于载体包装成病毒颗粒，图1至图10载体启动子和端粒酶逆转录酶元件基因用于转录和翻译端粒酶，端粒酶进入细胞核完成细胞端粒延长治疗，

图1载体中cmv元件人巨细胞病毒立即早期增强子/强启动子;在某些细胞类型中可能具有可变的强度。

图2载体ef-1a元件人真核翻译延伸因子1-furel1启动子强启动子，

图3载体cag元件cmv早期增强子融合到改良的鸡精肌动蛋白启动子强启动子中，

图4载体cbh元件cmv早期增强子融合到改良的鸡精肌动蛋白启动子强启动子中，

图5载体efs元件人真核翻译延伸因子1，短型，中强启动子，

图6载体mscv元件鼠胚胎干细胞病毒启动子包括pcmv病毒的增强子和启动子区以及dl-587rev逆转录病毒中强启动子的5′未翻译区;驱动基因表达在大多数小鼠或人类胚胎干细胞系和其他哺乳动物细胞系，

图7载体hpgk元件人磷酸甘油酸激酶1启动子中等强度启动子，

图8载体sv40元件猿猴病毒40增强子/早期启动子中等强度启动子，

图9载体ubc元件人类泛素c启动子弱启动子，

图10载体pgk元件小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子中等强度启动子。

以上十种启动子都是哺乳动物广泛性启动子，在人体细胞中有不同表达强度和兼容性，做出匹配最合适端粒基因治疗方案，载体sv40poly(a)元件负责mram的稳定性和出入核孔。载体promoter元件和ampr元件负责筛选大肠杆菌用于包装腺病毒颗粒，ampr只在大肠杆菌里表达，在人体细胞不具备表达功能对人体细胞无影响，载体ori元件是大肠杆菌专属复制起点，负责载体拷贝和包装成腺病毒颗粒，ori复制起点在哺乳动物细胞和其他细菌不具有复制拷贝功能，其发明载体特点，治疗载体没有人体细胞的复制起点，人体细胞的复制起点需要特定保守的基因序列，因此治疗载体就不会在人体细胞拷贝复制，治疗载体不会传代细胞，分裂出的细胞是不携带治疗载体基因，治疗载体基因是游离于细胞染色体，在没有核小体的保护下，治疗载体基因在一定时间会降解，严格的把控了端粒酶基因的活性，在人体细胞只表达不可复制拷贝，载体基因在细胞不可传代，完成端粒延长治疗，载体基因随着时间推移会降解，可控的完成端粒延长治疗目的，是最安全可靠的方案。

腺病毒治疗载体延长端粒的过程

腺病毒治疗载体经过静脉输液的方式进入体内，腺病毒治疗载体会随血液循环运输到身体各个部位，腺病毒治疗载体会随机接触细胞壁，如图11所示腺病毒治疗载体，有很多突纤维，这些突出纤维是打开细胞膜，胞吞作用的蛋白钥匙，细胞膜表面有很多监测蛋白分子，监测蛋白分子和营养物质结合才能开启细胞膜胞吞作用，识别需要的营养物质进入和预防有害物质进入细胞，腺病毒治疗载体的突出纤维欺骗了监测蛋白分子，以为腺病毒治疗载体是营养物质，与突出纤维结合，监测蛋白分子在与细胞膜结合，开启胞吞作用，会把腺病毒治疗载体送入细胞内，腺病毒治疗载体进入细胞内，细胞会以为是营养物质，一种特殊的蛋白会把腺病毒治疗载体膜泡剪出包裹起来，送往红细胞浆质分选站，这里是分解营养物质和把营养物质送往需要的地方，腺病毒治疗载体进入红细胞浆质分选站，里面的氢离子泵会释放酸性物质，腺病毒治疗载体在酸性物质的作用下开始分解，有两层衣壳首先是第一层的衣壳蛋白脱落，部分脱落衣壳蛋白与红细胞浆质内壁结合，破坏内壁腺病毒治疗载体逃出红细胞浆质分选站漂移接近细胞核，由于腺病毒治疗载体第一层蛋白衣壳被破坏稳定性不高加上有蛋白酶的分解下，第二层蛋白衣壳开始裂解，释放出包含端粒逆转录酶基因治疗载体dna。细胞核附近的rna聚合酶会与图1至图10载体启动子位点结合，开始转录出mrna，sv40poly(a)位点会形成发夹的结构，rna聚合酶到达发夹结构终止转录，细胞核附近的核糖体会与mrna的aug位点结合人端粒酶基因起始位点序列atg，核糖体以mrna为模板与携带氨基酸的trna结合，翻译出多肽折叠形成端粒酶，端粒酶会经过核孔进入细胞核内，当端粒酶与端粒dna接近时会结合起来，端粒酶自身携带的rna作模板，以dntp为原料，通过逆转录催化合成后延长链5‘端dna片段，当完成一个ttaggg序列dna，端粒酶会自动脱落，端粒酶然后在与新合成的dna片段结合在合成，以此类推从而达到端粒的延长治疗，端粒被延长细胞分裂次数增加，达到增加寿命的治疗效果。

