一种双基因修饰的干细胞及其用途的制作方法

文档序号：23463186发布日期：2020-12-29 12:44阅读：122来源：国知局

本发明属于细胞治疗技术领域，具体涉及治疗糖尿病的干细胞，尤其涉及一种经脂联素(adiponectin)和突变的鞘氨醇激酶1(sphingosinekinase1，sphk1)基因共同修饰的干细胞及其用途。

背景技术：

肥胖与2型糖尿病(t2dm)是困扰现代社会的主要公共健康问题之一。肥胖及其伴随的胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，据调查，80-90％的2型糖尿病患者超重或肥胖。因此，有效控制血糖和体重始终是有关研究领域的焦点课题。据统计，目前全球2型糖尿病的发病人群已经达到4亿，占所有糖尿病患者的90％-95％。内源性的激素、细胞因子或酶类的分泌不足、活性降低或功能缺陷与代谢病的发生密切相关，如胰岛素抵抗和相对分泌不足是导致糖尿病的核心原因。因此，这些糖脂代谢平衡调控的关键分子也是治疗糖尿病等代谢综合征药物开发的重点对象。

脂联素(adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，其作为一种胰岛素增敏激素，能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症。对人体的研究发现，脂联素水平能预示ii型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。脂联素作为一种胰岛素超敏化激素，还可以增加促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化和糖吸收，明显加强胰岛素的抑制糖原异生作用，抑制肝脏的糖生成，是机体的脂质代谢和血糖稳态的调控网络中的重要调节因子。

在实验性动脉粥样硬化模型中，血浆脂联素水平与甘油三酯和低密度脂蛋白成负相关关系，与高密度脂蛋白成正相关关系。给予脂联素治疗，能明显降低血液甘油三酯和低密度脂蛋白含量，增加高密度脂蛋白含量，减轻动脉粥样硬化病变。越来越多的证据表明，脂联素及其人工合成体在治疗2型糖尿病和与胰岛素抵抗有关的代谢综合征方面有一定的价值。最近研究报道体内迅速给予切去顶端的脂联素，会降低高脂饮食小鼠的餐后血浆游离脂肪酸，如果缓慢给予这种蛋白，会引起小鼠体重持续降低而不影响其食物吸收。scherer和他的助手也证实迅速注射重组脂联素，将会完全改善几种糖尿病动物模型体内的高血糖症，包括ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病小鼠和经链脲霉素治疗的小鼠。

鞘氨醇激酶1(sphk1)是新近发现的脂质激酶家族，从进化上讲，在人、小鼠、酵母和植物中是保守的，该酶属于鞘脂代谢途径中的一种关键酶，催化鞘氨醇形成鞘氨醇-1-磷酸(s1p)，是调控神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸(s1p)合成的“变阻器”。

s1p与受体结合后可调控细胞生长、凋亡、分化、造血等细胞过程。sphk1/s1p信号通路参与了多种生物学过程和疾病的发生，包括肿瘤发生和糖尿病。此外，糖尿病小鼠在注射了带有人sphk1基因的腺病毒之后，与对照小鼠相比显示了降低的血糖和血脂水平。目前对sphk1的研究主要是基于其在细胞内的作用，以该蛋白为靶点开发的药物主要是使用其抗体或拮抗体，并没有直接将该蛋白制成药物进行治疗；另一种是以病毒等为载体，将sphk1基因导入到细胞进行基因治疗，例如用腺病毒作为载体的基因治疗，但是该种方法容易在体内产生抗药性，而治疗糖尿病等代谢性疾病需要长期用药，故限制了该方法的使用。

因此，亟需开发一种全新的、能够从根本上显著治疗糖脂代谢性疾病的方法。

技术实现要素：

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：采用adiponectin基因和突变的sphk1基因同时修饰的间充质干细胞，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重，且可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应，为代谢性疾病的治疗提供了重要的研究依据，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

本发明的第一方面，提供了一种双基因修饰的干细胞，所述干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，所述第一外源核酸包括编码第一蛋白的核苷酸序列，所述第二外源核酸包括编码第二蛋白的核苷酸序列，其中，

所述第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白，

所述第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。

其中，所述第一蛋白具有如seqidno：1所示的氨基酸序列；

所述第二蛋白具有如seqidno：2所示的氨基酸序列。

其中，所述细胞还包括表达载体，所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同或不同的表达载体中，

优选包含于相同的表达载体中。

其中，所述双基因修饰的干细胞通过将第一外源核酸和第二外源核酸导入间充质干细胞获得。

第二方面，提供了一种双基因修饰的干细胞的制备方法，优选用于制备上述的干细胞，其中，所述制备方法包括将第一外源核酸和第二外源核酸连接，并导入间充质干细胞的步骤。

其中，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，获得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后与载体质粒连接，得到重组质粒；

