[0001]
本发明涉及微藻的开发技术领域，具体涉及一种利用蛋白核小球藻发酵油脂的方法。
背景技术：
[0002]
微藻是一类单细胞藻类，其具有细胞增殖快、生产周期短、不受季节和土地的限制、所需的培养基来源丰富，以及所产的油脂成分与植物油类似等优点，因此，利用微藻开发油脂资源已日益受到人们的青睐。微藻被认为是一种极具潜力的生物柴油原料。
[0003]
蛋白核小球藻为绿藻门小球藻，属普生性单细胞绿藻，小球藻繁殖能力极强，能利用太阳光制造大量的蛋白质，蛋白质含量50％左右，超过诸如牛肉、大豆等高蛋白食物；还含有不饱和脂肪酸10％～30％、碳水化合物10％～25％，并含有8种必需氨基酸、丰富的多种维生素，及铁、锌、钙、钾等矿物质。另外，人们还发现小球藻内含有一种珍贵的生长因子(cgf)，它能促进机体，特别是儿童及老年人体质的增强，并能使免疫功能得到强化。
[0004]
现有技术中有研究利用蛋白核小球藻作为吸附重金属的生物吸附剂，如申请号201910856249.5公开了一种吸附重金属的生物吸附剂的制备方法，第一锥形瓶中加入定容完成的培养基，然后滴加盐酸；培养基置于灭菌设备进行高温灭菌，并对灭菌完成后的培养基进行冷却处理；加入储备液至冷却后的培养基中；接入蛋白核小球藻种子液后将第二锥形瓶置于光照培养箱中静置培养；每天定时摇动第二锥形瓶3次，培养3天后将第一代藻液以体积比为1:1的接种量转接出来为第二代藻液，重复转接3代后活化成功，并将活化后的蛋白核小球藻藻液稀释转接藻种，扩大培养后成为重金属生物吸附剂，达到该吸附剂可以对水中多种重金属同时去除。
[0005]
上述现有技术中利用蛋白核小球藻来吸附重金属，但是现有技术鲜有报道蛋白核小球藻在生物原料油制备方面的应用。
技术实现要素：
[0006]
本发明的目的在于提供一种提高蛋白核小球藻发酵油脂的方法，该方法利用蛋白核小球藻产油，大大提高了蛋白核小球藻油脂产量，且该方法简便易行，能降低能耗和生产成本，在利用产油微生物进行生物原料油制备方面，具有重要的应用价值。
[0007]
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0008]
一种提高蛋白核小球藻发酵油脂的方法，依次包括以下步骤：
[0009]
s1、活化培养：
[0010]
将蛋白核小球藻接种于第一培养基中进行活化培养，培养至对数生长期并作为种子液；
[0011]
所述的第一培养基中组分及含量分别为：葡萄糖10g/l，kno
3 0.08g/l，k2hpo4·
3h2o 1.0g/l，mgso4·
7h2o 0.3g/l，feso4·
7h2o 0.003g/l，维生素b1 5-10g/l，a5微量元素溶液1ml/l；
[0012]
s2、光照摇床中培养：
[0013]
将经过活化培养后的蛋白核小球藻接种到装有第二培养基的摇瓶中，置于光照摇床中进行培养；
[0014]
s3、步骤s2光照摇床中培养结束所得微生物细胞依次经离心、洗涤和冷冻干燥后，即得。
[0015]
作为本发明的一个优选方案，步骤s1中，接种量为10％，培养条件为：温度20～30℃，光照强度为1500lux，摇床转速为100～120r/min，发酵培养周期为5～8d，起始ph为6.5。
[0016]
作为本发明的另一个优选方案，步骤s2中，第二培养基中c/n的质量体积配比为16～64:1。
[0017]
进一步的，第二培养基中c/n的质量体积配比为48:1。
[0018]
进一步优选，步骤s2中，第二培养基的组分及含量分别为：蛋白胨0.08g/l，mgso4·
7h2o0.004g/l，feso4·
7h2o 0.004g/l，cacl2·
2h2o 0.04g/l，柠檬酸0.05g/l，edta-fe 0.001g/l，nacl 0.0025g/l，k2hpo
4 0.0075g/l，kh2po
4 0.0175g/l，a1液0.1ml；其中a1液中含有h3bo
3 286mg、mncl2·
4h2o 181mg、namno4·
2h2o 3.9mg、znso4·
7h2o 22mg、cuso4·
5h2o7.9mg。
[0019]
进一步优选，步骤s2中，培养条件为：温度25～30℃，摇床转速为140～160r/min，培养10～14天，初始ph为5.3。
[0020]