腺病毒载体的包装方法：

腺病毒载体的包装方法，四环素响应元件启动子tet-on3g表达调控系统，可以用于各种病毒包装在细菌和哺乳动物细胞都适用，特点是不用pcr扩增基因，无需每次都需要导入包装质粒，把包装全部所需的质粒导入受体细胞，通过tet-on3g表达调控系统，控制病毒蛋白基因表达，在没有四环素情况下不会产生病毒颗粒，不会影响受体细胞的生长分裂，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，此时病毒基因激活包装产生病毒颗粒，如此可以批量包装各种病毒载体。实验室和生物公司都是采用pcr扩增和基因导入的方法包装，不仅成本高而且效率低，实验方法比如一组腺病毒包装质粒paav-rc2、paav-mcs、phelper质粒一起包装成腺相关病毒，paav-rc2的载体含有cap和rep基因，这些基因可以产生产生传染性病毒所需的衣壳和dna复制蛋白将该载体共同转染到包装细胞系中，制备重组的复制缺陷型aav病毒，paav-rc质粒含有aav-2rep和cap基因，分别编码复制蛋白和病毒衣壳结构蛋白。建立rep和cap基因产物的正确表达水平是实现高滴度病毒生产的重要步骤。paav-rc从两个不同的启动子指导rep和cap的表达，把这两个启动子酶切掉换成tre3g启动子，调控rep和cap的表达，tet3g蛋白248个氨基酸27.7kda序基因列长度747，是改良逆序四环素应答转录激活剂(第3代)，仅在四环素或类似物(如强力霉素)存在的情况下，结合tre3g启动子激活基因转录。相对于它的前身rtta，它对诱导药物有更高的敏感性。paav-mcs和phelper其中一个或两个，插入tet3g基因，先将这两个质粒和目的基因载体导入受体细胞，过一段时间受体细胞表达有足够多的tet3g蛋白，在将paav-rc2导入受体细胞，培养扩增受体细胞，拿出部分受体细胞加入四环素培养，rep和cap表达激活，腺病毒载体在受体细胞完成包装，此方法适用于所有的宿主细胞和病毒包装，将部分病毒衣壳蛋白基因用tet-on3g系统调控表达，可高效率包装出腺病毒载体。

构建腺病毒治疗载体的技术操作：

技术操作第一步合成dna：

制备治疗载体dna：图1至图10腺病毒治疗载体序列长度只有6000~7000多bp，因此可以使用dna合成仪合成，合成治疗载dna体序列前，把5端和3端加入保护基团，以亚磷酰胺寡核苷酸合成为该类仪器的一般操作步骤。亚磷酰胺dna合成的试剂有：保护碱基的5/—dmt，a、g、c、t亚磷酰胺单体，四唑偶联催化剂，乙酐，n—甲基咪唑封闭试剂，三氯乙酸(tca)脱保护溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶剂，氨水切除溶液。

1)仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注意乙腈的量，因为该溶剂用量较大，

2)将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上，

3)将要合成的治疗载体dna序列输入合成仪，

4)检查选择的合成步骤是否正确，

5)选择结束方法：trityloffauto是仪器的原始状态，若打算以5，—dmt基团连接纯化寡核苷酸，将其转变为tritylonauto结束状态，

6)选择结束方法，一般为系统的原始状态，

7)在每个柱监视器的username下，输入你所希望的保存名字，

8)以代码代替相应的dna序列标记每一个收集瓶，

9)打印出每一个柱设置的详细资料，

10)检查打印出来的资料是否正确，

11)运行startcolumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于正确的位置，

12)检查连接在合成仪上的溶剂残留(废液瓶)是否充满，

13)如果分部收集器用来收集每个dmt脱保护步骤的流出物，确保试管充分清洁干净，并打开分部收集器，确保dmt废液管路通向分部收集器。

14)启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。在合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个dmt，并将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；trityloffauto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，将其从固相载体上切下来，储存在收集瓶中；tritylonmanual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸带有一个dmt，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中；trityloffmanual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸没有保护基团，寡核苷酸没有从固相载体上切下来，而是保留在合成柱中。

