一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法

1.本发明属于动物传染病诊断和检测领域，具体涉及一种鸡毒支原体特异型单克隆抗体及其制备方法，还涉及一种分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选和选择性培养。


背景技术：

2.鸡毒支原体(mycoplasma galisepticum，mg)是引起鸡慢性呼吸道疾病(chronic respiratorydisease，crd)的病原，既能水平传播也能垂直传播，各种年龄的鸡均可常年感染。mg感染后会引起蛋鸡产蛋率下降，肉鸡体重减轻，雏鸡弱雏率增加。自nelson(1933)首次在鸡体内分离到mg以来，世界各国都证实该病原及相关疾病在鸡群中广泛流行，极大地威胁了养鸡业的健康发展。
3.mg感染主要表现为慢性呼吸道症状，引起鸡咳嗽、打喷嚏、鼻炎、结膜炎，呼吸时伴有鼻分泌物，也有可能患上单侧或者双侧鼻窦炎。目前我国鸡群mg感染阳性率高达 50％-80％，且mg极易与其他细菌或病毒继发和混合感染，使病程延长、病情加重，甚至死亡，经济损失加剧。
4.该病目前的防治措施主要是接种疫苗和长期使用抗菌药物。mg灭活疫苗及弱毒疫苗均存在缺陷，故临床上主要使用抗菌药物，而抗菌药物虽在短期内能抑制mg增殖，一旦停药，该病又会复发，且极易诱导耐药菌株的产生，造成鸡群隐性感染。当鸡群出现应激时再次诱发crd，给养禽业造成巨大的经济损失。因此，早期的快速、准确诊断和治疗对该病的控制具有重要的意义。
5.目前该病的诊断方法主要有支原体的分离鉴定、血清抗体检测和核酸诊断等。支原体分离培养营养要求高，体外培养生长缓慢，耗时较长，不能满足临床诊断的需要；常规抗体检测方法非特异性较高；核酸诊断需要特殊仪器设备和较高的操作技能，且容易因污染核酸而出现假阳性。鸡毒支原体是一种变异性极高的原核生物，不同株表面黏附蛋白差异较大。因此，申请者针对鸡毒支原体本地分离的强毒株hs株表面相对保守且免疫原性良好的黏附蛋白pmga1.2为抗原，获得了一株杂交瘤细胞，分泌鸡毒支原体单克隆抗体，此抗体将为鸡毒支原体病的诊断提供更为广阔的应用前景。


技术实现要素：

6.本发明目的在于公开一种鸡毒支原体单克隆抗体，由杂交瘤细胞株2a1分泌，该单克隆抗体能够识别鸡毒支原体的黏附蛋白pmga1.2，为建立特异、灵敏的elisa检测方法提供基础。
7.本发明的另一个目的是在于提供了一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法，该方法利用本地分离的强毒株mg-hs的黏附蛋白pmga1.2为免疫原，免疫balb/c小鼠，成功筛选出能够稳定分泌特异性强、效价高的抗pmga1.2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2a1，为 mg的快速诊断、免疫防治及mg的致病机理研究奠定基础。
8.本发明的第三个目的是将杂交瘤细胞注射到实验动物腹腔中，使实验动物产生腹水而获得单克隆抗体。
9.该发明的另一个目的是在于提供了一种鸡毒支原体单克隆抗体在检测鸡毒支原体中的应用，该方法为中国鸡毒支原体相关疾病的诊断提供了灵敏、特异、且合适批量检测的新型检测手段，填补了国内鸡毒支原体抗原检测的空白。
10.为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：将课题组前期在本地某鸡场分离得到的一株鸡毒支原体强毒株mg-hs，构建该鸡毒支原体粘附蛋白pmga1.2的原核表达载体，进行融合蛋白的表达及纯化。以纯化的gst-pmga1.2融合蛋白免疫balb/c小鼠，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；进一步用鸡毒支原体 pmga1.2抗原筛选，获得能稳定分泌高亲和力鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株2a1， 2a1株分泌的单克隆抗体的亚类为igg3。
11.该杂交瘤细胞株2a1可以在含有40％(v/v)新生牛血清的rpmi-1640培养基中半贴壁生长，生长环境为37℃，5％(v/v)co2的细胞培养箱。该杂交瘤细胞株体积较大，圆而透亮，成簇生长，且能稳定分泌抗鸡毒支原体的单克隆抗体。该细胞株由骨髓瘤细胞sp2/0和免疫脾细胞融合而得。
12.一种分泌鸡毒支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其步骤是：
