基因GhNHX4A在植物耐盐性能方面的应用的制作方法

基因ghnhx4a在植物耐盐性能方面的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及棉花耐盐分子生物学领域，具体而言，涉及基因ghnhx4a在植物耐盐性能方面的应用。


背景技术：

[0002]
各种生物因素(疾病、害虫等)和非生物因素(盐、干旱、寒冷、渗透等)能够严重阻碍植物的生长。盐胁迫是最严重的非生物胁迫之一，可严重限制作物的生产力。当土壤中的na
+
浓度增加时，农作物的生长发育将受到抑制甚至死亡。目前，土壤盐碱化是人类活动造成的全球性环境问题之一，严重制约了农业生产。世界上有8亿公顷的土壤受到不同程度的盐碱化影响。农业灌溉土地中近20％面临着土壤盐碱化的危害，并且这一数字正在逐年增加。因此，研究作物，特别是耐盐先锋作物的耐盐机制，以培育能够在盐胁迫环境下生长的作物成为了迫切的需要。
[0003]
在植物的耐盐反应中，主要通过na
+
的外排和na
+
的区隔化，降低细胞内na
+
的浓度，维持细胞内的离子平衡。na
+
的外排一般是由盐超敏感(salt overly sensitive,sos)途径完成，当植物受到盐胁迫时通过细胞质膜上的sos1蛋白将过多的na
+
从细胞质运输到细胞外，维持细胞质中na
+
的动态平衡。na
+
的区隔化主要是内膜系统上的na
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/h
+
逆向转运蛋白(na
+
/h
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antiporter,nhx)将na
+
区隔化到特定组织细胞的液泡或囊泡内，减轻na
+
对细胞质中细胞器的毒害作用。nhx蛋白在模式植物拟南芥中研究比较深入，根据其在细胞中的位置，可分为两类。i类亚家族成员包括atnhx1-4，位于液泡膜上，对na
+
和k
+
具有相同的亲和性，可以将细胞质中na
+
和k
+
区隔到液泡中，从而减少盐离子对细胞的伤害并保持细胞的渗透压平衡。ii类亚家族成员包括atnhx5-6，主要位于高尔基体和前液泡区等核内体中，在盐胁迫下主要调节k
+
和ph稳态，通过在细胞中积累较多的k
+
来增强对盐胁迫的耐受性。大量研究表明，盐胁迫可以显著诱导表达i类亚家族nhx基因，并且过表达这些nhx基因可以显著提高植物对na
+
的耐受性。近年来，关于ii类亚家族nhx基因的研究也逐渐增加。番茄lenhx2是植物中第一个研究比较清楚的ii类亚家族成员，在拟南芥和番茄中过表达lenhx2基因发现，在盐胁迫下转基因材料增加了k
+
含量，增强了耐盐性。此外，异源表达拟南芥ii类亚家族atnhx5基因的转基因水稻，高盐处理后积累了更多na
+
和k
+
，表现出较强的耐盐性。
[0004]
棉花作为天然纤维、植物蛋白和食用油的重要来源，具有非常重要的经济和社会价值。尽管棉花被认为是耐旱和耐盐的先锋作物，但其敏感性在品种和基因型之间差异很大，而盐胁迫仍然对棉花的产量和纤维品质有重大影响。液泡型ghnhx1在酵母na
+
/h
+
逆向转运基因突变体中的表达能够恢复其耐盐性。过表达ghnhx1的转基因烟草植物也比野生型植物具有更高的耐盐性。研究人员创制了表达atnhx1的转基因棉花，这些表达atnhx1的棉花植株在200mm nacl存在下生长时，产生更多的生物量并产生更多的纤维，表明atnhx1确实可以用于提高棉花的耐盐性。但是，尚未证明棉花核内体型nhx成员在耐盐反应中的功能。
[0005]
可以看出，nhx基因在植物耐盐反应中起着至关重要的作用。但是，在棉花中，有关于nhx基因家族成员的鉴定和功能研究比较少，特别是核内体型nhx成员的研究尚未报道。
[0006]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0007]
本发明使用生物信息学方法来鉴定陆地棉的nhx基因家族成员，并进行进化关系分析。利用实时定量rt-pcr分析陆地棉nhx基因的表达模式。然后通过酵母功能互补，初步筛选出耐盐相关的nhx基因，通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,vigs)验证与耐盐性有关的核内体型nhx基因，对进一步的研究nhx基因以及nhx基因在高抗稳产棉花育种中的应用具有重要意义。
[0008]
本发明的第一方面提供了以下技术方案：
[0009]
基因ghnhx4a在植物耐盐性能方面的应用，所述基因ghnhx4a具有seq id no:1所示的核苷酸序列。
[0010]
本发明通过筛选和鉴定陆地棉nhx基因家族，总共获得了22个基因，这些基因广泛分布在基因组中。使用生物信息学方法对其进行分析，可以发现该家族在进化过程中是保守的，家族成员主要是由多倍体化过程的全基因组复制产生的。表达模式分析发现，盐胁迫在一定程度上诱导了陆地棉大部分nhx基因的表达。经试验验证，ghnhx4a可以明显恢复酵母突变体的耐盐性。亚细胞定位的结果表明，ghnhx4a蛋白定位在核内体上。同时，ghnhx4a基因的沉默表达严重破坏了棉花对盐胁迫的基本抗性，表明ghnhx4a基因可能在棉花的耐盐信号通路(na