步骤2，将重组质粒与包装质粒进行慢病毒包装细胞的转染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重组慢病毒载体；

步骤3，将上述获得的重组慢病毒载体转染至间充质干细胞，得到双基因修饰的干细胞。

第三方面，提供了一种上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞。

第四方面，提供了一种上述的干细胞或上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞在制备治疗代谢疾病药物中的应用。

其中，所述代谢疾病选自肥胖、i型糖尿病、ii型糖尿病、血脂异常、胰岛素耐受、高血糖、代谢综合征、动脉粥样硬化、冠心病，以及上述疾病的继发性并发症。

第五方面，提供了一种药物组合物，其中，所述组合物包括上述的干细胞或上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞。

本发明所具有的有益效果包括：

(1)本发明提供的双基因修饰的干细胞，能够同时表达脂联素和鞘氨醇激酶1，展现出adiponectin基因和突变的sphk1基因的协同效应，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重；

(2)本发明提供的双基因修饰的干细胞，既保持间充质干细胞的功能，又能很好的表达脂联素和鞘氨醇激酶1蛋白，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应；

(3)本发明提供的双基因修饰的干细胞，具备显著提高的降低血糖、血脂等生物学活性，能够有效用于制备治疗代谢疾病的药物，具有重大的临床价值。

附图说明

图1示出根据本发明一种优选实施方式的pcdh-aqs基因质粒图谱；图2示出实验例1中realtime-pcr检测的adiponectin和qsphk1表达量的结果图；图3示出实验例1中elisa检测的adiponectin和qsphk1表达量的结果图；图4示出实验例2中各样品对固醇代谢基因srebp1cmrna表达水平的影响的检测结果；图5示出实验例2中各样品对固醇代谢基因srebp1和srebp2蛋白水平的影响的检测结果；图6示出实验例3中各样品对脂代谢调控基因p-ampk和ampk表达水平的影响的检测结果；图7为糖尿病模型鼠随机体重改变趋势图，箭头代表给予药物和细胞的时间点；图8为糖尿病模型鼠空腹血糖改变趋势图，箭头代表给予药物和细胞的时间点；图9为细胞治疗28天后不同实验组糖尿病模型鼠体型对比图；图10为细胞治疗28天后不同实验组糖尿病模型鼠肝脏和腹部皮下脂肪he染色图；图11为细胞治疗28天后不同实验组糖尿病模型鼠血清中血脂水平检测柱状图。

具体实施方式

下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明人通过对脂联素(adiponectin)和鞘氨醇激酶1在糖脂代谢平衡中的研究和反复探索发现，同时表达脂联素和鞘氨醇激酶1的干细胞，具备显著提高的降低血糖、血脂等生物学活性。考虑到现有技术中的蛋白药物或基因治疗的缺陷，发明人从基因修饰的角度出发，采用脂联素(adiponectin)基因和鞘氨醇激酶1基因(sphk1基因)共同修饰干细胞，既能够展现出双基因显著的协同效应，又能够避免引发免疫原性反应，具有重大的临床价值。

因此，本发明的第一方面，提供了一种双基因修饰的干细胞，所述干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，所述第一外源核酸包括编码第一蛋白的核苷酸序列，所述第二外源核酸包括编码第二蛋白的核苷酸序列，其中，

所述第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白，

所述第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。

根据本发明一种优选的实施方式，所述脂联素变体与其源自的序列相比，具有一个或多个氨基酸的替换、插入或删除，或者具有至少80％以上，优选95％以上，如99％的序列同一性，且保留了脂联素的活性；

所述鞘氨醇激酶1变体与其源自的序列相比，具有一个或多个氨基酸的替换、插入或删除，或者具有至少80％以上，优选至少95％以上，如99％的序列同一性，且保留了鞘氨醇激酶1的活性。

其中，脂联素变体保留脂联素的活性，即保留其增加促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化和糖吸收、加强胰岛素的抑制糖原异生作用、降低血液甘油三酯和低密度脂蛋白含量的能力；

