一种高表达SARS-COV2-RBD的细胞株及其方法与流程

一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株及其方法
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株及其方法。


背景技术：

[0002]
新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019 ncov)感染暴发流行对全球公众健康构成了严重威胁。由2019 ncov引起的疾病被世界卫生组织(world health organization，who)正式命名为covid 19。covid 19在临床上表现为肺炎、发烧、咳嗽、肌肉疼痛、疲劳、腹泻，严重时导致死亡。
[0003]
s蛋白是冠状病毒最重要的表面蛋白，与病毒的传染能力相关。s蛋白含有两个亚基：s1和s2，其中s1主要包含受体结合区域(rbd)，负责识别细胞受体；s2含有膜融合过程所需的基本元件。利用重组的rbd蛋白作为抗原检测体内igm和igg，是一种非常有效和快速的检测是否感染新型冠状病毒的一种方法。
[0004]
真核细胞表达系统可以对蛋白进行翻译后修饰和正确的折叠组装，但是像酵母昆虫这些低等细胞表达系统，对蛋白进行的翻译后修饰所得产物的糖型与人类天然蛋白糖型有很大差异，导致产物蛋白在性质与功能上与人类天然蛋白也有很大差异。哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translational modifications,ptms),哺乳动物细胞表达系统是目前重组药物蛋白生产的最主要表达系统。哺乳动物细胞表达系统包括非人源化细胞和人源化细胞系,常用的非人源化哺乳动物细胞主要是中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,cho)细胞,目前近70％重组药物蛋白都是用cho细胞表达系统生产的。尽管非人源化哺乳动物类细胞具备安全性和有效性,但是由于ptms方式不同,尤其是糖基化修饰与人源细胞存在差别,表达蛋白和人体内的蛋白还是存在很大差异。
[0005]
hek293细胞来源于人胚肾细胞,最早由graham于1977年利用转染腺病毒5型dna获得,近年来被应用于重组药物蛋白和病毒载体的生产。由于其ptm方式和人类细胞最接近，因此在表达人源性蛋白方面有着不可取代的优势。
[0006]
重组蛋白在宿主细胞中的表达分为瞬转和稳转两种方式，瞬转就是将目的基因载体利用各种方式转染到宿主细胞中，经过短时的宿主表达，而收获蛋白的一种方式，转染一次，收获一次。稳转是利用各种筛选方式，将目的基因稳定插入到宿主细胞的基因组中的细胞筛选出来。获得稳转细胞之后，就不需要每次转染，只需要将稳转细胞保存，每次复苏培养即可获得目的蛋白。
[0007]
稳转细胞系的筛选有很多方式，最常用的筛选方式就是抗生素筛选。在表达载体上加上抗生素筛选标记，将表达载体转染到细胞之后，通过在培养基中加入抗生素，将稳定转染表达载体的细胞筛选出来，因为表达载体上一般同时带有目的基因，因此一般筛选出的稳转细胞也是携带目的基因的细胞，从而达到筛选出表达目的蛋白的稳转细胞系。然而，因为大多数细胞很难耐受抗生素的加压筛选，因此用抗生素筛选方式，很难筛选出目的基因高表达的细胞系。这在293系统上表现的非常突出，由于该细胞系瞬转转染效率非常高，
因此用抗生素筛选得到的稳转细胞，表达蛋白的效率远远不如瞬转表达。因此，对于293表达系统来讲，目前大多数表达蛋白的方式都是瞬转。
[0008]
另外一种筛选方式，为营养缺陷型筛选方式，这在cho表达系统中应用非常广泛，有dhfr缺陷的cho系统和gs-cho系统。前者以dg44细胞株为代表，这是一种二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型细胞，在在缺乏次黄嘌呤-腺嘌呤(ht)培养基中不能生长，当转入携带有dhfr的基因后可以生长，并且dhfr可以被甲氨蝶呤(mta)抑制，通过增加mta的浓度，dhfr基因的扩增，伴随着目的基因扩增，从而达到高表达细胞株的筛选。后者，gs-cho系统分为以chok1sv为代表的谷氨酰胺合成酶存在(低表达)的细胞和gs-ko为代表的谷氨酰胺合成酶敲除的细胞。在chok1sv细胞中，在缺乏谷氨酰胺的培养基中生长缓慢，gs抑制剂，l-氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulphoximine msx),可用于抑制内源性gs活性,只有转染了额外gs基因可以生存。因此同样可以通过增加msx的浓度，来增加gs基因的拷贝数同时伴随着目的基因的拷贝数的增加，从而达到高表达细胞株的筛选。
[0009]
营养缺陷型筛选可以通过加压方式筛选到高表达目的基因的细胞系，但是这种筛选方式是基于宿主细胞的基因缺陷，而对于293表达系统，目前市场上并没有这样的细胞系在售，因此利用营养缺陷型筛选方式并不适合293表达系统。
[0010]
综上所述，现有技术还缺少一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株及筛选高表达sars-cov2-rbd的细胞株的方法