技术操作第二步电泳纯化：

合成完成后对合成的dna序列需要使用电泳仪进行纯化，获取合成的最长片段dna，1．首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2．电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。3．接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。4开始前清洗部件组装前要彻底清洗干净。尤其是玻璃板及凹形带槽橡胶框，必须用泡沫海绵沾少许肥皂粉或洗涤剂彻底清洗干净。清洗后的玻璃板应放在玻璃板支架上晾干水后将电泳槽组装起来。

5对电泳槽进行灌胶、先灌分离胶，待凝固后再灌浓缩胶。灌胶前接通冷却水，夹紧连接上下贮液槽的两根橡胶管。用细头滴管吸取胶液，沿长、短玻璃板中间缝隙从一端加入胶液。为防止产生气泡，可稍拾起另一端(气泡往高处走)，不断加入胶液。若单层胶(分离胶)则加胶量约距离短玻璃板上端0.3厘米处，轻轻加少许水，双手轻轻将梳子插入，待胶凝后就可形成凹形加样孔。为防止漏胶，在上、下贮液槽中立即加入蒸馏水，但蒸馏水不能超过短玻璃板上缘，胶凝固后即可看到样品槽梳子与凝胶板间有一层折射率不同的亮区。

6制备核酸电泳缓冲液：

制备核酸50×taebuffer电泳缓冲液：称量氨基丁三醇242g，na2edta.2h2o37.2g于1l烧杯中；向烧杯中加入约600ml去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；用naoh调ph至8.3，加去离子水定容至1l后，室温保存使用时稀释50倍。

在点样板或parafilm上混合成的治疗载体dna样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x.用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序)。

7加样：

松开连接上、下贮液槽两根橡皮管上的夹子，放掉槽内的蒸馏水，待水流完后，再夹紧夹子。双手轻轻取出样品梳子，即可看到界线清楚的加样孔，将孔中水分吸去(注意千万不要碰坏孔沿的字面)。在上、下贮液槽中加入缓；中液，液体高度应超过上贮液槽短玻璃板上缘。用微量注射器吸取一定量的样品加到长、短玻璃板间的凹型凝胶样品孔内(

注意加样动作要轻，针头不能碰坏胶面)。

一贮液槽导线与电泳仪的负极相连，下贮液槽导线与电泳仪的正极相连。检查线路无误，方可按照所要求的电压电流进行电泳。

电泳结束，旋松螺母，取出胶框，剥出玻璃板，在两块玻璃板下角空隙内，用刀片背面轻轻撬动，即可将。胶面与一块玻璃板分开，将有胶板的玻璃板平放在桌上，双手轻轻沿凝胶底将胶片托起，放在大培养皿中染色，胶板经漂洗、脱色后即可看到清晰的分离条带，在紫外分析仪的观察下切取dna分子量最大的那个条带。

技术操作第三步pcr扩增：

纯化好合成的dna序列后，使用pcr仪对基因进行扩增，1实验环境：必须在无菌无尘环境下进行操作，所用的所有溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（dnase和rnase）污染。所有pcr试剂中使用的水都应该是高质量的－新鲜蒸馏的去离子水，用0.22μm过滤的，并且是高压灭菌。在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应，实验一下看试剂是否满意。所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。样品准备和前pcr区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。

2准备实验试剂：

准备好合成dna模版．

对应目的基因的特异引物．

10×pcrbuffer．

2mmdntpmix：含datp、dctp、dgtp、dttp各2mm．

taq酶、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×pcrbuffer5μl，dntpmix（2mm）4μ1，引物1（10pm）2μl，引物2（10pm）2μl，taq酶（2u/μl）1μl，dna模板（50ng-1μg/μl）1μl，加ddh2o至50μl，视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3．结束反应，pcr产物-20℃长期保存。