所述鞘氨醇激酶1变体保留鞘氨醇激酶1的活性，即保留其催化神经酰胺的代谢产物鞘氨醇生成s1p的能力。

在进一步优选的实施方式中，所述第一蛋白为脂联素或包含脂联素的第一融合蛋白；

所述第二蛋白为鞘氨醇激酶1或包含鞘氨醇激酶1的第二融合蛋白。

在更进一步优选的实施方式中，所述第一蛋白具有如seqidno：1所示的氨基酸序列，

所述第二蛋白具有如seqidno：2所示的氨基酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述第一外源核酸编码第一蛋白，第二外源核酸编码第二蛋白，

优选地，所述第一外源核酸为脂联素基因(adiponectin基因)，第二外源核酸为突变的sphk1基因(记为qsphk1基因)。

本发明人对鞘氨醇激酶1的蛋白序列进行分析发现，其n-端含有一个保守的gkgk结构域，该结构域出现在多种发生乙酰化修饰的蛋白序列中，其中的k是发生乙酰化修饰的位点，鞘氨醇激酶1乙酰化发生在其gk结构域的k上。sphk1乙酰化修饰后其稳定性能够增强，将gkgk结构域中的两个k(赖氨酸)分别突变为精氨酸(r)或谷氨酰胺(q)，封闭了sphk1的泛素化修饰，避免了被蛋白酶体降解，增强了其活性。

基于此，本发明中优选将sphk1基因进行了突变，使得编码的鞘氨醇激酶1的gkgk结构域中的k突变为r或q，以提升该蛋白的稳定性和作用活性。

其中，可以采用本领域常用的方法进行突变，例如利用点突变实验技术将sphk1基因中编码gkgk结构域中k的碱基进行突变。

在进一步优选的实施方式中，所述第一外源核酸具有如seqidno：3所示序列或seqidno：3替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列，优选具有seqidno：3所示序列；

所述第二外源核酸具有如seqidno：4所示序列或seqidno：4替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列，优选具有seqidno：4所示序列。

例如：第一外源核酸的核苷酸序列如seqidno：3所示，第二外源核酸的核苷酸序列如seqidno：4所示。

根据本发明一种优选的实施方式，所述双基因修饰的干细胞还包括表达载体，所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同或不同的表达载体中，

优选包含于相同的表达载体中。

在进一步优选的实施方式中，所述第一外源核酸和第二外源核酸通过编码自我切割肽的序列连接，

所述编码自我切割肽的序列连接在第一外源核酸的3'端和第二外源核酸的5'端之间。

在本发明中，所述自我切割肽包括但不限于源自口蹄疫病毒(fmdv)、马鼻炎a病毒(erav)或褐翅蛾病毒的2a肽，优选为源自褐翅蛾病毒的2a肽。

在更进一步优选的实施方式中，所述2a肽包含如seqidno:5所示的氨基酸序列，优选2a肽的氨基酸序列如seqidno:5所示。

优选地，所述编码自我切割肽的序列包含如seqidno:6所示的核苷酸序列，优选编码自我切割肽的序列如seqidno:6所示。

根据本发明一种优选的实施方式，所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸包含如seqidno:7所示的核苷酸序列，

优选地，所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸的核苷酸序列如seqidno:7所示。

在进一步优选的实施方式中，所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸编码具有seqidno:8所示氨基酸序列的蛋白，

优选地，所述连接后的第一外源核酸和第二外源核酸编码如seqidno:8所示氨基酸序列的蛋白。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞为间充质干细胞，来源于脂肪组织、脐带、骨髓或脐血，优选来源于脐带。

其中，所述间充质干细胞(msc)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。此外，其具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制t细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；同时，间充质干细胞来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

脐带间充质干细胞来源于离体的脐带组织，取材方便，来源广泛，不受伦理的争论和限制，同时取材对供者无创伤，不受供者年龄因素的影响，体外分离培养简单，扩增迅速，免疫源性较低，无致瘤性，可作为基因治疗的细胞子载体。在体内或体外特定的诱导条件下，脐带间充质干细胞可分化为多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，是细胞移植治疗的理想种子细胞。

因此，本发明中优选采用脐带来源的间充质干细胞。

在进一步优选的实施方式中，所述双基因修饰的干细胞通过将第一外源核酸和第二外源核酸导入间充质干细胞获得。

本发明所述的双基因修饰的干细胞，展现出adiponectin基因和突变的sphk1基因的协同效应，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重，且可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。

本发明的第二方面，提供了一种双基因修饰的干细胞的制备方法，所述方法包括将第一外源核酸和第二外源核酸连接，并导入间充质干细胞的步骤。

根据本发明一种优选的实施方式，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1，获得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后与载体质粒连接，得到重组质粒；