+
和/或k
+
的转运)中发挥积极的调控作用。这项研究加深了对植物nhx基因功能的理解，特别是对于核内体型亚家族nhx基因功能的理解，并为进一步研究棉花对盐胁迫的分子机制以及提供提高棉花耐盐性的候选靶基因奠定了重要基础。
[0011]
进一步地，所述耐盐性能包括提高耐盐性能或降低耐盐性能。
[0012]
由于本发明中涉及的基因ghnhx4a对棉花的耐盐性能具有显著的作用，也就是说，基因ghnhx4a与耐盐性能密切相关，因此，在实际应用中，可以通过过表达基因ghnhx4a或者转入基因ghnhx4a来达到增强植物的耐盐性能；也可以抑制或敲除或沉默基因ghnhx4a来降低植物的耐盐性能。
[0013]
进一步地，所述应用包括检测植物耐盐性能或在耐盐植物育种中的应用。
[0014]
本发明中，基因ghnhx4a在植物耐盐性能方面的应用可以是基因ghnhx4a作为植物耐盐性能的分子标记，即通过检测植物是否具有基因ghnhx4a来相对的说明植物的耐盐性能；也可以是根据基因ghnhx4a是否存在来育种，如可以通过转入基因ghnhx4a或增加基因ghnhx4a的表达来增加植物的耐盐性能，也可以是通过抑制或敲除或沉默基因ghnhx4a来得到新的植物品种。
[0015]
进一步地，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
[0016]
优选地，所述植物包括拟南芥、小麦、燕麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿、棉花、花生、大豆、高粱、谷子。
[0017]
其中，棉花也可以是陆地棉的不同品种，其中，可以包括陆地棉遗传标准系tm-1、黄河流域棉区陆地棉品种、长江流域棉区陆地棉品种、黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种、西北内陆棉区陆地棉品种。
[0018]
具体地，黄河流域棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种包括但不限于蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号；黄河流域和长
江流域棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所49和新陆中69号等。
[0019]
本发明的第二方面提供了一种植物耐盐性能的检测方法，检测待检测样品的基因ghnhx4a，若所述待检测样品含有基因ghnhx4a目的片段，则判断具有高耐盐性能。
[0020]
由于拥有基因ghnhx4a的植物如棉花具有高耐盐性能，因此，基因ghnhx4a可以作为高耐盐性能的一种表征。当然，待检测样品可以是自然存在的植物，通过筛选含有基因ghnhx4a的植物以得到高耐盐的植物；也可以是基因ghnhx4a用于转基因育种中的样品，通过筛选目的基因ghnhx4a是否存在来筛选出含有基因ghnhx4a的植物，进而得到高耐盐的植物。
[0021]
其中，本发明检测待检测样品是否含有基因ghnhx4a可以通过多种方式进行，如可以直接检测是否含有基因ghnhx4a本身，也可以检测由基因ghnhx4a产生的产物，产物包括直接产物或间接产物或次生产物等，产物可以是基因，也可以是蛋白，也可以是某种化合物等。
[0022]
如直接检测基因ghnhx4a本身，可以用针对基因ghnhx4a的特异性引物对检测，也可以是针对基因ghnhx4a设计的探针或芯片进行检测。进一步地，通过耐盐基因ghnhx4a的引物对或探针或芯片对待检测样品进行检测。
[0023]
本发明提供的针对基因ghnhx4a的引物对或探针或芯片，按常规方法设计即可得到。通过对该基因的检测能有效确认是否含有基因ghnhx4a，以在一定程度上说明待测植物的耐盐性能。
[0024]
进一步地，所述引物对的核酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示或如seq id no.4和seq id no.5所示。
[0025]
引物对seq id no.2和seq id no.3以cdna为模板的检测引物，特异性强。
[0026]
引物对seq id no.4和seq id no.5既可以以dna为模板，也可以以cdna为模板，对两种模板均有很好的特异性。
[0027]
但检测基因ghnhx4a本身的方式并不限于此，任何在分子生物学上可实现的方式均在本发明的保护范围内。
[0028]
同样地，检测由基因ghnhx4a产生的产物也可以通过多种手段进行，如多种的elisa检测试剂盒等。
[0029]
进一步地，在不同的实施方式中，所述待检测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。
[0030]
这些待检测样品可以是适宜于有性繁殖的材料，如选自花粉、子房、胚珠、胚囊等；
[0031]