13.1.鸡毒支原体(mg-hs)的培养：-80℃中取出mg-hs冻干粉(由华中农业大学预防兽医微生物重点实验室保存)，无菌环境接种至5ml fm-4全价培养基中，37℃恒温培养箱中培养3-5d，颜色由红变橘黄，作为原代菌株；每次颜色发生变化，从中取出0.9ml，接种至8.1ml新鲜的fm-4全价培养基中混匀，于37℃恒温生化培养箱中培养3-5d，直到颜色由红色变为橘黄。颜色变黄后取部分菌液，继续传代并测定其颜色变化单位，剩余的菌液加入终浓度为25％(v/v)的灭菌甘油混匀，-20℃保存。
14.2.mg-hs的活力测定：采用颜色变化单位法(color change unit，简称ccu)，是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数活的微生物的相对含量。血凝试验(ha)，是 mg细胞表面含有血凝素与红细胞表面的相应受体结合，引起红细胞凝集，可以测定mg的相对含量，确定其活性。
15.3.鸡毒支原体抗原的制备：按上述步骤确定的mg-hs，根据其pmga1.2的序列构建原核载体pgex-kg-pmga1.2，通过酶切重组，构建重组蛋白gst-pmga1.2与等体积的完全弗氏佐剂(cfa)乳化，作为免疫原，免疫小鼠。
16.4.小鼠免疫：选取6周龄的spf雌性balb/c小鼠6只，在每只小鼠颈背部皮下多点注射0.5ml(约含500mg蛋白)的免疫原。与首免间隔第10天、20天腹腔注射抗原0.5ml (约含500mg蛋白)，进行两次加强免疫。采集血清，用间接elisa法测定其效价。取效价最高的小鼠脾脏进行下一步融合。
17.5.杂交瘤细胞以及单抗的制备：
18.杂交瘤细胞的制备：在细胞融合前对效价最高的小鼠进行超强免疫，三天后小鼠脱颈处死，无菌取脾脏，匀浆，静置1min吸取上层细胞液。取1
×
107个sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，用50％(v/v)的peg1450介导细胞融合，逐渐加入基础培养基rpmi-1640稀释融合剂，终止融合，将融合细胞加入到96孔板中，于37℃，5％(v/v)co2培养箱中培养细胞培养至覆盖孔底1/4大小，培养液变黄，即可吸取培养上清进行elisa检测抗体，可根据抗体效
价挑选孔再进行克隆。
19.杂交瘤细胞克隆采用有限稀释法，采取阳性杂交瘤克隆转接到24孔板中扩大培养，再次克隆化筛选，进行扩大培养。
20.单抗腹水的制备：用灭菌液体石蜡预处理balb/c小鼠后，再注射杂交瘤细胞的方法生产腹水。
21.6.单抗纯化和鉴定：
22.单抗纯化：含单克隆抗体的腹水用常规的辛酸-硫酸铵方法纯化，4℃保存备用(图4)。
23.单克隆抗体的亚型鉴定：采用thermo scientific pierce公司elisa小鼠单克隆抗体分型试剂盒，检测到该单抗的亚类为igg3。
24.单克隆抗体特异性检测：western blot检测单抗特异性，单抗不与两种标签蛋白反应，只与gst-pmga1.2融合蛋白发生反应(图5)。
附图说明
[0025][0026]
图1原核表达载体图谱及重组质粒的鉴定。m为marker。1目的条带。
[0027]
图2融合蛋白gst-pmga 1.2表达及其western blot鉴定，a sds-page电泳图，bwestern blot结果。m参考蛋白。1、2、标签蛋白gst-pmga 1.2鉴定结果。
[0028]
图3 gst-pmga1.2免疫鼠血清抗体效价测定。
[0029]
图4 2a1单抗的纯化。m参考蛋白。1纯化的单抗2a1。
[0030]
图5 western blot检测2a1特异性。1融合蛋白gst-pmga 1.2。2标签蛋白gst，3标签蛋白his。
[0031]
具体实施措施
[0032]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
[0033]
鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法：
[0034]
1免疫原(抗原)的制备
[0035]
选择原核表达载体，以pgex-kg-pmga1.2重组质粒为模板，用ecor i和xhol i对 pgex-kg-pmga1.2双酶切鉴定，得到大小约为5000bp和1800bp的条带(图1)，酶切验证正确；构建pet-28a(+)-pmga1.2重组质粒，同样用ecor i和xhol i对pgex-kg-pmga1.2 双酶切鉴定，得到大小约为5000bp和1800bp左右的条带(图1)，酶切验证正确；iptg诱导产生融合蛋白gst-pmga1.2，western blot鉴定获得理想的融合蛋白(图2)，将纯化的蛋白稀释成适当浓度与等体积的弗氏完全佐剂采用涡旋震荡法混合，融合蛋白乳化，以乳化好的融合蛋白为免疫原。
[0036]
2动物的免疫
[0037]