步骤2，将重组质粒与包装质粒进行慢病毒包装细胞的转染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重组慢病毒载体；

步骤3，将上述获得的重组慢病毒载体转染至间充质干细胞，得到双基因修饰的干细胞。

以下进一步描述双基因修饰的干细胞的制备方法：

步骤1，获得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后与载体质粒连接，得到重组质粒。

其中，所述第一外源核酸优选为adiponectin基因，其具有如seqidno：3所示的核苷酸序列；第二外源核酸优选为突变的sphk1基因，具有如seqidno：4所示的核苷酸序列。

所述第一外源核酸和第二外源核酸优选通过t2a序列连接，所述t2a序列如seqidno:6所示。

在本发明中，首先pcr扩增获得adiponectin-t2a片段，再获得qsphk1片段，通过琼脂糖凝胶电泳回收片段。

根据本发明一种优选的实施方式，扩增adiponectin-t2a片段的引物对为ef1-bamhi-adiponectin-f和t2a-sphk1-r，分别具有如seqidno:9和seqidno:10所示的核苷酸序列；

扩增qsphk1片段的引物对为t2a-sphk1-f和sphk1-sali-wpre-r，其核苷酸序列分别如seqidno:11和seqidno:12所示。

在本发明中，采用现有技术中常用的方法对载体质粒进行双酶切，然后与扩增得到的adiponectin-t2a片段、qsphk1片段进行重组连接、转化至大肠杆菌dh-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行pcr鉴定，正确菌落测序、测序正确的菌落进行质粒提取，获得重组克隆质粒，如图1所示的pcdh-aqs质粒，adiponectin-qsphk1的核苷酸序列如seqidno:7所示，编码的氨基酸序列如seqidno:8所示。

其中，所述载体质粒为重组慢病毒载体质粒pcdh-ef1，双酶切采用的酶优选为bamhi和sali。

步骤2，将重组质粒与包装质粒进行慢病毒包装细胞的转染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重组慢病毒载体。

其中，步骤2包括以下子步骤：

步骤2-1，培养包装细胞。

在本发明中，所述包装细胞优选为293t细胞，将293t细胞活化后重悬，接种至培养皿中培养，待细胞汇合度达90％以上时，进行消化；终止消化后，对细胞进行离心、重悬，在每个包被过的培养皿中接种细胞用于包装病毒，优选每个培养皿(150mm)接种1×10⁷～1.5×10⁷个细胞，优选每个培养皿接种1.2×10⁷个细胞。

其中，293t细胞的培养基为10％fbs+dmem培养基。

步骤2-2，转染包装细胞。

具体地，将包装质粒与步骤1获得的重组克隆质粒(pcdh-aqs)混合，温育后加入转染试剂，室温孵育，形成dna-脂质体转染复合物。

在本发明中，所述包装质粒可以为现有技术中常用的慢病毒包装辅助质粒，如购自addgene的helper1质粒、helper2质粒和helpher3质粒，优选pcdh-aqs质粒、helper1质粒、helper2质粒和helpher3质粒的质量比为2:1:1:1。

所述转染试剂可以为现有技术中常用的试剂，例如可以为lipofectamin2000(购自invitrogen)溶液，转染试剂与dmem培养基混合后成滴的加入到上述质粒混合体系中。

将dna-脂质体转染复合物与包装细胞混合均匀，培养，培养过程中定时换液，换液后收集上清液体存储于4℃。

根据本发明一种优选的实施方式，对收集的上清液体进行浓缩，并进行病毒滴度测定，

所述浓缩优选为对上清液体低温离心，弃沉淀后上清用millipore蛋白超滤柱(100kd)浓缩。

其中，所述病毒滴度测定优选按照现有技术常用方法进行，根据的测定结果将病毒稀释为1×10⁸tu/ml，并置于-80℃保存。

通过上述步骤，可以获得携带adiponectin和qsphk1的慢病毒载体，记为lenti-aqs。

步骤3，将上述获得的重组慢病毒载体转染至间充质干细胞，得到双基因修饰的干细胞。

根据本发明一种优选的实施方式，所述干细胞为间充质干细胞，来源于脂肪组织、脐带、骨髓或脐血，优选来源于脐带。

优选地，采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞。

具体地：将正常分娩的离体脐带放入含有200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的pbs缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。用20ml注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块。收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％co2、37℃培养箱内，静置1-2h。待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-mem培养液，置于5％co2、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％edta)消化，所得细胞为原代细胞。脐带组织块爬片法分离培养msc，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆，制得的间充质干细胞冻存。