适宜于无性繁殖的材料如可以选自插枝、根、茎、原生质体等；
[0032]
适宜于可再生的细胞的组织培养的材料如可以选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根端、花药、花、种子和茎等。
[0033]
具体地，所述待检测样本包括以下材料中的任一种：种子、叶、根、茎、胚根、胚芽。
[0034]
其中，植物耐盐性能的检测方法中，待检测样品的植物可以为双子叶植物或单子叶植物。如包括拟南芥、小麦、燕麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿、棉花、花生、大豆、高粱、谷子等。
[0035]
另外，棉花也可以是陆地棉的不同品种，如陆地棉，其中，可以包括陆地棉遗传标
准系tm-1、黄河流域棉区陆地棉品种、长江流域棉区陆地棉品种、黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种、西北内陆棉区陆地棉品种。
[0036]
具体地，黄河流域棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种包括但不限于蜀棉2号、川棉239、鄂棉18号和泗棉2号；黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种包括但不限于中棉所49和新陆中69号等。
[0037]
本发明的第三方面还提供了一种提高植物耐盐性能的育种方法，将含有基因ghnhx4a的片段重组到目的植物的基因组中。
[0038]
同样地，本发明中的育种并不限于不同种类的棉花，还可以包括其他植物，如拟南芥、小麦、燕麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿、花生、大豆、高粱、谷子等。
[0039]
如利用本发明的基因ghnhx4a进行耐盐性棉花辅助育种，能够早期筛选目标棉花，具有节省时间、成本低廉等优点。
[0040]
本发明的第四方面还提供了基因ghnhx4a在棉花种群遗传多样性研究中的应用。
[0041]
盐胁迫会导致土壤和植物细胞中的离子失衡，从而增加细胞中有害离子的浓度，从而引起离子胁迫。因此，离子平衡在植物的生长发育中起着重要的调节作用，阳离子/质子逆向转运蛋白在维持植物中离子的平衡中起着重要的作用。植物中的na
+
/h
+
逆向转运蛋白(nhx)基因可以分为两个亚类，i类位于液泡膜中，ii类位于核内体中。
[0042]
在这项研究中，从陆地棉中鉴定出22个nhx基因。在不同物种中nhx基因的数目不同。与其他报道的物种相比，陆地棉的nhx基因数量相对较多，表明陆地棉的nhx基因家族在进化过程中经历了基因扩增。系统发育关系表明，陆地棉nhx基因分为两个亚家族，与先前的研究结果一致。同时，从系统发育树上可以推断出，陆地棉和属于双子叶植物的拟南芥和杨树以及属于单子叶植物的水稻和玉米均具有这两个不同的nhx基因分支，表明这两个亚家族在单子叶植物和双子叶植物形成之前就已经存在。
[0043]
基因复制是植物中的常见现象。通过特定的机制，基因复制可以产生不同的复制结果，包括串联复制、片段复制、全基因组复制等。重复基因在进化过程中以及随后的分化过程中得以保留，从而为适应性进化提供原始遗传资源，同时在新基因的产生中起着重要作用。在棉花基因组中，nhx基因复制的现象很明显。分别在亚洲棉a2基因组和雷蒙德氏棉d5基因组中鉴定出11个nhx家族基因。同时，进一步的系统发育结果表明，陆地棉a亚基因组的11个成员可以对应d亚基因组的11个成员。因此，陆地棉nhx家族基因可能主要是由多倍体化过程中全基因组复制产生的，这有助于丰富nhx成员功能的多样性。
[0044]
此外，ghnhx1a/1d和ghnhx4a/4d与其他家族成员的基因结构显著不同，这与系统发育分析中的发现一致，表明陆地棉nhx家族的成员形成两个亚家族，而且液泡型成员的外显子数量在11～14之间，核内体型外显子的数量在18～21的范围内。值得注意的是，ghnhx5a和ghnhx5d是来自不同亚基因组的同源基因，ghnhx5d具有典型的基因结构，而ghnhx5a具有较少的外显子数目。这表明在棉花nhx中发生了独立的进化事件。变化的基因结构有可能是随机进化，并在陆地棉种形成后出现，这可能导致剪接位点发生突变，从而产生新的转录本。推测，这些突变基因的转录物可以转变或破坏基因产物的功能，从而丰富了nhx基因家族的作用。
[0045]
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：
[0046]
(1)本发明经过序列分析，并进行功能验证，得到基因ghnhx4a在盐耐受方面具有显著的作用。
[0047]
(2)本发明初步证明了基因ghnhx4a通过控制na
+
和/或k
+
的转运功能来控制植物的耐盐性能，也即基因ghnhx4a可以应用于na
+
和/或k
+
的转运功能的调控中。
[0048]
(3)本发明以基因ghnhx4a的耐盐性作为基础，通过检测基因ghnhx4a选择耐盐性能优良的材料，提高选择效率和准确性。
[0049]
