一种表达免疫抑制检查点受体分子的T细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞及其应用。

背景技术：

嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell，car-t)免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方法，通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(car)的基因序列转导入t细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞，是近年来治疗恶性血液肿瘤的有力手段。

然而，靶向实体瘤的car-t免疫治疗面临巨大的考验，car-t细胞存在无法突破实体瘤组织壁垒、不能抵抗肿瘤组织内的免疫抑制、在缺氧微环境中竞争生存能力弱等问题。

科研人员通过构建pd-1抗体(pembrolizumab、nivolumab)或ctla-4抗体(ipilimumab)，或使用pd-1或ctla-4的抑制剂或信号通路阻断剂，进行肿瘤免疫治疗。但是，抗体需要渗入肿瘤组织中才能发挥疗效，pd-1抗体和ctla-4抗体的临床应用存在不确定性。

现有技术还报道了共表达双抗体pd-1和cd19/mesothelin/psca的car-t，虽然可以靶向表达pd-1或cd19/mesothelin/psca或同时表达两者的肿瘤细胞，但是可能引起细胞因子风暴，误伤正常细胞。

因此，有必要对现有技术进行改进，构建更加合理的嵌合受体分子，解除肿瘤免疫抑制微环境，增强肿瘤微环境中的免疫作用，缓解过度的非特异性免疫效应和细胞因子风暴等副作用。

技术实现要素：

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞及其应用，改造后的t细胞有利于避免细胞因子风暴等副反应的发生，安全性高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞，所述免疫抑制检查点受体分子嵌合表达于t细胞膜上，包括免疫抑制检查点和免疫激活信号结构域；

所述免疫抑制检查点为所述免疫抑制检查点受体分子的信号肽、胞外结构域和跨膜结构域；

所述免疫激活信号结构域包括cd28胞内段、cd3ζ和tlr2的组合；

所述cd28位于所述cd3ζ的n端，所述tlr2位于所述cd3ζ的c端。

本发明中，向t细胞导入将免疫抑制信号转变为免疫激活信号的功能性嵌合受体的编码基因，使得改造后的t细胞对表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞具有显著增强的杀伤作用，而由于t细胞天然表达免疫抑制检查点，免疫抑制检查点和配体结合后传递的抑制信号有利于避免t细胞过度激活，减缓了细胞因子风暴等副反应的发生几率。

进一步地，本发明采用toll样受体2(tlr2)作为信号传递结构域，并设置在cd3ζ的c端，不仅加强了改造的t细胞特异性识别肿瘤抗原的能力，更显著扩大了由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，提高了t细胞的抗肿瘤能力。

本发明中，免疫抑制检查点受体分子、其特定的免疫激活信号结构域、以及t细胞天然表达的免疫抑制检查点相互促进并相互制约，使得表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞得到了显著增强的抗肿瘤能力，且安全性高，有效避免了脱靶效应、细胞因子风暴。

优选地，所述免疫抑制检查点包括pd-1、ctla-4、lag3、tim3、a2ar、b7h3或b7h4中的任意一种，优选为ctla-4。

优选地，所述ctla-4免疫抑制检查点包括seqidno:1所示的氨基酸序列；

seqidno:1：

maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipin。

优选地，所述免疫抑制检查点受体分子由ctla-4免疫抑制检查点、cd28胞内段、cd3ζ和tlr2串联组成。

优选地，所述免疫抑制检查点受体分子包括seqidno:2所示的氨基酸序列；

seqidno:2：

maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckamhvaqpavvlassrgiasfvceyaspgkatevrvtvlrqadsqvtevcaatymmgneltflddsictgtssgnqvnltiqglramdtglyickvelmypppyylgigngtqiyvidpepcpdsdfllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipinrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprqakrkprkapsrnicydafvsyserdaywvenlmvqelenfnppfklclhkrdfipgkwiidniidsiekshktvfvlsenfvksewckyeldfshfrlfdenndaailillepiekkaipqrfcklrkimntktylewpmdeaqregfwvnlraaiks。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括ctla-4免疫抑制检查点编码基因、cd28胞内段编码基因、cd3ζ编码基因和tlr2编码基因。

优选地，所述ctla-4免疫抑制检查点编码基因包括seqidno:3所示的核酸序列；

seqidno:3：

atggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaat。

优选地，所述cd28胞内段编码基因包括seqidno:4所示的核酸序列；

seqidno:4：

attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc。

优选地，所述cd3ζ编码基因包括seqidno:5所示的核酸序列；

seqidno:5：

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

优选地，所述tlr2编码基因包括seqidno:6所示的核酸序列；

seqidno:6：

caggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种慢病毒，所述慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293t细胞或293f细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的表达载体或第三方面所述的慢病毒导入t细胞的步骤。