步骤3包括以下子步骤：

步骤3-1，对干细胞进行培养，接种。

对预先冻存的干细胞进行复苏培养，待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，终止消化后，离心、重悬细胞。然后接种细胞至培养皿，优选每个培养皿(150mm)接种2×10⁶～2.5×10⁶个细胞，接种后第二天更换培养基。

步骤3-2，加入慢病毒载体lenti-aqs，继续培养。

向接种后的细胞中加入聚凝胺(polybrene)，根据细胞moi值及病毒滴度，加入相应体积的慢病毒载体，进行培养。

其中，加入的慢病毒载体体积＝(moi×细胞数目)/病毒滴度。所述moi指的是转导时病毒与细胞数量的比值，在本发明中，所述moi优选为10～50，如40。

在37℃、5％co2饱和湿度培养6-8h，然后弃掉含有病毒的培养基，更换为无血清培养基，37℃、5％co2饱和湿度继续培养2-3天。

步骤3-3，对细胞进行传代培养。

在本发明中，待基因修饰后的细胞长满，采用0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％co2培养3天至细胞长满，获得双基因修饰的干细胞，记为msc-aqs。

本发明的第三方面，提供了上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞。

本发明的第四方面，提供了第一方面所述的双基因修饰的干细胞或第二方面所述方法制备得到的干细胞在制备治疗代谢疾病药物中的应用。

优选地，所述代谢疾病选自肥胖、i型糖尿病、ii型糖尿病、血脂异常、胰岛素耐受、高血糖、代谢综合征、动脉粥样硬化、冠心病，以及上述疾病的继发性并发症。

更优选地，所述代谢疾病选自肥胖、ii型糖尿病、血脂异常、高血糖以及上述疾病的继发性并发症。

例如，所述代谢疾病选自肥胖、ii型糖尿病、血脂异常及高血糖。

本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，其包括第一方面所述的双基因修饰的干细胞或第二方面所述方法制备的干细胞。

其中，所述药物组合物的剂型可以为医学领域已知的任何形式，优选为片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、注射剂、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或栓剂，更优选为注射剂。

优选地，所述药物组合物还包括药学上接受的载体或赋形剂，优选包括药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液(例如：平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。

更优选地，所述药物组合物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物的形式进行移植。

在本发明中，所述药物组合物的配置按照现有技术中规定的细胞药物的原则进行，例如可以按照《造血干细胞疗法(hematopoieticstemcelltherapy)》，e.d.ball，j.lister&p.law，churchilllivingstone，2000进行。

根据本发明一种优选的实施方式，所述药物组合物可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射或口服的方式施用给受试者，

所述受试者是哺乳动物，例如人。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1间充质干细胞的获得

采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞，具体步骤如下：

将正常分娩的离体脐带放入含有200u/ml青霉素和200u/ml链霉素的pbs缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。用20ml注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm³大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块。收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％co2、37℃培养箱内，静置1-2h。待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-mem培养液(购自gibco)，置于5％co2、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％edta)消化，所得细胞为原代细胞。脐带组织块爬片法分离培养msc，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆，制得的间充质干细胞冻存。

实施例2adiponectin和qsphk1基因的克隆与载体构建

由中美泰和生物技术(北京)有限公司全基因合成编码adiponectin和qsphk1的dna分子，其中，adiponectin(氨基酸序列为seqidno:1，编码序列为seqidno:3)与qsphk1(氨基酸序列为seqidno:2，编码序列为seqidno:4)通过t2a序列(氨基酸序列为seqidno:5，编码序列为seqidno:6)连接。

用引物ef1-bamhi-adiponectin-f(核苷酸序列为seqidno:9)和引物t2a-sphk1-r(核苷酸序列为seqidno:12)扩增adiponectin-t2a片段(851bp)，用引物t2a-sphk1-f(核苷酸序列为seqidno:11)和引物sphk1-sali-wpre-r(核苷酸序列为seqidno:10)扩增qsphk1片段(1278bp)，通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

将重组慢病毒载体质粒pcdh-ef1(购自addgene)用bamhi和sali双酶切，用2xmix重组酶(购自clonesmarter公司)酶切产物胶回收后的载体与adiponectin-t2a片段和qsphk1片段重组连接，转化dh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布至含有氨苄抗性的lb板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落pcr，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，命名为pcdh-aqs，其核苷酸序列如seqidno:7所示，氨基酸序列如seqidno:8所示。