(4)通过鉴定基因ghnhx4a来选择高耐盐性的植物，如棉花，可缩短植物的培育年限。
附图说明
[0050]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0051]
图1为陆地棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、拟南芥、杨树、水稻和玉米中nhx家族成员的系统发育分析图；
[0052]
图2为陆地棉nhx基因的染色体分布和同源关系示意图；
[0053]
图3为陆地棉nhx基因的系统发育关系、基因结构和蛋白基序分析图；
[0054]
图4为在200mm nacl处理下，陆地棉nhx基因在叶片中的表达模式图；
[0055]
图5为表达ghnhx4a增强酵母突变体对nacl的耐受性；
[0056]
图6为ghnhx4a的亚细胞定位结果图；
[0057]
图7为沉默表达ghnhx4a降低棉花对nacl的耐受性；
[0058]
图8为在对照(未处理)和盐处理下，trv:00和trv:ghnhx4a棉花的na
+
、k
+
含量的测定和na
+
/k
+
比的计算相关柱形图。
具体实施方式
[0059]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0060]
实施例1
[0061]
一、试验方法与材料
[0062]
1、棉花nhx家族基因的鉴定
[0063]
为了鉴定陆地棉、雷蒙德氏棉和亚洲棉中的nhx基因，首先，本研究收集了它们的基因组数据。然后，建立用于筛选基因的核酸和蛋白质序列的本地数据库。从网站下载已报道的拟南芥、杨树、水稻和玉米的nhx蛋白序列作为查询序列，并使用构建的本地基因组数据库通过blastp和tblastn检索候选序列(默认参数)。使用pfam数据库分析候选序列，鉴定出nhx基因家族的成员。
[0064]
2、棉花nhx基因的进化分析
[0065]
使用clustal w软件，使用默认的多重比对参数，对nhx蛋白序列进行多重序列比对。使用mega x软件中的邻接(nj)法(1000个自举重复)，用比对序列构建系统发育树。使用
在线工具gsds 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制陆地棉nhx基因的外显子-内含子结构。在线工具meme(版本5.1.1)(http://meme-suite.org/)用于识别陆地棉nhx蛋白的保守基序。
[0066]
二、试验结果
[0067]
1、棉花nhx基因的鉴定及系统发育关系
[0068]
在构建了陆地棉、雷蒙德氏棉和亚洲棉的本地数据库之后，以拟南芥、杨树、水稻和玉米中nhx基因的蛋白质序列为查询序列，进行本地blastp和tblastn的检索以获得候选序列。在搜索、验证和删除冗余序列后，所有候选基因都在pfam数据库中进行分析，以验证nhx保守结构域。最终，在棉花基因组中鉴定出总共44个nhx基因家族成员，其中陆地棉基因组中22个、雷蒙德氏棉基因组中11个、亚洲棉基因组中11个。陆地棉的a和d亚基因组各包含11个基因。首先根据其在a亚基因组中的位置命名11个基因，即ghnhx1a-11a，然后根据基因的同源性，命名d亚基因组中的其余11个基因，即ghnhx1d-11d。为了评估陆地棉中nhx基因之间的系统发育关系，利用陆地棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、拟南芥、杨树、水稻和玉米的nhx基因蛋白质序列构建了系统发育树(图1)。
[0069]
图1为陆地棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、拟南芥、杨树、水稻和玉米中nhx家族成员的系统发育分析。系统进化树是通过mega x软件使用邻接(nj)法(1000个自举重复)生成的，使用了来自陆地棉(gh)的22个nhx基因和来自亚洲棉(ga)、雷蒙德氏棉(gr)、拟南芥(at)、杨树(pt)、水稻(os)和玉米(zm)的49个nhx基因。陆地棉nhx用带背景字体指示，拟南芥用五角星指示。所有的nhx基因被分为两类(ⅰ类：vac；ⅱ类：endo)。不同类别由不同深度颜色的弧线显示。
[0070]
通过系统进化树显示，所有nhx蛋白均被分为两个不同的亚家族，结合先前的研究结果，i类和ii类分别属于液泡型(vac)和核内体型(endo)，并且i类成员数大于ii类，其中i类包含18个陆地棉成员，ii类包含4个成员。
[0071]
此外，基于系统发育分析，我们在陆地棉nhx家族中鉴定了11对同源基因(图1)。染色体分布表明，陆地棉的22个nhx家族成员位于26条总染色体中的16条。同时，a01、a09、a11、d01、d09和d11染色体各包含两个成员，a02、a06、a08、a12、a13、d02、d06、d08、d12和d13染色体上各包含一个成员。此外，陆地棉的a亚基因组和d亚基因组之间存在一对一的同源关系(图2)。
[0072]
图2中，陆地棉染色体以实心圆形形式呈现(包括a和d亚基因组)。陆地棉nhx基因的大概位置在圆圈上用短灰色线表示。中间连线表示陆地棉a和d亚基因组之间同源的nhx基因。中间弧型代表每个染色体上的基因密度。
