一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测昆虫细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

实时荧光pcr技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，通过检测荧光信号的动态变化实时反映pcr的每个循环的扩增水平。ccd能够周期性地发出特定波长的激发光从而激发产生激发光，然后ccd收集激发光的信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。taqmanpcr技术是实时荧光pcr的一种。与传统的pcr相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，呈现淬灭效应。随着扩增反应的进行，taq酶的5’端外切酶活性将与检测靶标偶连的探针从5’端开始水解，从而释放出荧光基团产生荧光信号。随着扩增反应的进行，荧光信号呈现出指数级的增长。

与传统的分子杂交方法相比，taqmanpcr技术具有如下优点：1、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值（ct）的分析，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测纯化工艺的效果；2、将dna扩增与检测过程融合为一体，可以实时监测dna扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大缩短了结果分析时间，具有方便、快捷、高效的优点；3、检测过程采用封闭检测的模式，大大减少气溶胶污染和由此造成的假阳性的问题；4、与普通的染料qpcr相比，taqmanpcr增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，有效结合了普通染料qpcr和探针杂交的双重特异性，因此，大大提高了检测方法的特异性和准确性。因此，该技术已逐渐取代传统的分子杂交方法，在病原体的定量或定性检测中得到十分广泛的应用。

昆虫细胞是来自昆虫的一类真核细胞。基于昆虫细胞的表达系统称之为昆虫细胞表达系统。昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易于纯化但也易于降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，并且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。昆虫细胞表达系统具有很多有点：1、具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；2、正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；3、具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；4、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；5、可表达非常大的外源性蛋白（约200kd）而不至于影响本身的增殖；6、具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；7、通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；8、对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。因此，昆虫细胞被广泛的用于生物重组制品和基因治疗病毒的生产。

中国食品与药品监督管理局（cfda）和美国食品与药品监督管理局（fda）已经批准了一些定量检测病原体的pcr诊断试剂盒，如用于乙型肝炎、丙型肝炎、hiv和sars、hiv、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光pcr检测的试剂盒。虽然已经有用实时荧光pcr技术（染料法）检测cho细胞残留dna的报道，但在疫苗和基因治疗产品的残留dna的检测中，目前还没有针对昆虫细胞dna残留的快速定量检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测昆虫细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测昆虫细胞dna残留的引物，其核苷酸序列如下所述：

正向引物序列：5’-cgctgtaagaggaccgtag-3’（seqidno:1）

反向引物序列：5’-gacctcacgcaatcttctga-3’（seqidno:2）

一种用于检测昆虫细胞dna残留的试剂盒，包括2×taqmanmastermix、标准品、dna稀释液和引物探针混合物；所述引物探针混合物包括引物对和taqman探针，其中引物对的核苷酸序列如下所述：

正向引物序列：5’-cgctgtaagaggaccgtag-3’（seqidno:1）

反向引物序列：5’-gacctcacgcaatcttctga-3’（seqidno:2）

taqman探针的核苷酸序列如下所述：

taqman探针：5’-accgctgcctcctcctgcagg-3’（seqidno:3）

taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，其荧光报告基团为fam，3’端标记有淬灭基团，其淬灭基团为mgb。

在上述技术方案中，所述2×taqmanmastermix包含taq酶、dntps、mg²⁺、bsa、ung酶和pcr反应缓冲液。

在上述技术方案中，所述标准品为昆虫细胞基因组dna；基因组dna的浓度为30ng/ul。在使用时，用dna稀释液将其稀释成6个浓度梯度，分别为300pg/ul、30pg/ul、3pg/ul、0.3pg/ul、0.03pg/ul和0.003pg/ul的浓度梯度。

一种用于检测昆虫细胞dna残留的反应体系，所述反应体系的扩增反应液为2×qpcr预反应液，内含taq酶、dntps、mg²⁺、bsa、ung酶和pcr反应缓冲液。反应体系为30ul。所用dna模板可以是标准品或待检样本等。

一种用于检测昆虫细胞dna残留的方法，所述方法为实时荧光定量pcr法，其反应程序为:50℃2min，95℃预变性10min；95℃10sec，60℃1min，45个循环；根据所得标准曲线，计算待检样本中昆虫细胞dna残留量。

在上述技术方案中，所述方法的检测样本为以昆虫细胞为表达宿主细胞进行生产的重组蛋白或重组病毒类疫苗或基因治疗载体等，例如：重组腺相关病毒等。

本发明的优点和有益效果为：

本发明利用实时荧光定量pcr技术进行定性和定量检测昆虫细胞dna残留的方法和依据所述方法制备的pcr试剂盒，实现了检测昆虫细胞dna残留的定量限低至3fg/ul，表明本方法具有很好的灵敏度和特异性。

本发明提供的实时荧光定量pcr方法可以检测基于以细胞为表达宿主细胞进行生产的重组蛋白或重组病毒类疫苗或基因治疗载体等，例如：重组腺相关病毒等，可为基因治疗载体的研发和安全生产提供可靠的质量检测数据。

附图说明

图1本发明的昆虫细胞引物退火温度优化琼脂糖凝胶结果图。

图2本发明的昆虫细胞dna标准品的扩增曲线图。

图3本发明的昆虫细胞dna标准品的标准曲线图。

图4本发明的昆虫细胞dna残留检测方法的特异性。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

本方法针对昆虫细胞基因组dna序列进行细致的筛选分析工作，选定核糖体l37a蛋白基因（nc_049725.1）作为靶标基因，该基因源自草地贪夜蛾（spodopterafrugiperda）。基因序列为：