实施例3携带adiponectin基因和qsphk1基因的慢病毒载体的制备

从液氮中取出1支冻存的293t细胞(购自addgene)迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293t培养基(10％fbs+dmem)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度培养。待细胞汇合度达90％以上时，弃去旧培养基，加入5ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去pbs溶液，加入2ml0.25％trypsin-edta消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬，每个150mm培养皿细胞接种1.2×10⁷细胞用于包装慢病毒，37℃、5％co2饱和湿度培养，20ml培养基/皿。

转染前2h，将293t细胞培养基更换为18mldmem培养基，向a灭菌离心管中加入1ml预热的dmem培养基，然后加入上述所制备的pcdh-aqs质粒、helper1质粒、helper2质粒和helpher3(pcdh-aqs:phelper1:phelper2：helpher3＝2:1:1:1，共54μg，helper1、helper2和helper3质粒为慢病毒包装的辅助质粒，购自addgene)，混合均匀。向b灭菌离心管中加入1ml预热的dmem培养基，然后加入108μllipofectamin2000(购自invitrogen)溶液，混合均匀。a管和b管在室温下温育5分钟。将b管中的液体成滴的加入到a管中，混合均匀，室温孵育20min，以便形成dna-脂质体转染复合物。

将dna-脂质体混合液转移至预先换液的293t细胞中，混匀，37℃、5％co2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％fbs的dmem培养基，37℃、5％co2饱和湿度培养。换液后分别在24h和48h，收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。将收集到的液体4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，将上清用millipore蛋白超滤柱(100kd)进行浓缩，从而获得携带adiponectin和qsphk1的慢病毒载体(lenti-aqs)；同时进行病毒滴度测定，根据测定结果将病毒稀释为1×10⁸tu/ml，分装后的病毒置于-80℃保存。

实施例4间充质干细胞的双基因修饰

复苏预先冻存的p3代间充质干细胞至一个150mm培养皿，20ml无血清培养基37℃、5％co2饱和湿度培养。待复苏细胞长满后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用msc无血清培养基(购自bioind)重悬。

每个150mm培养皿细胞接种2-2.5×10⁶细胞，接种后的第二天吸取细胞的培养基弃掉，更换为无血清的α-mem培养基，20ml培养基/皿，加入16μlpolybrene(购自sigma)，按照40mois感染复数同时加入2中获得的lenti-aqs慢病毒(滴度为1×10⁸u/ml)，37℃、5％co2饱和湿度培养6-8h。6-8小时后弃掉含有病毒的α-mem培养基，更换为无血清培养基，37℃、5％co2饱和湿度继续培养2-3天。

待基因编辑后的细胞长满，0.05％胰蛋白酶消化细胞，用含血清的培养基终止消化，细胞悬液800rpm离心5min，离心所得细胞用无血清培养基重悬，按照1:6的传代比例进行传代，无血清培养基37℃、5％co2培养3天。双基因修饰的间充质干细胞命名为msc-aqs。

对比例

对比例1

按照实施例1至实施例4所述方法制备获得adiponectin单基因修饰的间充质干细胞，记为msc-a。

对比例2

按照实施例1至实施例4所述方法制备获得qsphk1单基因修饰的间充质干细胞，记为msc-qs。

对比例3

本对比例所述样品为经空载体修饰的间充质干细胞，记为msc。

实验例

实验例1生物学功能的验证

(1)细胞表型的鉴定：

选择p6代未经修饰的间充质干细胞和经双基因修饰的间充质干细胞(msc-aqs)，用0.05％胰酶消化，pbs洗两遍后用小鼠抗人cd14-percp-cy5.5、cd19-pe、cd34-pe、cd45-pe或cd45-fitc、hla-dr-pe、cd73-pe、cd90-pe及cd105-pe(becton，dickinsonandcompany)抗体标记细胞，每个待测样品标记1×10⁶个细胞，室温避光孵育30min，pbs洗两遍后，用2％多聚甲醛固定，采用流式细胞仪检测。

结果显示，lenti-aqs慢病毒感染后的间充质干细胞(msc-aqs)，其表面marker仍然保持间充质干细胞的特性，即cd73、cd90和cd105呈阳性(>90％)，cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr呈阴性(<1％)。