技术操作第四步合成dna测序：

使用纳米孔第三代测序仪对载体合成dna进行测序，如果合成的载体dna序列与模板序列不匹配哪就实验操作失误，需要重新重复做以上实验步骤了，确保载体序列无误，开始前准备：快速测序试剂盒（sqk-rad004）、计时器、1.5mleppendorfdnalobind管、流动池引物套件（exp-flp001）、加热至80°c1分钟的方法、0.2ml薄壁pcr管、超细离心机、移液器和移液器吸头p2，p10，p20，p100，p1000、无核酸酶的水。

用电脑设置纳米孔测序仪：

从桌面图标打开minknowgui，并建立本地或远程连接。如果在同一主机上运行minion，请将minion插入计算机。当连接名称出现在“本地”选项卡下时，单击

“连接”。如果在远程计算机上运行minion，请首先在“远程”下输入远程主机的名称或ip地址，然后单击“连

接”。将minion和流通池插入远程计算机；连接id将显示在minionconnection和flowcellconnection下。

输入要使用的sampleid和flowcellid，然后单击submit。

连接minion和流通池后，将出现“标签实验”对话框。

单击进入“样品id”框，并仅使用字母数字格式的自由文本来命名样品，删除存在的任何默认sample_id。警告：sampleid不应包含任何个人身份信息。单击“流动池id”框，然后输入“流动池id”，该id是在流动池顶部的不干胶标签上找到的代码。在“选择操作”下选择“平台质量控制”脚本，然后使用“执行”按钮启动脚本。

检查完成后，可在消息面板或通知中报告的可用于实验的活动孔的数量。

开始进行测序：

在室温下解冻试剂盒中的成分，使用微量离心机短暂旋转，然后通过移液混合，如下表所示：

lambdadna（lmd）：在室温下解冻，短暂旋转，用移液器充分混匀

fragmentationmix（fra）：未冷冻，短暂旋转，用移液器快速混匀快速接头

（rap）：未冷冻，短暂地旋转，混匀通过移液测序缓冲液（sqb）：在室温下解

冻，短暂旋转，通过移液均匀混合*

加载微珠（lb）：在室温下融化，短暂旋转，在使用前立即通过移液或涡旋混合。

冲洗绳（flt）：在室温下解冻，短暂旋转，用移液器充分混合

解冻后，将所有套件组件放在冰上。

在0.2ml薄壁pcr管中，混合以下物质：

7.5μllambdadna

2.5μlfra

轻弹试管轻轻混合，然后旋转。

将试管在30°c下孵育1分钟，然后在80°c下孵育1分钟。将10μl中的375ng带标签的lambdadna用于下一步。适配器附件向管中加入1μlrap。轻弹试管轻轻混合，然后旋转。将反应在室温下孵育5分钟。制备的dna文库用于加载到流通池中。将磁带库存放在冰上，直到可以装载为止。灌注和加载spoton流通池打开纳米孔测序仪的盖子，顺时针滑动流通池的注油口盖，以便可以看到注油口。

从流通池中提取缓冲液时必须小心。孔阵列必须始终被缓冲液覆盖。去除超过

20-30µl可能会损坏阵列中的孔。打开注油口后，检查盖子下是否有小气泡。抽回少量以清除任何气泡（几微升）：

将p1000移液器设置为200µl，

将吸头插入灌注端口

转动转盘，直到刻度盘显示220-230µl，或者直到看到少量缓冲液进入移液器吸头为止

准备流动池灌注混合物：将30µl解冻且混合的flushtether（flt）直接添加到解冻且混合的flushbuffer（flb）的管中，然后上下吸液进行混合。通过注油口将800µl的注油混合物装入流通池，避免引入气泡。等待5分钟。通过移液彻底混合sqb和lb管的内容物。在新试管中，按如下所示准备要装载的文库：34µl

测序缓冲液（sqb）

25.5微升装珠（lb）

4.5µl无核酸酶的水11

µldna库

完成流动池灌注：

轻轻提起spoton样品端口盖以使spoton样品端口可触及。

通过灌注端口（不是spoton样品端口）将200µl灌注混合物装入流通池，避免引入气泡。

在加载之前，通过上下吹打轻轻地混合准备好的文库。

通过spoton样品端口以逐滴方式将75μl样品添加到流通池中。在添加下一滴之前，请确保每个滴都

流入端口。

轻轻地装回spoton样品端口盖，确保塞子进入spoton端口，关闭注油端口，然后装回minion盖子。在电脑上面分析测序结果：使用桌面快捷方式打开桌面代理。

单击桌面代理中的“新建工作流”选项卡，然后选择“控制实验”工作流。检查在桌面代理中选择了正确的设置。点击“开始运行”开始数据分析。跟踪桌面代理中读取文件的上载和下载进度以及网络速度。