[0073]
2、陆地棉nhx的基因结构和保守基序分析
[0074]
为了更好地理解陆地棉nhx基因家族不同成员之间的进化关系，我们构建了一个单独的系统发育树(图3a)并进行了比较结构分析(图3b)。具体地，图3示出了陆地棉nhx基因的系统发育关系、基因结构和蛋白质基序分析。图3a示出陆地棉nhx基因之间的系统发育关系，系统进化树是通过mega x软件使用邻接(nj)法构建的(1000个自举重复)。两类亚家族nhx基因分别用不同颜色深度的字体表示，浅色字体指示i类(液泡型)，深色字体指示ii类(核内体型)。图3b示出陆地棉nhx基因的基因结构分析。基因结构图是使用gsds 2.0绘制的，外显子和内含子分别用方块和灰色线标记，比例尺显示在底部。图3c为陆地棉nhx基因
的蛋白质基序分析。通过meme(版本5.1.1)识别这些基序，每个基序的长度按比例显示。
[0075]
我们发现陆地棉nhx基因根据外显子的数量分为两类。i类和ii类成员通常分别由14和21个外显子组成，表明同一类别中相对高度保守的外显子-内含子结构。我们进一步探索了陆地棉nhx的蛋白质序列特征，应用meme(版本5.1.1)工具预测了nhx蛋白质的7个基序，我们发现同一亚组具有相似的基序分布。大多数成员具有基序1和4，表明这些基序在nhx基因家族中的重要作用。基序6和2仅在i类成员中存在。nhx亚类之间的基序差异也表明，这些蛋白质的功能可能在进化过程中发生了变化。
[0076]
实施例2
[0077]
一、试验方法与材料
[0078]
1、植物材料的种植和处理
[0079]
将健康饱满的陆地棉品种tm-1种子在30℃的培养箱中在无菌水中浸泡过夜。第二天，选择暴露胚根尖端的种子，并朝下接种在蛭石中，并用塑料膜覆盖以保湿。将种子在光孵箱中于23℃和60％湿度下以16小时/8小时的明暗比进行培养。通常，种子将在2～3天后推出表层土壤。这时，应及时除去塑料薄膜，轻轻除去种子壳，将平展子叶的棉花幼苗移植到水培箱中hoagland营养液培养约10天。选取生长一致的幼苗，将200mm nacl加入水培箱的培养液中进行盐处理，分别在处理后0、1、3、6和12小时，取第二片真叶。同时，对未进行盐处理(加去离子水)的幼苗，分别取对应时间点的第二片真叶作为平行对照。所取样品快速在液氮中冷冻，并放在-80℃保存。
[0080]
2、rna提取和实时定量rt-pcr(qrt-pcr)
[0081]
使用trizol试剂(tiangen，北京，中国)从每个样品中分离总rna。通过nanodrop2000核酸分析仪检测rna含量，并通过凝胶电泳检查质量。使用转录子第一链cdna合成试剂盒版本drr047a(takara，大连，中国)，从1μg总rna合成第一链cdna。将ghhis3用作内参基因，并使用2-δct
方法计算基因的相对表达量。
[0082]
表1棉花nhx基因的有关信息
[0083]
[0084][0085]
注：
a
通过compute pi/mw工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测全长蛋白质的理论pi(等电点)和mw(分子量)。
b
重新注释的基因编码区序列。
[0086]
表2实时定量rt-pcr涉及的引物序列
[0087]
[0088][0089]
3、使用酵母突变体进行ghnhx4a的功能鉴定
[0090]
酵母突变株axt3(ena1-4δ::his3,nha1δ::leu2,nhx1δ::trp1)源自野生型酵母w303，缺失了na
+
离子转运系统，失去运输na
+
的能力，因此对na
+
特别敏感。w303(mat：ura3-1,leu2-3,112his3-11,15trp1-1,ade2-1,can1-100)是一种野生型酵母，含有运输na
+
的nhx蛋白。pyes2是酵母中高度表达的载体，并包含半乳糖诱导启动子序列、氨苄青霉素抗性基因序列(ampi)、尿嘧啶基因序列(ura)。首先，扩增ghnhx1a和ghnhx4a序列(所需引物如表3所示)，然后将pyes2、pyes2-ghnhx1a和pyes2-ghnhx4a载体分别转化到axt3中(所需的引物如表3所示)。野生型酵母菌株w303用作阳性对照。将w303、pyes2-ghnhx4a转化的axt3和pyes2转化的axt3在apg培养基(10mm精氨酸、8mm磷酸、2％葡萄糖、2mm mgso4、1mm kcl、0.2mm cacl2、微量矿物质和维生素)中培养。微量矿物质(1l apg培养基)包含：50μg h3bo4、4μg cuso4、10μg ki、20μg fecl3、40μg mnso4、20μg钼酸钠、40μg硫酸锌。维生素(1l apg培养基)包含：0.2μg生物素、40μg烟酸、40μg维生素b6、40μg d-泛酸钙、40μg硫胺素。当培养至饱和状态时，将其分别稀释20倍、200倍和2000倍，然后将每种稀释梯度取8μl溶液，不同盐浓度(盐浓度为0mm nacl、30mm nacl和50mm nacl；ph＝6.5)的apg培养基(添加ade、ura、try、leu和his)上点样。在30℃下孵育3～5天，拍照并分析。