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该基因作为60s核糖体的组成成分，具有高度的灵敏性。针对昆虫细胞l37a蛋白基因高度特异的区域进行引物探针的设计，该引物探针特异性的针对昆虫细胞，从而赋予检测方法高度的检测特异性。首先利用普通pcr进行引物对的筛选，然后再利用taqmanqpcr进行引物探针组合的筛选，得到了下述实施例中高特异性、高灵敏度的引物探针组合。

实施例1

1.1材料和试剂

2×taqpcr预混液，购自天根生化科技（北京）有限公司；

2×taqmanmastermix预混液，购自天津科佰迪生物医药科技有限公司；

abi7500荧光定量pcr仪，购自abi（美国应用生物系统公司）；

dna稀释液由实验室采用分子生物级试剂自行配置；

基因组dna提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；

实验中所用的引物和探针由invitrogen美国英杰生命技术有限公司进行合成纯化。

所用的引物和探针序列如下：

正向引物序列：5’-cgctgtaagaggaccgtag-3’（seqidno:1）

反向引物序列：5’-gacctcacgcaatcttctga-3’（seqidno:2）

taqman探针：5’-accgctgcctcctcctgcagg-3’（seqidno:3）

taqman探针5’端的荧光报告基团为fam；3’端的淬灭基团为mgb。

1）10×引物探针混合物：将正向引物：反向引物：taqman探针按照1.5:1.5:0.2的比例进行混合，得到10×引物探针混合物。

2）dna的提取标定：按照基因组dna提取试剂盒的说明书提取昆虫细胞的基因组dna，然后分别利用nanodrop和qubit考察基因组dna的质量和将基因组dna的浓度标定至30ng/ul。

3）将2×taqpcr预混液和正反向引物以及昆虫细胞基因组dna取出，按照下表1，进行pcr反应液的配制：

4）加样完成后，在梯度pcr仪中进行扩增。反应条件为：95℃预变性10min；95℃10sec，50-70℃1min，45个循环。

5）将pcr反应所需试剂取出：2×taqmanmastermix，引物探针混合物，标准品，超纯水。根据样品的数量确定最终的反应管数从而准备qpcrmix，如下表2。

6）加样完成后，在abi7500实时荧光定量pcr仪上进行pcr扩增。反应条件为：50℃2min，95℃预变性10min；95℃10sec，60℃1min，45个循环。

1.2昆虫细胞dna残留检测引物退火温度优化

利用抽提标定好的昆虫细胞基因组dna（30ng/ul）作为模板，考察昆虫细胞dna残留检测引物的最适退火温度，退火温度分别设置为50，55，60，65和70度。按照表1的反应体系组成进行加样，然后放置于梯度pcr仪并按照反应程序进行反应。反应结束后，取5ul反应产物加入琼脂糖凝胶进行电泳并观察结果。如图1所示，在50-60度之间，昆虫细胞dna残留检测引物均有不错的扩增，而阴性对照（水作为模板时）则没有任何扩增，因此，针对昆虫细胞dna残留检测引物的退火温度选择为60度。

1.3昆虫细胞基因组dna标准曲线的绘制

将抽提标定好的昆虫细胞基因组dna（30ng/ul）利用dna稀释液进行梯度稀释，得到st1（300pg/ul），st2（30pg/ul），st3（3pg/ul），st4（0.3pg/ul），st5（0.03pg/ul），st6（0.003pg/ul）。按照表2的加样体系进行加样，然后上机并按照反应程序进行反应。用昆虫基因组dna各稀释度浓度的log值对每个稀释度的ct（初始循环数）值作图，二者呈线性递减的关系，该线性曲线即是昆虫基因组dna定量标准曲线（图2，图3）。曲线的r2值反应标曲的相关性，r2值应大于0.99；曲线的斜率反应扩增反应的扩增效率，斜率应该在3.1-3.6质检，即扩增效率在90-110%之间。

1.4昆虫细胞dna残留检测方法灵敏度

将昆虫基因组dna稀释至6fg/μl，4.5fg/μl，3fg/μl，1fg/μl，然后利用反应体系进行测定以确定其检测灵敏度，每个浓度做8个重复。实验结果显示：浓度低至1fg/μl时，其cv至仍<15%，因此，检测反应的灵敏度可低至1fg/μl。

1.5昆虫细胞dna残留检测方法的精密度

对于重复性实验，针对3pg/ul的样本进行检定，做10个重复。实验结果如下表3所示：cv值均<15%，表明实验重复性好。

对于中间精密度实验，针对30pg/ul，3pg/ul，0.3pg/ul和0.03pg/ul的四个不同浓度的样本，由三个不同的人员进行定量检测。每个人每组样本独立重复3次。实验结果如下表4所示：各组的cv值均<10%。

1.6昆虫细胞dna残留检测方法的特异性

将单独抽提好的hek293基因组dna、e.coli细胞基因组dna、vero细胞基因组dna和昆虫细胞基因组dna进行梯度稀释，然后按照反应体系进行加样检测并绘制曲线。如图4，实验结果显示：该方法只针对昆虫细胞，具有很高的检测特异性。

实施例2：试剂盒的制备

试剂盒的制备包括以下组成成分：

昆虫细胞基因组dna（30ng/ul）（40ul/管）1管、dna稀释液（7ml/瓶）1瓶、2×taqmanmastermix（1500ul/管）1管、10×引物探针混合物（300ul/管）1管、超纯水（1.5ml/管）1管。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110>天津科佰迪生物医药科技有限公司

<120>一种用于检测昆虫细胞dna残留的引物、试剂盒及检测方法

<130>1

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工合成()

<400>1

cgctgtaagaggaccgtag19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工合成()

<400>2

gacctcacgcaatcttctga20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>spodopterafrugiperda

<400>3

accgctgcctcctcctgcagg21

<210>4

<211>1430

<212>dna

<213>spodopterafrugiperda

<400>4

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