单击查看报告，单击查看报告以导航到metrichor网站，这可以在数据交换期间的任何时候完成

返回桌面代理以查看交换进度

关闭minknow和桌面代理

使用结束x退出桌面代理。

通过关闭webgui退出minknow。断开

minion的连接，对载体合成dna测序完成，确认序列无误进行下一步实验。

技术操作第五步环化合成dna：

使用dna连接酶将扩增的载体dna进行环化，

准备dna连接酶试剂：

10×ligationbuffer

tris-hclph7.8600mm

mgcl215mm

dtt100mm

atp10mm

在10~20ml反应体系中进行接反应，反应中dna浓度最大可达1mm(1kbdna约1mg/ml)。首先混合要接的合成载体dna片段，加入10×ligationbuffer至终浓度为1×，再加入适量t4dnaligase混匀。最适连接温度为16℃。粘末端连接效率较高，加入0.2~1mlt4dnaligase,平末端连接效率较低，加入1mlt4dnaligase，通常需要在16℃或4℃过夜完成反应，第二天将试管放入pcr仪中，设置温度70℃8分钟使dna连接酶失活，以免影响后期操作。

技术操作第六步电泳纯化：

环化的dna序列还需要纯化，因为dna连接酶可能把两个载体序列连接起来，那么这种载体序列不标准化，需要筛选出单个环状的载体序列，重复第二步实验使用电泳仪纯化出我们需要的单个环状的载体序列，切取的载体dna序列，图1至图10根据分子量位置。电泳位置和你制作凝胶浓度有关，和电泳电压有关。

技术操作第七步pcr扩增：

筛选纯化出需要的标准化载体dna，需要对载体dna进行扩增，重复做第三步实验，pcr基因扩增，扩增的载体dna，一部分保存到大肠杆菌里，一部分用于包装成病毒。

技术操作第八步保存合成载体：

将载体dna使用基因导入仪，导入大肠杆菌保存起来，使用的大肠杆菌不能携带其它质粒，不能有卡拉霉素的抗性基因，不能有载体dna序列酶切位点的酶，电击的培养液不能有盐的成分，否则会发生电火花，电击会产生温度应当将培养液冰冻一会儿，一般大肠杆菌设置电压1300伏。

设置基因导入仪，连接好仪器电源、导入盒（接输出插孔）等。2、将配有相应细胞液的导入杯装入导入盒内（大肠杆菌液一般用双重去离子水价甘露醇或葡萄糖等，浓度为10%～20%，电阻在3千欧左右）。3、打开电源开关，仪器通电，显示器有显示。按“参数设置步骤”的方法。设置实验所需的技术参数时，应先按储能电容(c)再按储能电压（u）最后按放电电阻(r)的具体数值，然后按rd键按一下即可，当屏幕中充电进度显示“99”时，按rd键进行导入，听到锋鸣器响声后，此时显示屏显示的是时间常数。电脑便进行储能电压,储能电容,放电电阻的选取及对所选定的储能电容充电,当充电电压稳定到所设置的电压值后,按rd键进行导入，立即向输出端(包括导入盒和所选定的放电电阻的并联电路)释放高压脉冲，进行有一定时间常数的放电过程，即电击穿、导入过程。（选择储能电压值、电容值和放电电阻值，是为了选取恰当的电能量和放电（rc）时间常数，以期获得刚好使细胞壁可逆击穿，基因导入的最佳效果。这是十分重要的。因为影响因素很多，要想获得高的转换率，必须依靠自己长期实践经验的积累。）4、若需二次放电，只要按u，然后再次按rd键即可。若要修改参数，则重复上述（3）的操作过程，可获得多次放电效果若需二次放电，只要按u，然后再次按rd键即可。若要修改参数，则重复上述的操作过程，可获得多次放电效果。5、若停止使用，可关电源开关，切断输入电源，取出导入杯。为安全起见，应在关断电源后，再取出为妥。