与现有技术相比，本发明带来了以下有益技术效果：
[0021]
本发明提出了一种提高蛋白核小球藻发酵油脂的方法，该方法可以显著提高蛋白核小球藻的产油能力，通过对培养基进行合理选择，包括碳源、氮源、碳氮比、二价金属离子(mg
2+
和fe
2+
)以及培养调节，如温度、培养基初始ph值等对蛋白核小球藻细胞生长和脂肪积累的影响，并测定和分析了微生物油脂的脂肪酸组成。通过检测发现，当培养基中c/n为48时，总脂肪含量可达到50.22％，产率为333mg/l/d。
[0022]
本发明方法简便易操作，能有效降低能耗和生产成本，在利用产油微生物进行生物原料油制备方面，具有重要的应用价值。
具体实施方式
[0023]
本发明提出了一种提高蛋白核小球藻发酵油脂的方法，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。
[0024]
本发明所需原料均可通过商业渠道购买获得。
[0025]
实施例1：
[0026]
一种提高蛋白核小球藻发酵高产油脂的方法，包括以下步骤：
[0027]
1)活化培养：将蛋白核小球藻细胞接种于第一培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液，第一培养基为：葡萄糖10g/l，kno
3 0.08g/l，k2hpo4·
3h2o 1.0g/l，mgso4.7h2o 0.3g/l，feso4.7h2o 0.003g/l，vitamin b1 5-10g/l，a5微量元素液1ml/l。
[0028]
培养条件：试验在装液量为100ml的250ml的三角瓶中进行。接种量为10％，培养温度为25℃，起始ph为6.5，光照强度为1500lux，摇床转速为110r/min，发酵培养周期为7d。
[0029]
2)将蛋白核小球藻接种至含有不同葡萄糖浓度的第二培养基中，以葡萄糖为碳源，固定氮源氨基酸的浓度为0.08g/l，培养基中含有不同的c/n比，分别为16、32、48、64。初
始藻细胞数为5*105cells/ml接种后的摇瓶置于光照培养箱中，温度28℃、转速150转/分。光强为1500lux，培养12天，初始ph为6.4。第二培养基为：培养基成分为(g/l)：尿素0.08，mgso4·
7h2o 0.004，feso4·
7h2o 0.004，cacl2·
2h2o 0.04，柠檬酸0.05，edta-fe 0.001,nacl0.0025，k2hpo
4 0.0075，kh2po
4 0.0175，a1液0.1ml。其中a1液配方为h3bo
3 286mg，mncl2·
4h2o 181mg，namno4·
2h2o 3.9mg，znso4·
7h2o 22mg，cuso4·
5h2o 7.9mg。
[0030]
3)将上述步骤2)培养结束后的微生物细胞离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末，用于测定评价生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量。
[0031]
实施例2：
[0032]
一种提高蛋白核小球藻发酵高产油脂的方法，包括以下步骤：
[0033]
1)活化培养：将蛋白核小球藻细胞接种于第一培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液，第一培养基为：葡萄糖10g/l、kno
3 0.08g/l、k2hpo4·
3h2o 1.0g/l、mgso4.7h2o0.3g/l、feso4.7h2o 0.003g/l、vitamin b1 5-10，a5微量元素液1ml/l。
[0034]
培养条件：试验在装液量为100ml的250ml的三角瓶中进行。接种量为10％，培养温度为25℃，起始ph为6.5，光照强度为1500lux，摇床转速为110r/min，发酵培养周期为7d。
[0035]
2)将蛋白核小球藻接种至含有不同葡萄糖浓度培养基中，以蔗糖为碳源，固定氮源氨基酸的浓度为0.08g/l，培养基中含有不同的c/n比，分别为16、32、48、64。初始藻细胞数为5*105cells/ml接种后的摇瓶置于光照培养箱中，温度28℃，转速150转/分。光强为1500lux，培养12天，初始ph为5.3。第二培养基为：培养基成分为(g/l)：蛋白胨0.08，mgso4·