[0091]
表3构建pyes2-ghnhx4a所需的引物
[0092]
引物名称引物序列ghnhx1a-1fatgggaatttcaccggcghnhx1a-1rctatggacaggacgaaccaaatghnhx4a-1fatggataattcaacggcggghnhx4a-1rtcagctatgtccgtggtatactccghnhx1a-y-1fcttggtaccgagctcggatccatgggaatttcaccggcgghnhx1a-y-1rccctctagatgcatgctcgagctatggacaggacgaaccaaattghnhx4a-y-1fcttggtaccgagctcggatccatggataattcaacggcggaghnhx4a-y-1rccctctagatgcatgctcgagtcagctatgtccgtggtatactcc
[0093]
4、ghnhx4a与绿色荧光蛋白(egfp)融合表达载体的构建以及在烟草中的瞬时表达
[0094]
使用tks gflex dna聚合酶(takara，大连，中国)从陆地棉品种tm-1的cdna中扩增ghnhx4a的编码序列，然后选择含有egfp的载体35s:egfp，将基因插入camv 35s启动子和egfp之间，注意去除下游终止密码子以确保35s:ghnhx4a-egfp融合蛋白的表达(引物序列见表4)。通过酶切确认阳性质粒，并通过测序进一步验证。
[0095]
表4涉及的引物序列
[0096]
引物名称引物序列ghnhx4a-1fatggataattcaacggcggghnhx4a-1rtcagctatgtccgtggtatactccghnhx4a-e-1facgggggactcttgaggatccatggataattcaacggcggaghnhx4a-e-1rgcccttgctcaccatgagctcgctatgtccgtggtatactcccc
[0097]
选择健康饱满的烟草种子，在营养钵中均匀播种，并在人工气候室中放置约一周。选择具有均匀生长条件的健康幼苗将其移植到新的小钵中。当烟苗叶片长至约5片时，进行烟草瞬时转化实验。首先，在超净工作台中将重组质粒和空质粒的农杆菌液添加到50ml相应抗性的lb培养液中，并在28℃和220rpm摇动培养物直至菌液变成橙色。将培养的细菌溶液在5000rpm下离心5分钟；制备100ml的重悬溶液，将细菌细胞重悬，并将重悬的细菌溶液的od600值调节至约1.2。将重悬的液体在黑暗中于室温下静置3小时，然后从顶部选择第三和第四片叶片进行注射并标记。在黑暗中孵育24～72小时后，切开注射伤口附近的叶组织，用去离子水洗涤。然后将它们在黑暗中用4mm fm4-64染色20～30分钟，洗涤后在激光共聚焦显微镜(lscm)下观察和拍摄照片。
[0098]
5、病毒诱导的基因沉默实验
[0099]
从棉花中扩增出ghnhx4a的沉默片段，并将其插入vigs载体(trv:00)中构建trv:ghnhx4a载体，具体引物如表5所示。trv:00是阴性对照(空载体)，trv:cla是阳性对照(叶片白化)。然后将它们转化到农杆菌gv3101中。对在水培箱中生长10天的棉苗，用针头轻轻点伤子叶背面，将trv1分别与trv:cla、trv:00和trv:ghnhx4a混合，然后用1.0ml的注射器沿着伤口慢慢注满整个子叶。注射后12天，当trv:cla棉苗出现阳性表型时，在trv:00和trv:ghnhx4a棉苗上取的根、茎和叶片以检测干扰效率。其他trv:00和trv:ghnhx4a棉苗分别分为两部分，一部分用于200mm nacl处理，另一部分不进行盐处理(加去离子水)作为对照。
[0100]
表5构建含有ghnhx4a片段的vigs表达载体的引物
[0101]
引物名称引物序列ghnhx4a-t-1fgtgagtaaggttaccgaattcaacggtgttgttaattggaggttcghnhx4a-t-1rgagacgcgtgagctcggtaccgtggtatactccccttctagaactagg
[0102]
6、测定细胞内k
+
和na
+
的含量
[0103]
盐处理和对照(未处理)的trv:00和trv:ghnhx4a棉苗，出现表型后(处理一周后)，分别取根、茎和第二片真叶(三次独立重复)，在90℃下干燥样品，然后研磨至粉末，称量0.05g样品并将其溶于5ml浓hno3中用于硝化。之后用去离子水稀释12倍，离心，取上清液，并通过原子吸收光谱法(aas)测定样品中的离子含量。
[0104]
二、试验结果
[0105]
1、盐处理下陆地棉nhx基因的表达模式
[0106]
土壤盐渍化是限制作物产量的关键因素之一。先前的研究表明，nhx蛋白在其他植物的耐盐性中起着关键作用，但很少在棉花中进行探究。因此，本研究分析了盐分胁迫处理下所有陆地棉nhx基因的表达模式(图4)。
[0107]