大肠杆菌基因导入操作用基因导入仪进行基因转化很有效。，可使1ug质粒dna[材料]e．coli单菌落lb培养基10%冰冷的甘油(丙三醇)scientz-2c基因导入仪含抗菌素的lb平板冰水soc培养基(0.5%酵母提取物,2%蛋白胨,10mmol/lnacl,20mmol/lmgso4,2．5mmol/lkcl,20mmol/l葡萄糖,10mmol/lmgcl2)[方法]（1）将e.coli单菌落接种于5mllb培养基中,在37℃下振荡培养过夜。取2.5ml新鲜培养液倒入500mllb培养基（用2l三角瓶）中，在37℃下振荡（300rpm）培养至细胞对数生长期（od600为0.5-0.6）。（2）将培养物在冰水中放置30分钟使细菌停止生长，然后倒入预冷的离心管中，在4℃下5000g离心10分钟，弃去上清液。（3）用100ml预冷10％甘油重悬细胞，4℃5000g离心10分钟，弃去上清液。（4）重复步骤（3）。（5）用5-10ml预冷10％甘油重悬细胞，100-200µl/管分装于无菌的1.5mleppendorf管中，保存于-80℃。（6）将基因导入仪的参数调至2.5kv，25uf，脉冲阻抗控制在200-1000欧姆。（7）加入不大于5ul质粒dna(5pg-0.5ug)和步骤(5)处理的冰冻大肠杆菌融化后置冰上，混合（增加dna样品体积会盐浓度加大，易产生电弧，转化率下降）。将混合液转到预冷的导入杯中，抹去杯外冰水后放入样品槽中。（8）释放电脉冲，取出导入杯立即加入1mlsoc培养基，并用吸管将菌液转至无菌小管中。在37℃下，缓慢振荡培养30-60分钟。（9）将上述转化大肠杆菌的培养液涂于抗菌素的lb平板上，过夜培养后在培养液加入卡拉霉素，基因导入完成。

技术操作第九步包装腺病毒：

把合成载体基因包装成腺病毒该病毒包装系统为两质粒系统，组成合成载体基因，包括包括过表达、干

扰等类型）和图12骨架质粒（pbhglox(delta)e1,3cre)。

1、载体基因

2、菌株：大肠杆菌菌株dh5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

3、细胞株：293a，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因e1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为dmem+10%fbs+双抗（dmem完全培养基）。293a细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，

则293a细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特

性。若以购买得到的293a作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增

加，293a细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在

初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，

以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，

浓度要求大于1mg/ml，

a260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。

推荐使用qiagen大抽试剂盒进行质粒的

大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。腺病毒包装

事先准备好用于包装病毒的293a细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6cm的培养皿成分如下：

合成的腺病毒载体2μg，

pbhglox(delta)e1,3cre4μg，

dmem需在37℃水浴中预热，lipofitertm转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使

用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。

技术操作第十步提取病毒收集和纯化病毒，

2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果载体基因带有荧光蛋白（gfp或rfp），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。第二天，将培养基中病毒加入新鲜293a细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为p1代病毒，以p1代腺病毒感染293a细胞，连续进行三代感染，至p4代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。

毒纯化采用peg8000沉淀-cscl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，具体操作如

下:、融化：提前1天将病毒从-80℃冰箱拿出，室温水浴融化。收集全部细胞裂解物，

7000×g4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清。收集病毒：用注射器收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析

袋中。透析袋使用前用10mmedta-na2煮沸10min，降至室温使用。

5、透析：在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml1mtris-hcl，ph8.0，2ml1mmgcl2

定容至1l）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

6、重悬：500μlpbs重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需

置于-80℃保存。

技术操作第11步活体腺病毒注射:

对于动物体内实验，想要达到预期实验效果，所需病毒量一般都比较大。不同的注射部位，不同的感染方式，所需要的病毒注射量和体积都不一样。一般而言，用于动物在体注射的病毒，小鼠一般要1x109pfu，腺病毒载体需要达到1x1011pfu。

