本发明涉及一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，属于代谢工程技术领域。
背景技术：
l-薄荷醇(l-menthol)是具有高挥发性单环单萜物质，白色针状结晶，易溶于石油醚、氯仿等有机溶剂，微溶于水。l-薄荷醇是世界范围内销量最大的香料之一，全球年需求量超过2万吨。l-薄荷醇因为具有清凉、杀菌、止痒、镇痛等作用，被广泛的应用于食品、日化、医药、烟草等领域；且还可以作为前体物质合成其他香味物质。目前l-薄荷醇的工业化生产方式较为单一，主要为天然提取与化学合成，天然提取方法需要大量的薄荷属植物原料，化学合成l-薄荷醇同样需要植物来源的百里酚等化合物为底物进行反应拆分。但植物原料生长周期长，市场反馈慢，且容易受到气候、地域等自然环境因素的影响出现产量不稳定。另有以长叶薄荷酮等为底物进行全细胞或酶催化制备l-薄荷醇的方法，仍无法解决植物原料的限制因素。
申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌wmt4，首次实现了发酵法生产l-薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，l-薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/l，但是仍然存在l-薄荷醇发酵产量低的缺点。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，采用诱导型启动子表达基因erg20ww与npps，重构mva代谢合成途径，使得化合物ipp与dmapp更趋向于合成化合物gpp与npp，进而更利于l-薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因l3h，提高l3h酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，通过蛋白酶融合表达tlis与l3h基因，克服因l3h酶活过低而导致l-薄荷醇发酵产量低的因素。
本发明的第一个目的是提供一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌，所述的重组酵母菌是以产l-薄荷醇的基因工程菌为出发菌株，表达了法尼基焦磷酸合酶突变体基因erg20ww和/或橙花二磷酸合酶基因npps，所述的产l-薄荷醇的基因工程菌是以酵母菌为宿主，过表达内源mva合成途径中的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因idi和截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因thmg1，并异源表达截短的柠檬烯合成酶基因lis、柠檬烯羟基化酶基因l3h、细胞色素p450还原酶基因cpr、反式异胡椒醇脱氢酶基因ipdh、异薄荷二烯酮还原酶基因ipr、类固醇异构酶基因ksi、长叶薄荷酮还原酶基因pgr和薄荷醇还原酶基因mmr。
进一步地，所述的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的ncbi编号是np_015208.1，所述的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的ncbi编号是np_013636.1，柠檬烯合成酶的ncbi编号是aac37366.1，柠檬烯羟基化酶的ncbi编号是aad44151.1，细胞色素p450还原酶的ncbi编号是abb88839.2，反式异胡椒醇脱氢酶的ncbi编号是aau20370.1，异薄荷二烯酮还原酶的ncbi编号是aaq75422.1，类固醇异构酶的ncbi编号是afy18860.1，长叶薄荷酮还原酶的ncbi编号是aaq75423.1，薄荷醇还原酶的ncbi编号是aaq55960.1。
进一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述的橙花二磷酸合酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
进一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突变体基因erg20ww和/或橙花二磷酸合酶基因npps通过诱导型启动子进行表达。
进一步地，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯羟基化酶基因l3h。
进一步地，所述的柠檬烯羟基化酶基因l3h通过诱导型启动子进行表达。
进一步地，所述的重组酵母菌还过表达了柠檬烯合成酶和柠檬烯羟基化酶的融合蛋白基因。
进一步地，所述的融合蛋白基因通过诱导型启动子进行表达。
进一步地，所述的酵母菌为酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、解脂假丝酵母或巴斯德毕赤酵母。
本发明的第二个目的是提供所述的重组酵母菌在发酵生产l-薄荷醇中的应用。
本发明的有益效果：
本发明以酵母菌为出发菌株，采用诱导型启动子表达基因erg20ww或/和npps，重构mva代谢合成途径，使得化合物ipp与dmapp更趋向于合成化合物gpp与npp，进而更利于l-薄荷醇的代谢合成。采用诱导型启动子过表达基因l3h，提高l3h酶的表达量，促进柠檬烯转化为反式异胡椒醇，或通过蛋白酶融合表达tlis与l3h基因，克服因l3h酶活过低而导致l-薄荷醇发酵产量低的因素。采用ypd液体培养基发酵4d，发酵至对数生长期后期添加10％的半乳糖水溶液诱导eeg20ww、npps基因与l-薄荷醇代谢途径基因的表达，保证了细胞的正常生长繁殖，l-薄荷醇的发酵产量最高达到30.14mg/l。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
气相-质谱联用检测l-薄荷醇：使用带有fid检测器和chirasil-dex-cb色谱柱(agilent；25m，0.32mm，0.25μm)的agilenttechnologies7890a仪器进行检测。进样器温度为180℃，载气为氦气，流速为1ml/min，压力为5.8psi。程序从70℃开始，以20℃/min的速率将温度升至150℃，保持3分钟，然后以2℃/min的速度将温度升至190℃，保持3分钟。
实施例1：优化内源性mva途径
(a)以酿酒酵母s288c基因组为模版，采用引物thmg1-f、thmg1-r扩增得到基因thmg1，thmg1是基因hmg1去除前530个氨基酸序列所形成，采用引物gpd-f，gpd-r扩增得到启动子基因gpd(seqidno.3)，采用引物adh1-f1，adh1-r1扩增得到终止子基因adh1-1(seqidno.4)；采用引物idi-f、idi-r扩增得到基因idi，采用引物tef1-f，tef1-r扩增得到启动子基因tef1(seqidno.5)，采用引物cyc1-f1，cyc1-r1扩增得到终止子基因cyc1-1(seqidno.6)，采用引物208a-d-f，208a-d-r扩增得到基因片段208a-d，采用引物208a-u-f，208a-u-r扩增得到基因片段208a-f。