(2)成脂和成骨分化诱导：

选择p6代未经修饰的间充质干细胞和经双基因修饰的间充质干细胞(msc-aqs)，用0.05％胰酶消化，按照2×10⁵个/孔的细胞密度铺于12孔板中，第2天更换为成脂诱导培养基和成骨诱导培养基(购买自bi公司)，之后每隔2天换液，成脂诱导于18天后进行油红o染色，成骨诱导于23天后进行茜素红-s染色。

其中，油红o染色过程：吸除培养基，用dpbs洗一次(1ml/well)。固定：吸除dpbs，加入10％福尔马林(4％甲醛；1ml/well)；室温固定30-60分钟；吸除福尔马林，用60％的异丙醇洗涤2-3分钟(1ml/well)；吸除异丙醇，加入oilred-o染色工作液(1ml/well)；室温静置10-30分钟；用蒸馏水洗涤，去除多余的染料。

茜素红-s染色过程：吸除培养基，用dpbs洗一次(1ml/well)；固定：吸除dpbs，每孔加入1ml70％etoh，室温固定30-60分钟；吸除etoh，用蒸馏水洗涤3次(1ml/well)；吸除蒸馏水，每孔加入1ml2％ars染色工作液；室温静置30-60分钟；吸除染色液，用1ml蒸馏水洗涤4次(1ml/well)；每孔加入1ml蒸馏水避免细胞干燥。

染色结果显示，lenti-aqs慢病毒感染后的msc细胞(msc-aqs)仍然具有成脂和成骨分化能力。

(3)adiponectin和qsphk1表达情况检测：

取对比例3所述的经空载体修饰的间充质干细胞(记为msc)、对比例1及对比例2中所述的单基因修饰的间充质干细胞、本发明经双基因修饰的间充质干细胞(msc-aqs)的细胞裂解液，提取rna，反转录后进行rt-qpcr检测，以未经任何基因修饰的间充质干细胞为普通对照(标记为对照组)，根据takara的荧光实时定量试剂盒(premixextaq^tm)说明书进行，检测结果如图2所示。

取msc和msc-aqs的细胞培养上清，根据elisa试剂盒说明书进行分泌蛋白浓度测定，检测结果如图3所示。

由图2和3可知，adiponectin和qsphk1双基因修饰的msc细胞(msc-aqs)上清中有高量的adiponectin和qsphk1存在。

实验例2对固醇代谢基因表达水平的影响

(1)mrna表达水平：

在100mm培养皿中，分别培养实施例1、对比例1～3的细胞(msc-qs、msc-a、msc-qs及msc)，当细胞汇合度达70％-80％时，吸弃原有msc无血清培养基，加入10mlα-mem培养基，于37℃、5％co2饱和湿度继续培养48h。收集四种细胞的培养上清，4℃保存备用，长期保存需放置于-80℃冰箱。以未经任何基因修饰的间充质干细胞为普通对照(标记为对照组)。

从液氮中取出1支冻存的hepg2细胞(人肝癌细胞，购自atcc)，迅速放入37℃水浴中直到冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用hepg2培养基(10％fbs+dmem)重悬细胞接种至100mm培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度培养。两到三天传一次，传代比例1:6。细胞长满后，弃去旧培养基，加入2ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去pbs溶液，加入2ml0.25％trypsin-edta消化液，消化2-3min直到细胞完全消化下来。加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬，在6孔板的每孔中接种1×10⁶-2×10⁶个细胞，加入2ml培养基，37℃、5％co2饱和湿度培养，待细胞密度达70％-80％时即可用于功能验证。

吸弃原有6孔板中hepg2培养基，加入2ml预先收集的msc、msc-a、msc-qs和msc-aqs的培养上清，37℃、5％co2饱和湿度培养24小时。消化细胞，终止离心后，收集细胞用trizol法提取rna，测量rna浓度后，利用反转录试剂盒(all-in-onecdnasynthesissupermix)将500ng总rna反转为cdna。

进行rt-qpcr检测，根据takara的荧光实时定量试剂盒(premixextaq^tm)说明书进行。其中，rt-qpcr的检测引物包括srebp1c-f、srebp1c-r、β-actin-f和β-actin-r，其核苷酸序列分别如seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示。检测结果如图4所示。

由图4可知，adiponectin和qsphk1双基因修饰的msc细胞(msc-aqs)的培养上清能够显著抑制srebp1c的mrna表达水平，其抑制活性显著高于msc-a及msc-qs的培养上清。由此可见，adiponectin和qsphk1双基因修饰的msc细胞在调节脂代谢方面展现出显著的协同作用。