不同的种属，不同的注射部位，需要注射不同的病毒总量以达到效果，因此，根据病毒的大致使用量，除以滴度，可以得到需要注射的病毒体积。然而，更多的时候，动物目的部位所能容纳的体积有较高的要求，而这也是注射的时候往往容易被忽略的问题。不同的注射部位和方式，注射体积不一样。比如脑区只能接收极小体积（1-5ul）的注射体积，尾静脉为100-500ul，而腹腔则可以接受ml级别的病毒注射量，实验的模式动物应该是体型较小，寿命较短的哺乳动物，保持每个月注射一次腺病毒载体，可观察出实验的结果。

预期实验报告

西班牙国家癌症中心发表研究报告：

使用腺病毒延长小鼠端粒，表现出衰老更少，寿命更长，体重脂肪减少，小鼠寿命提升24%，没有出现不良反应和癌症发生，

以下是研究报告原文的摘要：

端粒短会触发与年龄有关的病理，小鼠和人类的寿命也会缩短。过去，在没有基因操作的情况下，我们产生的小鼠胚胎（es）细胞端粒比正常细胞（超长端粒）长，这对所有小鼠组织都有贡献。为了解决超长端粒是否具有有害作用，我们生成了小鼠，其中其细胞100％来自超长端粒es细胞。我们观察到，这些小鼠的端粒更长，并且随着年龄的增长对dna的损伤更少。超长端粒小鼠瘦弱，胆固醇和低密度脂蛋白水平低，并且葡萄糖和胰岛素耐受性提高。超长端粒小鼠的癌症发病率也更低，寿命也更长。这些发现表明，在给定物种中，端粒长于正常水平并不有害，但相反。

以下是哈弗医学院的实验报告，报道讲述将小鼠的端粒基因敲除，结果小鼠未老先衰，而导入端粒酶后，小鼠器官恢复正常。

据香港《文汇报》，科学杂志《自然》网站刊登美国哈佛医学院的科研报告，哈佛科学家最近破天荒地令年老的老鼠器官获得新生，成功逆转衰老过程，这项突破成果或有望防治脑退化症(老人痴呆症)、糖尿病和心脏病等疾病，甚至有望打开永恒青春的奥秘，进一步迈向研制“长生不老药”。

，研究员饲养了一些经基因改造的老鼠，令它们因缺乏“端粒”(telomerase)而未老先衰，出现嗅觉衰退、脑部缩小、不育、肠部和脾脏受损等疾病，使它们皮肤、大脑、内脏和其它器官老化。

所谓“端粒”，是指染色体末端的dna重复序列，作用是保持染色体的完整性。“端粒”的长度反映着细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。

雄鼠恢复生育能力

报道称，科研人员将这些老鼠分为两组，把一种名为“tert”的定时释放药物，植入其中一组老鼠的皮下，重启它们体内休眠的“端粒”基因。

结果在短短2个月内，有注射tert的老鼠体内长出许多新的细胞，主要器官运作功能改善，身体差不多完全“返老还童”，当中雄性的老鼠更恢复生育功能。实验鼠最终活到正常鼠的寿命，但并不比普通鼠寿命长。

进行研究的德皮尼奥博士表示，实验鼠对人类而言，就像一个40岁的人，身体未老先衰像80多岁的老人，而这项实验逆转衰老过程，把他变回50岁一般。

德皮尼奥说：“这些是严重衰老的动物，但经过一个月治疗后，它们已有具体康复迹象，包括脑部长出新的细胞。”他指出，这是首次有老鼠实验成功把衰老过程逆转，意味着一些老化的器官也有“重生”的可能。

在实验室对于单个细胞株，使用载体导入端粒酶基因，就可以让细胞获得永生化，这种实验报告仅国内就有几百个，细胞和衰老是联系在一起的，以前科学家都以为生物活体和衰老和细胞没关系，德国一个科学家利用衰老细胞基因表达的标签基因启动子，和细胞自杀基因连接在一起导入小鼠胚胎细胞，杀死衰老细胞，结果小鼠比其它小鼠健康，细胞和生物活体衰老是联系在一起的，

以下是：

2014-07-28全国动物生理生化第七届全国代表大会暨第十三次学术交流会

会议地点：中国辽宁沈省2

发表的实验报告

端粒是真核细胞染色体末端dna和一些相关蛋白共同组成的复合体。端粒序列长度有伴随着年龄增长而逐渐变短的趋势,导致细胞衰老。人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,htert)是控制端粒酶活性的关键成分,是由rna和蛋白质组成的dna聚合酶,能以自身内在的rna组分为模板合成端粒dna,补偿细胞分裂时端粒dna的缩短,从而维持端粒获得永生化。