图4示出200mm nacl处理后，陆地棉nhx基因在叶片中的表达模式。图4a所示在nacl处理下陆地棉nhx基因表达谱的聚类分析。使用k-means法对200mm nacl处理下的陆地棉nhx基因表达谱进行聚类分析。图4b示出在200mm nacl处理下的陆地棉nhx基因的表达谱。图4中，x轴表示200mm nacl处理后的不同时间(0、1、3、6和12小时)，而y轴表示相对表达水平。mock为平行对照。误差棒显示三个生物学重复的标准偏差(*：p<0.05，**：p<0.01，t检验)。
[0108]
如图4a所示，基于聚类分析，基本上存在三种类型的表达谱。第一类包括6个基因ghnhx1d、ghnhx4d、ghnhx5a、ghnhx7d、ghnhx9d和ghnhx10d，只有3个基因ghnhx2d、ghnhx5d和ghnhx11d属于第二类，而13个基因属于第三类，分别是ghnhx1a、ghnhx2a、ghnhx3a、ghnhx3d、ghnhx4a、ghnhx6a、ghnhx6d、ghnhx7a、ghnhx8a、ghnhx8d、ghnhx9a、ghnhx10a和ghnhx11a。我们进一步分析了每个ghnhx的盐胁迫表达模式(图4b)。第一类中，ghnhx1d和ghnhx10d的表达量在盐胁迫下1和6小时显著上调，ghnhx4d的表达水平在盐处理1、3和6小时显著上调，然而ghnhx1d和ghnhx4d的表达量在12小时轻微下降，ghnhx10d在12小时显著下调。此外，ghnhx5a、ghnhx7d和ghnhx9d的表达水平在盐处理后下降或无显著变化。第二类中，ghnhx2d、ghnhx5d和ghnhx11d在盐胁迫后迅速响应，但它们的表达水平在12小时均被显著下调。在第三类基因中，这些基因在大多数时间点受到盐处理的诱导表达，只有ghnhx3a和ghnhx8d在盐处理3小时后被显著下调。
[0109]
2、ghnhx4a的在酵母突变体中的功能互补
[0110]
根据nhx基因在盐胁迫下表达模式分析的结果，在4个核内体型nhx基因中ghnhx1a和ghnhx4a在盐胁迫下显著上调并且具有相对高的表达水平，因此用于在酵母突变体中进行功能互补实验。分别用pyes2-ghnhx1a、pyes2-ghnhx4a和pyes2转化的酵母突变菌株axt3与野生型酵母菌株w303(对照)一起进行两个浓度的nacl处理。由于w303缺少主要的内源性na
+
转运蛋白，所以用pyes2转化的酵母axt3菌株的生长受到30mm nacl的抑制。但是，用ghnhx1a转化的酵母axt3和用ghnhx4a转化的酵母axt3仍然能够在含有50mm nacl的培养基上生长，具有对盐胁迫更强的抗性，这可能是由于na
+
转运功能被部分恢复。此外，与ghnhx1a相比，用ghnhx4a转化的酵母菌株axt3在30mm和50mm nacl的培养基上生长的更好。
因此，选择了ghnhx4a进行进一步分析。
[0111]
具体地，图5示出了表达ghnhx4a的转基因酵母细胞对nacl的耐受性增强。图5中，w303：野生型菌株w303；ghnhx1a：用pyes2-ghnhx1a载体转化的突变株axt3；ghnhx4a：用pyes2-ghnhx4a载体转化的突变株axt3；pyes2：用pyes2载体转化的突变株axt3。
[0112]
酵母表达系统是研究蛋白质特性的重要方法之一。由于酵母中na
+
的解毒机理与植物相似，因此可以使用互补功能方法探讨植物na
+
/h
+
逆向转运蛋白在盐胁迫中的作用。在这项研究中，ghnhx4a被转入盐敏感性酵母突变体axt3中，以研究盐胁迫后的恢复水平。结果表明，转ghnhx4a的酵母突变体的耐盐性得以恢复。ghnhx4a可以在50mm nacl培养基中生长，而没有转ghnhx4a的酵母突变体的生长受到明显抑制。
[0113]
3、ghnhx4a的亚细胞定位实验
[0114]
蛋白质的功能与其定位密切相关。进化分析表明，ghnhx4a可能定位于核内体区(图1)。因此，我们构建了35s:ghnhx4a-egfp表达载体，该载体随后在烟草叶片中瞬时表达，并以35s:egfp作为对照。当仅表达egfp时，在整个质膜、细胞质和细胞核中均呈现非特异性绿色荧光(图6e)。在表达ghnhx4a-egfp时，绿色荧光出现在质膜、液泡膜和细胞核周围的囊泡状结构中，但不确定是否位于核内体区中(图6a)。因此，我们继续使用fm4-64染料进行染色。研究表明，蛋白质与fm4-64的共定位可用于判断由蛋白质是否存在于植物细胞中的核内体区。用fm4-64染色后，除细胞核和其他结构外，egfp的绿色荧光与红色荧光叠加形成黄色荧光(图6g)。ghnhx4a-egfp的囊泡状绿色荧光与红色荧光重叠，显示出黄色荧光(图6c)，表明ghnhx4a位于核内体中。图6所示ghnhx4a在烟草叶片中的亚细胞定位，图6中标注线均为50μm。图6a-d示出35s:ghnhx4a-egfp，带有egfp标签的ghnhx4a；图6e-h示出35s:egfp，对照；图6a和e示出绿色荧光图像；图6b和f示出经fm4-64染色的红色荧光；图c和g示出红色荧光、绿色荧光和明场重叠的图像；图6d和h示出明场图像。烟草叶片表皮细胞中的定位结果表明，ghnhx4a位于细胞的核内体中。同时，与拟南芥和番茄的核内体型基因定位结果也一致。