(b)将步骤(a)中获得的六个片段thmg1、gpd、adh1-1和idi、tef1、cyc1-1基因片段分为两组进行重叠延伸pcr，pcr条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段pgpd-thmg1-tadh1与ptef1-idi-tcyc1基因片段。
(c)以pml104质粒为模板，采用引物208a-f，208a-r扩增后得到片段208a，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物208a-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-208a。
(d)制备酿酒酵母cen.pk2–1c感受态，并将构建好的融合片段pgpd-thmg1-tadh1、ptef1-idi-tcyc1与基因片段208a-d、208a-f与质粒pml104-208a共同转入cen.pk2–1c感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物208a-u-f，208a-d-r进行菌落pcr验证。
(e)将步骤(d)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt1。
引物序列：
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实施例2：重建l-薄荷醇代谢合成途径
(a)人工合成基因片段pgal1-tlis-tadh1-pgal10-l3h-tcyc1-pgal7-cpr-ttdh3、pgal1-ipdh-tadh1-pgal10-ipr-tcyc1-pgal7-ksi-ttdh3、pgal1-pgr-tadh1-pgal10-mmr-tcyc1，其中tlis基因是基因lis去除前56个氨基酸序列所形成。以酿酒酵母s288c基因组为模版，分别扩增得到基因片段911b-u、基因片段911b-d、基因片段308a-u、基因片段308a-d、基因片段1622b-u以及基因片段1622b-d。
(b)以质粒pml104为模版，分别扩增得到片段308a，911b和1622b，分别采用与实施例1(c)步骤类似的方法，构建获得质粒pml104-308a、pml104-911b和pml104-1622b。
(c)制备菌株wmt1的感受态，并将合成的基因片段pgal1-tlis-tadh1、pgal10-l3h-tcyc1、pgal7-cpr-ttdh3和基因片段911b-u，911b-d和质粒pml104-911b转入wmt1感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落pcr验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为wmt2。
(d)制备菌株wmt2的感受态，并将合成的基因片段pgal1-ipdh-tadh1、pgal10-ipr-tcyc1、pgal7-ksi-ttdh3和基因片段308a-u，308a-d和质粒pml104-308a转入wmt2感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落pcr验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为wmt3(其中，启动子基因gal1如seqidno.7所示，启动子基因gal10如seqidno.8所示，启动子基因gal7如seqidno.9所示，终止子基因tdh3如seqidno.10所示)。
(e)制备菌株wmt3的感受态，并将合成的基因片段pgal1-pgr-tadh1、pgal10-mmr-tcyc1和基因片段1622b-u，1622b-d和质粒pml104-1622b转入wmt3感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后进行菌落pcr验证，采用实施例1(e)类似的方法筛选得到正确的工程菌，并命名为wmt4。
引物序列：
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实施例3：重构酿酒酵母工程菌wmt5
(a)人工合成基因片段pgal1-erg20ww-tadh1，以酿酒酵母s288c基因组为模版，采用引物416d-u-f、416d-u-r扩增得到基因416d-u，采用引物416d-d-f、416d-d-r扩增得到基因416d-d。
(b)将步骤(a)中获得的三个片段pgal1-erg20ww-tadh1、416d-u、和416d-d基因片段进行重叠延伸pcr，pcr条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-u-pgal1-erg20ww-tadh1-416d-d基因片段。
(c)以pml104质粒为模板，采用引物416d-f，416d-r扩增后得到片段416d，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物416d-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-416d。
(d)制备酿酒酵母工程菌wmt4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-u-pgal1-erg20ww-tadh1-416d-d与质粒pml104-416d共同转入wmt4感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-u-f，416d-d-r进行菌落pcr验证。
(e)将步骤(d)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt5。
引物序列：
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实施例4：重构酿酒酵母工程菌wmt6
(a)人工合成基因片段pgal1-npps-tadh1，以酿酒酵母s288c基因组为模版，采用引物416d-u-f、416d-u-r扩增得到基因416d-u，采用引物416d-d-f、416d-d-r扩增得到基因416d-d。
(b)将步骤(a)中获得的三个片段pgal1-npps-tadh1、416d-u、和416d-d基因片段进行重叠延伸pcr，pcr条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-u-pgal1-npps-tadh1-416d-d基因片段。
(c)以pml104质粒为模板，采用引物416d-f，416d-r扩增后得到片段416d，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物416d-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-416d。