第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞，将免疫抑制检查点和配体结合后传递的抑制信号转变为免疫激活信号，能特异性识别杀伤肿瘤免疫抑制微环境中表达免疫抑制检查点配体的细胞，有效消除了肿瘤免疫抑制作用；

(2)本发明的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞天然表达免疫抑制检查点，与肿瘤细胞、肿瘤相关免疫抑制细胞的抗原结合后产生一定的反馈抑制调节信号，激活信号与抑制信号相互调节与制约，避免了t细胞的过度激活，安全性高；

(3)本发明的t细胞表达的免疫抑制检查点受体分子结构合理，将cd28胞内段、cd3ζ和tlr2串联，具有极强的免疫激活效果，协同促进抗肿瘤免疫效应；

(4)本发明的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞肿瘤杀伤能力强、抗免疫抑制效果好、安全性高，在抗肿瘤治疗中具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为免疫抑制检查点受体分子的结构示意图；

图2为表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞对白血病细胞系的体外杀伤作用；

图3为表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞对非霍金森淋巴瘤的体外杀伤作用。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1慢病毒载体的制备

本实施例首先基因合成以下核酸分子：

①由ctla-4、cd28胞内段、cd3ζ和tlr2的核酸序列串联形成的受体分子(示意图如图1所示)；

②由ctla-4、cd28胞内段、tlr2和cd3ζ的核酸序列串联形成的受体分子；

其中，ctla-4免疫抑制检查点编码基因如seqidno:3所示，cd28胞内段编码基因如seqidno:4所示，cd3ζ编码基因如seqidno:5所示，tlr2编码基因如seqidno:6所示。

在上述核酸分子的c端和n端分别添加限制性内切酶pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶pme1和spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经pme1和spe1双酶切的线性化pwpxld-egfp质粒(含粘性末端)中，连接反应在t4dna聚合酶(invitrogent公司)的参与下进行，得到含有ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2或ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ的编码基因的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

为了将受体分子导入t细胞，采用293t细胞制备重组慢病毒，当293t细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为6ml/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pwpxld-表达质粒包括含有ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2的编码基因的慢病毒载体，或含有ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ的编码基因的慢病毒载体，pwpxld-egfp质粒为不含有受体分子编码基因的空载体；

表1

将36μgpei加至另一500μlopti-mem培养基内，混匀，室温静置5min；

将表1所示的质粒混合液与pei混合，吹打混匀，室温静置25～30min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293t细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为7ml/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293t细胞补加培养基，加入量为7ml/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达受体分子的重组慢病毒或或空白对照egfp慢病毒，4℃保存待用。

实施例3t细胞激活和慢病毒转染

采用ficoll密度梯度离心试剂盒(ge公司)从全血中分离外周血单个核细胞(pbmc)，去除红细胞后，再利用macspan-t磁珠分选出t细胞；

分选出来的t细胞采用培养基(aim-v培养基+5％fbs+青霉素100u/ml+链霉素0.1mg/ml)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/ml待用；

采用cd2/cd3/cd28t细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活t细胞，置于37℃、5％co2培养箱培养刺激48h；

t细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬t细胞，分别加入不同的慢病毒(moi＝10)，并加入8μg/mlpolybrene和300iu/mlil-2，置于37℃、5％co2培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/mlil-2的新鲜培养基重悬t细胞，每2～3天进行一次半量换液。

本实施例构建的表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞分别为野生型t(wt)、ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t。

实施例4体外检测表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞对白血病细胞系的杀伤作用

将实施例3制备的wt、ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t分别与1×10⁴个白血病细胞系nalm6-gl(含有荧光素酶基因)按e:t为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％co2培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较wt、ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t对nalm6-gl的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图2所示，ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t对nalm6-gl的体外杀伤效率显著高于wt，其中，ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t杀伤能力又大于ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t，说明当免疫激活信号结构域为cd28-cd3ζ-tlr2时，可以高效将免疫抑制信号转换为免疫激活信号，使得t细胞表现出较强的肿瘤杀伤活性。

实施例5体外检测表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞对非霍金森淋巴瘤的杀伤作用

将实施例3制备的wt、ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t分别与1×10⁴个非霍金森淋巴瘤细胞(含有荧光素酶基因)按e:t为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％co2培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较wt、ctla-4-cd28-cd3ζ-tlr2-t和ctla-4-cd28-tlr2-cd3ζ-t对nalm6-gl的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图3所示，表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞对非霍金森淋巴瘤细胞也具有特异性识别杀伤作用。

综上所述，本发明的免疫抑制检查点受体分子采用将免疫抑制信号转变为免疫激活信号，构建的t细胞相较于野生型t细胞具有显著增强的抗免疫抑制作用，对表达免疫抑制检查点配体的肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，不会引起细胞因子风暴，安全性强，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

sequencelisting

<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120>一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞及其应用

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