[0115]
4、沉默表达ghnhx4a可显著降低对盐胁迫的抗性
[0116]
农杆菌介导的转化方法用于将trv:00(空vigs载体)和trv:ghnhx4a侵染10天龄的陆地棉(tm-1)幼苗子叶。12天后，即当阳性对照棉苗(trv:cla)的叶子出现白化表型时，从trv:00和trv:ghnhx4a棉苗上取根、茎和叶。提取总rna，然后反转录以合成cdna。最后，通过qpcr证实了ghnhx4a表达的沉默，发现trv:ghnhx4a棉苗的根、茎和叶中的ghnhx4a表达水平与trv:00棉苗相比显著降低(图7a)，结果表明在ghnhx4a沉默的棉苗中ghnhx4a的表达水平被显著的降低。为了确定ghnhx4a沉默后棉苗对盐处理的耐受性，将trv:00和trv:ghnhx4a棉苗同时用200mm nacl处理，在处理10天后发现，与trv:00相比，trv:ghnhx4a棉苗明显萎蔫(图7a)。上述结果说明，ghnhx4a沉默后棉花对盐的敏感性更高，表明该基因参与棉花的耐盐反应。
[0117]
图7为沉默表达ghnhx4a降低棉花对nacl的耐受性。图7a显示trv:00和trv:ghnhx4a的基因沉默效率。trv:cla用作阳性对照，ghhis3用作内参基因。误差棒表示至少三个生物学重复的标准偏差(*p<0.05，**p<0.01；t检验)。图7b示出在未处理(对照)和200mm nacl处理下的trv:00和trv:ghnhx4a棉苗表型图片。
[0118]
盐胁迫会破坏植物中的离子平衡和水势平衡，引起植物毒性并抑制植物生长。离
子毒性主要是由大量na
+
竞争取代k
+
引起的，na
+
对于植物中某些酶保持活性是必需的，而k
+
对于某些蛋白质合成也是必需的。渗透胁迫主要是由于高浓度的na
+
引起的土壤水势下降，这使植物根部难以吸收水分，影响光合作用，降低生物产量，最终导致植物的代谢混乱。通过aas测定trv:00和trv:ghnhx4a棉苗中na
+
和k
+
的含量(图8)。图8示出在对照(未处理)和盐处理下，trv:00和trv:ghnhx4a棉苗的na
+
、k
+
含量的测定和na
+
/k
+
比的计算。第一行：根；第二行：茎，第三行：叶。误差棒代表通过至少三个生物学重复实验计算的标准偏差(*：p<0.05，**：p<0.01，t检验)。
[0119]
结果表明，对照组中trv:00和trv:ghnhx4a的根、茎和叶的k
+
、na
+
含量和na
+
/k
+
比例无显著差异。实验组中叶片的k
+
、na
+
含量和na
+
/k
+
比例无明显差异，但是实验组中trv:ghnhx4a茎的na
+
含量显著高于trv:00，而且实验组中trv:ghnhx4a根的k
+
极显著低于trv:00。同时可以看出，用200mm nacl处理后，trv:ghnhx4a根和茎的na
+
/k
+
比值明显高于trv:00。这表明ghnhx4a参与了棉花中na
+
和k
+
的交换，但不同组织的功能可能不同。ghnhx4a在棉花茎中主要参与na
+
的积累，而根中的ghnhx4a在细胞中k
+
的积累中起主要作用。
[0120]
有研究表明，拟南芥中atnhx1的过表达将增加转基因植物对na
+
的抗性并提高对k
+
的吸收能力。将atnhx1在小麦中过表达后，在100～150mm nacl的条件下，转基因株系的na
+
浓度和k
+
浓度均高于非转基因株系。基于osnhx1与atnhx1序列从大麦中克隆出hvnhx1，该基因可转运na
+
和k
+
，并提高植物耐盐性。这些研究已经证实，nhx蛋白可以将na
+
定位在细胞中以降低离子毒性。核内体型nhx的研究表明，拟南芥中atnhx5的过表达可以提高幼苗期的种子发芽率和耐盐性。在盐胁迫下，过表达植株的干重、鲜重以及幼苗的na
+
和k
+
含量均高于野生型植物，耐盐性得到显著提高。此外，atnhx5不仅可以提高转基因蓝猪耳叶片的na
+
富集能力，而且可以显著减轻盐处理对叶片k
+
含量的不利影响。结果表明，atnhx5可以提高蓝猪耳的耐盐性，atnhx5对植物耐盐性的改善与nhx蛋白对na
+
和k
+
的富集有关。penhx6和manhx6都可以转运na
+
和k
+
，而atnhx6基因主要利用k
+
/h
+
转运活性，而na
+
/h
+
转运活性相对较弱，表明不同物种之间的nhx6基因在离子传输功能之间存在差异。这些研究结果表明，核内体型nhx与液泡型nhx一样，也具有调节na
+
和k
+
平衡的作用，并且转运方式也可能相似。
[0121]
据本研究结果推测，ghnhx4a蛋白可以将部分na
+
分配到棉花茎的核内体中，从而减少盐胁迫对棉花生长的抑制作用。在根部行使k
+
/h
+
转运功能，并通过维持细胞中k
+
的丰度提高耐盐性。此外，沉默番茄中的lenhx2基因后，其耐盐性减弱，k
+
积累显著降低，与本研究结果相似，表明ghnhx4a基因在植物抗盐性中起重要作用，可以减轻植物对盐胁迫的敏感性。
[0122]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。