7h2o0.004，feso4·
7h2o 0.004，cacl2·
2h2o 0.04，柠檬酸0.05，edta-fe 0.001,nacl 0.0025，k2hpo
4 0.0075，kh2po
4 0.0175，a1液0.1ml。其中a1液配方为h3bo
3 286mg，mncl2·
4h2o181mg，namno4·
2h2o 3.9mg，znso4·
7h2o 22mg，cuso4·
5h2o 7.9mg。
[0036]
3)将上述步骤2)培养结束后的微生物细胞离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末，用于测定评价生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量。
[0037]
实施例3：
[0038]
一种提高蛋白核小球藻发酵高产油脂的方法，包括以下步骤：
[0039]
1)活化培养：将蛋白核小球藻细胞接种于第一培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液，第一培养基为：葡萄糖10g/l，kno
3 0.08g/l，k2hpo4·
3h2o 1.0g/l，mgso4.7h2o 0.3g/l，feso4.7h2o 0.003g/l，vitamin b1 5-10，a5微量元素液1ml/l。
[0040]
培养条件：试验在装液量为100ml的250ml的三角瓶中进行。接种量为10％，培养温度为25℃，起始ph为6.5，光照强度为1500lux，摇床转速为110r/min，发酵培养周期为7d。
[0041]
2)将蛋白核小球藻接种至含有不同葡萄糖浓度的第二培养基中，以葡萄糖为碳源，固定氮源氨基酸的浓度为0.08g/l，培养基中含有不同的c/n比，分别为16、32、48、64。初始藻细胞数为5*105cells/ml接种后的摇瓶置于光照培养箱中，培养温度为28℃，转速为150转/分。光强为1500lux，培养12天，初始ph为4.6。第二培养基为：培养基成分为(g/l)：甘氨酸0.08，mgso4·
7h2o 0.004，feso4·
7h2o 0.004，cacl2·
2h2o 0.04，柠檬酸0.05，edta-fe0.001，nacl 0.0025，k2hpo
4 0.0075，kh2po
4 0.0175，a1液0.1ml。其中a1液配方为h3bo3286mg，mncl2·
4h2o 181mg，namno4·
2h2o 3.9mg，znso4·
7h2o 22mg，cuso4·
5h2o 7.9mg。
[0042]
3)将上述步骤2)培养结束后的微生物细胞离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末，
用于测定评价生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量。
[0043]
通过对生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量进行测定，其结果如表1所示。
[0044]
表1
[0045]
c/n生物量油脂含量油脂产量油脂产率161.8324.70.6342.44322.9225.410.7461.67484.1329.721.23102.5643.136.041.1293.33
[0046]
由表1可见，生物量随着c/n的增加而逐渐增加，并在c/n为48时达到最大值4.13g/l，而后，随着c/n的继续增大生物量缓慢下降。最佳c/n为53.6.气象色谱分析结果表明，蛋白核小球藻产油脂的主要脂肪酸组成为棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂酸，其含量分别为23.4％，32,42％，20.48％，20.62％和8.35％。其中不饱和脂肪酸含量达到73％左右。其组成与植物油脂相似，因此，可作为植物生物柴油的原料。
[0047]
本发明中未述及的部分借鉴现有技术即可实现。
[0048]
需要说明的是：在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。