本人实验报告

对于单细胞株使用载体导入端粒酶基因获得永生化的实验报告很多，但是哺乳动物活体使用载体导入端粒酶基因的实验报告全世界只有几个，对于端粒酶在活体的副作用的实验报告全世界基本没有，俗话说是药三分毒，一定要了解清楚治疗产生的副作用，找出应对方案，本人的实验方案针对副作用，和治疗的预期效果。首先使用的腺病毒载体并没有删除基因复制起点，因为这样端粒酶才能持久表达，更加容易观察出副作用和预期效果。

实验内容如下：使用带有3ltr、5ltr的腺病毒载体，使用两种酶把腺病毒载体基因切开，3端和5端的酶切位点不一样，端粒酶基因使用了两种酶切下，使用dna连接酶把端粒酶基因正确的连接在腺病毒载体上，电泳纯化出已经连接正确的腺病毒载体，pcr扩增腺病毒载体和pbhglox(delta)e1腺病毒骨架质粒，263a细胞使用基因导入仪导入这两种基因载体，包装成腺病毒颗粒，一周后细胞反复冻融然后机械细胞破碎仪破碎细胞，提取腺病毒颗粒，融将纯化好的腺病毒，每月使用定量微针注射到小鼠体内，经过一年半的观察，小鼠的身体正常没有什么不良反应，行为也更加活跃，饮食数量有增加，图4是个人实验室和小鼠照片，实验的小鼠的寿命一般在2~3年，细胞数量大约在一万亿左右，一次注射比较理想的腺病毒载体数量应该是哺乳动物细胞数量的10%半年注射一次，在实验室包装效率不高，实验的小鼠已经注射了腺病毒载体20多次，目前小鼠身体质量很好，预期寿命能达到4年，没有出现副作用。首先声明一下说明书虽然提到永生化，读者千万不要以为延长维持端粒基因就可以永生化了，那是针对单个细胞株而不是生物活体，延长维持端粒基因的确可以让单个细胞株永远化，仅国内这样的实验报告就有几百个，生物活体延长维持端粒基因可以提升寿命20%~60%，增加细胞分裂次数，让身体健康状态更加良好，可以把延长维持端粒基因看做是逆转衰老的一个治疗步骤，达到永生化还有很多研究工作要做。

实施方式：

用于端粒延长的基因治疗产品，需要大量的病毒颗粒，足够的多的数量才能达到理想效果，纯化出安全无毒对人体没有影响的基因治疗产品，一次治疗使用的治疗载体数量在5万亿左右，这大约是人体细胞数量的10%，现有包装技术效率低可能无法办到或成本高昂，为了让每个人都能享受治疗的好处，结合本人包装方法可高效率的包装出治疗载体。在无菌医疗室降低治疗者免疫功能，通过静脉输液的方式将腺病毒治疗载体输入人体内，治疗者会有发烧的症状，过两天症状就会消除并且完成了治疗恢复免疫能力，治疗载体刚进入人体细胞，在一周时间内治疗载体依然会起到治疗效果，一次基因治疗完成了上千亿细胞的端粒延长，可更新分裂细胞多出上万亿个，寿命提升约百分之一，治疗者只需要半年做一次治疗，就可以保证身体端粒不会耗损，达到健康逆转衰老的治疗效果，随着年龄增加身体端粒耗损过多，会出现一系列衰老的疾病如癌症和中风带来健康的风险，长期保持治疗预计提升寿命可达50%以上，在实验室对单个细胞株只需要延长端粒，已经赋予了这个细胞永生化，对于人体细胞而言会提升寿命是细胞更新的基础，实现最理想的抗衰老治疗，还受身体细胞数量约8%高度分化不可分裂细胞限制，突破寿命极限还需要对不可分裂细胞进行干细胞再生治疗，干细胞再生治疗世界目前有一定成果，本发明对干细胞的安全性的扩增培养有这重要用途。

序列表

<110>刘玉文

<120>一种端粒基因治疗产品和哺乳动物广泛性启动子的用途

<150>2019109079007

<151>2019-09-24

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>7168

<212>dna

<213>ad5-ef1a腺病毒(ad5-ef1aadenovirus)

<400>2

tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccg60

ggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttgggg120

ggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagt180

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