初次免疫：选取6周龄的spf雌性balb/c小鼠6只，在每只小鼠颈背部皮下多点注射 0.5ml/只(约含蛋白500mg)的免疫原。
[0038]
第二次免疫：初次免疫后第10天进行第二二次免疫，腹腔注射抗原0.5ml/只(约含
蛋白 500mg)的免疫原；第二次免疫10天后进行第三次加强免疫，方法如同第二次免疫。
[0039]
超强免疫：对于血清效价达到1∶104以上的小鼠在融合前三天不加佐剂的抗原蛋白腹腔注射0.5ml/只(约含蛋白500mg)免疫原，进行加强免疫。建立间接elias方法测定其效价。采用gst-pmga 1.2融合蛋白包被96孔酶标板，间接elisa结果表明(见表1-1、1-2，)1， 3号小鼠的效价均达到1∶1.28
×
104，gst-pmga 1.2融合蛋白最佳包被浓度为4μg/ml，免疫小鼠1，3号可用于后续细胞融合试验。
[0040]
建立间接elisa法测定血清效价：
[0041]
采用碳酸盐法将免疫小鼠的血清包被到96孔酶标板中，以包被液(0.05mol/l ph 9.6碳酸盐缓冲液)从8μg/ml倍比稀释鉴定抗原，每孔加100μl，4℃过夜；弃抗原，pbst洗3 次，间歇摇动，用滤纸吸干孔里面的液体；0.5％bsa封闭，37℃，2h；将100倍稀释的抗体加入酶标板，设定未免疫小鼠血清作为阴性对照、阳性对照，每个标本做两个复孔，空白对照一行，37℃，1h，pbst洗三次，加入hrp标记的羊抗鼠二抗100μl/孔，37℃，1h，pbst 洗三次；每孔加入100μl的显色液，37℃避光显色，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液(2m h2so4)50μl，在波长450nm读取吸光值，以p，n待测和阴性血清的od450 值p/n≥2.1判为阳性，血清的最大稀释比为该血清的效价，附图3，1，3号小鼠的效价均达到1∶1.28
×
104，可进行后续融合实验。
[0042]
表1-1_gst-pmga 1.2抗原最适包被浓度确定
[0043][0044]
表1-2 gst-pmga 1.2抗原最适包被浓度确定
[0045][0046]
3.sp2/0骨髓瘤细胞的准备：快速解冻法复苏sp2/0骨髓瘤细胞。准备37℃水浴锅，快速化冻sp2/0骨髓瘤细胞，用rpmi-1640基础培养基10ml，1200r/min，5min，清洗细胞两次，8ml 40％(v/v)rpmi-1640全价培养基37℃，co2培养箱培养。
[0047]
制备balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞的混合细胞作为饲养细胞，在无菌的条件下，用吸管吸取基础培养液，将培养液注入小鼠的腹腔，吹洗数次，将基础培养液吸出移至离心管中，如此重复一次。取出小鼠脾脏，脾脏周边切小口处理匀浆，直到看不见红色的组织块，补加基础培养基于匀浆中静置1min，待白色的组织块沉到管底后，吸出上层细胞悬液8ml，转移到50ml离心管中补加8ml基础培养液到玻璃匀浆器后再转移1次。将混合细胞混匀后，1200r/min，水平离心5min，倒掉上清清洗细胞，用10ml基础培养液重悬后再洗1次。用45ml含1％(v/v)hat的rpmi-1640完全培养液重悬饲养细胞，转入50ml离心管中，盖上瓶盖，放到co2恒温培养箱培养。同样的方法制取免疫脾细胞。
[0048]
4.细胞融合
[0049]
本发明采用50％的peg1450作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，将融合细胞接种到96孔板中，第十天左右，集落长到占孔底1/4大小，即可进行抗体检测。取1
×
107个sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，重悬，于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合细胞的50ml离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴；用烧杯装4/5容积的水，调温到37℃后放进超净工作台；从co2培养箱取出温育至37℃的 50％peg，用1ml的吸管吸取1ml，手持装有混合细胞的50ml离心管，将其放置于37℃水浴中，将peg缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续60s。将离心管插到离心管架上，移走烧杯，从co2培养箱取出温育至37℃的50ml rpmi-1640基础培养液，用吸管吸取 10ml缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌，使细胞团块分散，先加1ml，再加2ml再加 3ml，最后加完剩下的4ml，加完第一个10ml后，接着沿管壁加完剩下的40ml，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。1500r/min，水平离心5min，弃上清，用重悬有饲养细胞的45ml含1％hat的rpmi-1640完全培养液将融合细胞重悬。将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置co2培养箱培养。融合后第4天即可观察到小集落；第7 天补加含1％ht的rpmi-1640完