(d)制备酿酒酵母工程菌wmt4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-u-pgal1-npps-tadh1-416d-d与质粒pml104-416d共同转入wmt4感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-u-f，416d-d-r进行菌落pcr验证。
(e)将步骤(d)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt6。
引物序列：
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实施例5：重构酿酒酵母工程菌wmt7
(a)人工合成基因片段pgal1-npps-tadh1-pgal10-erg20ww-tcyc1，以酿酒酵母s288c基因组为模版，采用引物416d-u-f、416d-u-r扩增得到基因416d-u，采用引物416d-d-f、416d-d-r扩增得到基因416d-d。
(b)将步骤(a)中获得的三个片段pgal1-npps-tcyc1-pgal10-erg20ww-tadh1、416d-u、和416d-d基因片段进行重叠延伸pcr，pcr条件：98℃，5min预变性，然后98℃，变性10s，55℃，退火5s，72℃，延伸2min，总共30个循环，切胶回收大小正确的片段，得到融合基因片段416d-u-pgal1-npps-tcyc1-pgal10-erg20ww-tadh1-416d-d基因片段。
(c)以pml104质粒为模板，采用引物416d-f，416d-r扩增后得到片段416d，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物416d-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-416d。
(d)制备酿酒酵母工程菌wmt4感受态，并将构建好的融合基因片段416d-u-pgal1-npps-tcyc1-pgal10-erg20ww-tadh1-416d-d与质粒pml104-416d共同转入wmt4感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物416d-u-f，416d-d-r进行菌落pcr验证。
(e)将步骤(d)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt7。
引物序列：
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416d-d-ftacacttattttttttataacttatttaataataaaaatcataaatcataagaaattcgcctattttaacatgtggaattcttgaaagaa
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l4440agcgagtcagtgagcgag。
实施例6：重构酿酒酵母工程菌wmt8
(a)以酿酒酵母工程菌wmt2基因组为模版，采用引物106a-u-f，106a-u-r扩增得到基因片段106a-u，采用引物106a-d-f，106a-d-r扩增得到基因片段106a-d，采用引物l3h-fc，l3h-rc扩增得到基因片段l3hc。
(b)以质粒pml104为模版，采用引物106a-f，106a-r扩增得到片段106a，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物416d-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-106a。
(c)制备酿酒酵母工程菌wmt7的感受态，并将基因片段106a-d、106a-u、l3hc和质粒pml104-106a转入wmt7感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物106a-u-f，106a-d-r进行菌落pcr验证。
(d)将步骤(c)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt8。
引物序列：
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106a-rgatcatacggtcagggtagcgcccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc
l4440agcgagtcagtgagcgag
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l3h-rcggccgcaaattaaagccttcgagcg。
实施例7：重构酿酒酵母工程菌wmt9
(a)以酿酒酵母工程菌wmt2基因组为模版，采用引物106a-u-f，106a-u-r扩增得到基因片段106a-u，采用引物106a-d-f，106a-d-r扩增得到基因片段106a-d，采用引物l3h-fd，l3h-rd扩增得到基因片段l3hd，采用引物lis-fc，lis-rc扩增得到基因片段lisc。
(b)以质粒pml104为模版，采用引物106a-f，106a-r扩增得到片段106a，热击转入大肠杆菌jm109感受态后，采用引物416d-yz-f与l4440菌落pcr验证，并进行测序，测序正确的单菌落接入2mllb培养基内培养16h后利用质粒提取试剂盒提取得到质粒pml104-106a。
(c)制备酿酒酵母工程菌wmt7的感受态，并将基因片段106a-d、106a-u、l3hd、lisc和质粒pml104-106a转入wmt7感受态中，待sdura筛选固体平板上长出单菌落后采用引物106a-u-f，106a-d-r进行菌落pcr验证。
(d)将步骤(c)中菌落pcr验证正确的单菌落接入ypd液体培养基内培养16h，之后划线于含有5-foa的ypd固体平板上，30℃培养3d，之后将长出的单菌落分别转板于ypd固体平板与sdura筛选固体平板上对比验证，ypd平板上正常生长但sdura筛选平板无法生长的单菌落即为正确的基因工程菌，并命名为wmt9。
引物序列：
106a-d-fgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcggcccggctctattgttttccatctctc
106a-d-rcggttctgatgaaagaagcgaagacc
106a-u-fctacatagtatatgcggcgctacc
106a-u-rcacaacatataagtaagattagatatggatatgtatatggtggtaatgccatgtataaggggggaaaaataattcacctcttt
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106a-fgggcgctaccctgaccgtatgatcatttatctttcactgcggagaagttt
106a-rgatcatacggtcagggtagcgcccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc
l4440agcgagtcagtgagcgag
lis-fcttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttgg
lis-rcggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagcagcaaatggttcgaacaatgttctagt
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l3h-rdcttcgagcgtcccaaaaccttctcaagca。
实施例8：重构酿酒酵母工程菌的发酵培养
在2mlypd培养基中接种固体ypd平板上的酿酒酵母工程菌单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量1％接入含有25mlypd液体培养基的250ml圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至16h时，加入10％半乳糖水溶液。发酵结束后，取600μl菌液加入0.5mm玻璃珠与等体积乙酸乙酯破碎，之后高速离心取上层乙酸乙酯层进行气相质谱联用检测。
以酿酒酵母工程菌wmt4为出发菌株，利用诱导型启动子表达法尼基焦磷酸合酶突变体基因erg20ww，构建的酿酒酵母工程菌wmt5，发酵产量达到8.56mg/l。以酿酒酵母工程菌wmt4为出发菌株，利用诱导型启动子表达橙花二磷酸合酶npps，构建的酿酒酵母工程菌wmt6，发酵产量达到11.56mg/l；以酿酒酵母工程菌wmt4为出发菌株，利用诱导型启动子共表达erg20ww与npps基因，构建的酿酒酵母工程菌wmt7，发酵产量达到14.36mg/l。以酿酒酵母工程菌wmt7为出发菌株，利用诱导型启动子过表达l-薄荷醇代谢途径中的关键酶基因柠檬烯羟基化酶基因l3h，提高l3h酶的表达量，解除l-薄荷醇后续合成步骤的代谢通量限制瓶颈，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌wmt8，发酵产量达到18.74mg/l；以酿酒酵母工程菌wmt7为出发菌株，利用诱导启动子过表达融合蛋白tlis-l3h基因，提高l-薄荷醇代谢途径的催化效率，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌wmt9，l-薄荷醇的发酵产量达到30.14mg/l。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种l-薄荷醇产量提高的重组酵母菌
<160>10
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>352
<212>prt
<213>（人工序列）
<400>1
metalaserglulysgluileargarggluargpheleuasnvalphe
151015
prolysleuvalglugluleuasnalaserleuleualatyrglymet
202530
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354045
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505560
ileleuserasnlysthrvalgluglnleuglyglngluglutyrglu
65707580
lysvalalaileleuglytrpcysilegluleuleuglnalatyrtrp
859095
leuvalalaaspaspmetmetasplysserilethrargargglygln
100105110
procystrptyrlysvalprogluvalglygluilealailetrpasp
115120125
alaphemetleuglualaalailetyrlysleuleulysserhisphe
130135140
argasnglulystyrtyrileaspilethrgluleuphehisgluval
145150155160
thrpheglnthrgluleuglyglnleumetaspleuilethralapro
165170175
gluasplysvalaspleuserlyspheserleulyslyshisserphe
180185190
ilevalthrphelysthralatyrtyrserphetyrleuprovalala
195200205
leualamettyrvalalaglyilethraspglulysaspleulysgln
210215220
alaargaspvalleuileproleuglyglutyrpheglnileglnasp
225230235240
asptyrleuaspcyspheglythrprogluglnileglylysilegly
245250255
thraspileglnaspasnlyscyssertrpvalileasnlysalaleu
260265270
gluleualaseralagluglnarglysthrleuaspgluasntyrgly
275280285
lyslysaspservalalaglualalyscyslyslysilepheasnasp
290295300
leulysilegluglnleutyrhisglutyrglugluserilealalys
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aspleulysalalysileserglnvalaspgluserargglyphelys
325330335
alaaspvalleuthralapheleuasnlysvaltyrlysargserlys
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<210>2
<211>260
<212>prt
<213>（人工序列）
<400>2
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202530
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glyhisthrtyr
260
<210>3
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>3
tcattatcaatactcgccatttcaaagaatacgtaaataattaatagtagtgattttcct60
aactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaaa120
tagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcc180
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tcccagcaccaaaatattgttttcttcaccaaccatcagttcataggtccattctcttag300
cgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaacgggcacaacctcaatggagtg360
atgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatgtatctatct420
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aggttgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacgg540
taggtattgattgtaattctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttata600
gttagtcttttttttagttttaaaacaccagaacttagtttcga644
<210>4
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>4
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tacaaattttaaagtgactcttaggttttaaaacgaaaattcttattcttgagtaactct120
ttcctgtaggtcaggttgctttctcaggtatagcatgaggtcgctc166
<210>5
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>5
atagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgca60
tcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaatttcccctctttcttcctc120
tagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtt180
tctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaaat240
tttttttttgatttttttctctttcgatgacctcccattgatatttaagttaataaacgg300
tcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttc360
ttgctcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaagttt401
<210>6
<211>252
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>6
tcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccg60
aaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgt120
tagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgt180
acgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctt240
taatttgcggcc252
<210>7
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>7
tatagttttttctccttgacgttaaagtatagaggtatattaacaattttttgttgatac60
ttttatgacatttgaataagaagtaatacaaactgaaaatgttgaaagtattagttaaag120
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attaattaccccagaaataaggctaaaaaactaatcgcattatcatcctatggttgttaa240
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accataaaagctagtattgtagaatctttattgttcggagcagtgcggcgcgaggcacat360
ctgcgtttcaggaacgcgaccggtgaagacgaggacgcacggaggagagtcttccgtcgg420
agggctgtcgcccgctcggcggcttctaatccgtacttcaatatagcaatgagcagttaa480
gcgtattactgaaagttccaaagagaaggtttttttaggctaagataatggggctcttta540
catttccacaacatataagtaagattagatatggatatgtatatggtggtaatgccatgt600
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<212>dna
<213>（人工序列）
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ttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttaata60
atcatattacatggcattaccaccatatacatatccatatctaatcttacttatatgttg120
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aaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagct360
tttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaattaac420
gaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctgggg480
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ttttgagggaatattcaactgtttttttttatcatgttgatgctctgcataataatgccc60
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<213>（人工序列）
<400>10
aagggaaagatatgagctatacagcggaatttccatatcactcagattttgttatctaat60
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ttatcttggcgcgtacatttaattttcaacgtattctataagaaattgcgggagtttttt180
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