(2)蛋白水平

对实施例1、对比例1～3的细胞(msc-qs、msc-a、msc-qs及msc)，以未经任何基因修饰的间充质干细胞为普通对照(标记为对照组)，采用westernblot方法，对固醇代谢基因srebp1和srebp2的蛋白水平的表达进行检测(图5中为srebp1和srebp2的蛋白表达量)，结果如图5所示。

由图5可知，msc-aqs组可显著降低胆固醇合成基因srebp1和srebp2的表达，进而抑制胆固醇的合成。

实验例3对脂代谢调控基因p-ampk和ampk表达水平的影响

对实施例1、对比例1～3的细胞(msc-qs、msc-a、msc-qs及msc)，以未经任何基因修饰的间充质干细胞为普通对照(标记为对照组)，采用westernblot方法，对脂代谢调控基因p-ampk和ampk的蛋白水平的表达进行检测，结果如图6所示。

由图6可知，msc-aqs组可显著增加脂代谢调控基因ampk的磷酸化水平，进而增强对脂质的降解。

实验例4体内生物学活性评价

(1)实验分组

选取25只17-18周高脂高糖饮食诱导的雄性c57bl/6j小鼠(小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)。实验分为：对照组(生理盐水)、msc组(细胞)、msc-a组(细胞)、msc-aqs组(细胞)和msc-q组(细胞)，共5个组，每组5只小鼠，以未经任何处理的小鼠为野生组。

(2)治疗方案

给药时间：细胞组要求每7天注射一次细胞，一共给予3次细胞。

各组给药剂量：

对照组(生理盐水组)：每只小鼠每次注射100μl生理盐水，腹腔注射。

细胞组：每只小鼠每次注射量为1×10⁶细胞/100ul，每7天一次，腹腔注射。

(3)检测指标

空腹血糖和随机体重的测量：小鼠饥饿处理6小时后测量空腹血糖，恢复正常饮食后每周定时测随机体重。根据小鼠平均血糖和体重绘制体重变化曲线。

血清生化指标检测：治疗28天后，小鼠眼球取血，3000rpm离心10min分离血清，样品送至北京中同蓝博医学检验实验室有限公司进行甘油三脂(tg)、总胆固醇(tg)、高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl)检测。

动物组织苏木素-伊红(he)染色：治疗28天后，小鼠断颈处死后，做腹部正中切口，充分暴露腹部，取出小鼠肝脏、和腹部皮下脂肪，以10倍体积的4％多聚甲醛固定24小时，并进行石蜡包埋、苏木素-伊红(he)染色。

(4)检测结果

对模型小鼠进行3次细胞治疗，并从第一次治疗开始每周测量一次小鼠空腹血糖和体重，停止治疗后继续观测两周数据。小鼠平均体重和血糖变化曲线分别如图7及图8所示。

结果显示，治疗三次后，msc-aqs细胞治疗组小鼠与对照组小鼠相比随机体重明显减轻(*p<0.05)，且明显优于msc-a和msc-qs组；同时，msc-aqs细胞治疗组小鼠与对照组小鼠相比空腹血糖差异极显著(*p<0.01)，且在第三次细胞治疗就呈现明显的治疗效果，且明显优于msc-a和msc-qs组。

治疗3次后，msc-aqs细胞治疗组小鼠的体型也明显小于对照小鼠体型(图9)，且腹部皮下脂肪含量明显减少，肝组织病理切片he染色显示(图10上部)，con小鼠肝脏呈现严重的脂肪变性，肝组织为脂肪细胞填充，肝细胞大片坏死，而经msc-aqs细胞治疗后肝脏脂肪变性明显改善，纤维化程度下降。腹部皮下脂肪he染色显示(图10下部)，con组小鼠脂肪细胞过度膨大，且细胞核较不规则；经msc-aqs治疗后，脂肪细胞体积显著减小。

治疗3次后，经小鼠血清生化检测发现，经msc-aqs治疗后小鼠血清中tc(总胆固醇)，ldl(低密度脂蛋白)和hdl(高密度脂蛋白)等物质均显著下降，且要优于msc-a和msc-qs组(图11)。

由此可见，msc-aqs可明显降低小鼠体重和血糖，同时能够降低血脂含量，缓解脂肪肝发生，改善血脂代谢异常，且其疗效要优于msc-a和msc-qs组，具备显著的协同作用。因此，本发明的经双基因修饰的间充质干细胞特别适用于治疗代谢病症。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

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<110>北京双因生物科技有限公司

<120>一种双基因修饰的干细胞及其用途

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