全培养液，1滴/孔；第10天左右，集落长到占孔底1/4大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。
[0050]
5.杂交瘤细胞的选择性培养与克隆
[0051]
本发明阳性孔的克隆通过采用常规的有限稀释法，进行了4次克隆，筛选到1株能分泌抗pmga 1.2的杂交瘤细胞株，命名为2a1。融合后第7天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打对勾，标明集落的位置，用新鲜hat培养基半量换液一次，以逐步替代hat培养基，一般hat选择性培养3-5天即可出现小克隆，杂交瘤细胞体积较大，圆而透亮，其他细胞透光性差，并逐渐死亡；培养12-15天，克隆长至占孔底面积的1/3-1/2，此时可取培养上清进行抗体检测。间接elisa方法检测细胞培养液上清效价。
[0052]
杂交瘤细胞的克隆：采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆，取适量ht培养基加到阳性杂交瘤孔中，吹打悬浮细胞，取少量在96孔板中倍比稀释，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养3h或过夜，对倍比稀释孔进行细胞计数，取70～80个生长良好的杂交瘤细胞用一定量新鲜ht培养基充分悬浮，再以200μl/孔接种至该细胞培养板的剩余孔内。培养2-3天后，挑选仅含1-2个细胞克隆且生长良好的孔，补加ht培养基，继续培养至第5天再次观察并确认单克隆细胞孔。培养至第10-14天细胞克隆可生长至占孔底面积的5-30％，取上述挑选出的杂交瘤孔的培养上清进行抗体检测。从被检孔中挑选出前后两次抗体检测均呈强阳性反应的单细胞克隆孔2个，分别进行第2次克隆化和保存。如此连续克隆化3次以上，直至所有被检孔均呈阳性反应，才完成该杂交瘤细胞的建株工作，即获得了能稳定传代并分泌预期抗pmga 1.2的杂交瘤细胞株。
[0053]
杂交瘤细胞的保存和复苏：使用常规细胞冻存方法，血清与二甲基亚砜以9∶1配置细胞冻存液，置于液氮中长期冻存。杂交瘤细胞复苏时注意冰晶对细胞的损伤，在水浴锅中快速摇晃化冻复苏。
[0054]
6.小鼠腹水法生产单克隆抗体
[0055]
本发明通过用灭菌的石蜡(0.5ml/只)腹腔注射小鼠，10天后，将扩大培养后的2a1 杂交瘤细胞腹腔注射小鼠(0.5ml/只)，8-12天后当出现腹部肿大且行走困难的小鼠时，进行采集腹水并检测腹水效价。建立间接elisa方法测得2a1杂交瘤细胞的腹水效价为1∶ 1.024
×
105。具体操作如下：
[0056]
balb/c小鼠的预处理：用灭菌的液体石蜡处理小鼠，腹腔注射0.5ml/只，十天后即可注射杂交瘤细胞。
[0057]
(1)阳性孔的扩大培养：在24孔细胞培养板加入饲养细胞，4滴/孔，将96孔板内的阳性细胞转到24孔细胞培养板进行扩大培养。待到细胞长满孔底即可注射小鼠。
[0058]
(2)杂交瘤细胞注射：将24孔板的细胞重悬，1200r/min，离心5min，细胞计数，用rpmi-1640基础培养液稀释成1-5
×
106/毫升，腹腔注射小鼠0.5ml/只，8天左右观察到小鼠腹部隆起，即可采集腹水。
[0059]
7. 2a1单抗的纯化
[0060]
用常规的辛酸-硫酸铵方法纯化采集的腹水，12％sds-page检测纯化效果(附图4)，一条带在50kda(重链)，一条在26kda(轻链)，结果表明：纯化后的单抗纯度较高。
[0061]
8.单克隆抗体的亚型鉴定
[0062]
采用thermo scientific pierce公司elisa小鼠单克隆抗体分型试剂盒检测。通
过间接 elisa方法，一抗是采集的腹水，二抗是鼠抗igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga，igm酶标二抗，鉴定该单抗亚类为igg3。
[0063]
9.单抗2a1的特异性检测
[0064]
利用western blot检测(附图5)，igg抗体不与标签蛋白gst和his反应，只与gst-pmga1.2融合蛋白反应，因此确定所制备抗体为pmga 1.2的特异性抗体。