技术实现要素：

[0011]
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株及筛选高表达sars-cov2-rbd的细胞株的方法。
[0012]
本发明的第一个方面，提供了一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株，所述细胞株分类命名为人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd，保藏于中国典型培养物保藏中心武汉大学保藏中心，保藏号为cctcc no：c2020155，保藏日期为2020年9月23日。
[0013]
本发明的第二个方面，提供了一种高表达sars-cov2-rbd的细胞株分泌的sars-cov2-rbd。
[0014]
本发明的第三个方面，提供了高表达sars-cov2-rbd的细胞株和/或sars-cov2-rbd在制备检测新型冠状病毒的试剂中的应用。
[0015]
本发明的第四个方面，提供了高表达sars-cov2-rbd的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016]
s1、基因合成表达sars-cov2-rbd的碱基序列；
[0017]
s2、将步骤s1合成的碱基序列克隆入表达载体；
[0018]
s3、将步骤s2克隆后的表达载体转染至hek 293细胞；
[0019]
s4、利用抗生素筛选步骤s3获取的稳转细胞群；
[0020]
s5、利用流式细胞荧光分选技术筛选高表达稳转细胞群；
[0021]
s6、从步骤s5筛选的高表达稳转细胞群中分离单克隆细胞，并依次验证各单克隆细胞的sars-cov2-rbd表达量。
[0022]
优选的，所述抗生素包括嘌呤霉素。
[0023]
流式细胞荧光分选技术(facs)的工作原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色
后放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱，后者与入射的激光束垂直相交，液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号，计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。本发明所述的流式细胞荧光分选技术为现有技术，包括专利号为cn 104870646b的中国专利提供的方法。
[0024]
本发明的第五个方面，提供了一种生产sars-cov2-rbd的方法，将本发明所述的高表达sars-cov2-rbd的细胞株加入至293培养基中，37℃摇床中培养，待细胞长到2
×
106/ml-8
×
106/ml之后，将原来的培养基倒出50％-70％，更换成新鲜培养基，并用此方法连续收集3-8天，最后将所有的培养基收集在一起进行纯化得到sars-cov2-rbd。
[0025]
采用上述方法可以将每升的产量从50mg/l提高到200mg/l,并且此方法不需要复杂的设备和场地。
[0026]
本发明相对于现有技术具有如下优点：本发明提供的高表达sars-cov2-rbd的细胞株可以高产sars-cov2-rbd蛋白，并通过连续添加新鲜培养基技术，实现了在小规模实验室的工业级别的量产。
附图说明
[0027]
图1为本发明实施例1中的稳转细胞的表达量结果图；
[0028]
图2为本发明实施例1中的人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd克隆株分泌sars-cov2-rbd蛋白的电泳图；图中，从左至右，第一泳道为1ug bsa样本、第二泳道为2ug bsa样本、第三泳道为3ug bsa样本、第四泳道为1ug sars-cov2-rbd样本、第五泳道为marker、第六泳道为3ug溶解于还原性bffer的sars-cov2-rbd样本、第七泳道为3ug溶解于非还原性bffer的sars-cov2-rbd样本。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设别为本技术领域常规试剂、方法和设别。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。
[0030]
如本发明中所述，术语“碱基”就是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位，是一类含氮碱基。生物体中常见的碱基有5种，分别是腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。
[0031]
如本发明中所述，术语“蛋白”是25个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。
[0032]
如本发明中所述，术语“克隆”是指复制、拷贝和翻倍，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。
[0033]
如本发明中所述，术语“测序”指的是对基因的序列进行判断的一种方法。
[0034]
实施例1筛选高产sars-cov2-rbd的细胞株
[0035]
1、基因合成sars-cov2-rbd的表达序列
[0036]
从ncbi公布的新冠病毒的基因spike蛋白，找到编码319-514蛋白序列seq id no.1的碱基序列seq id no.2，碱基序列seq id no.2命名为sars-cov2-rbd的表达序列，并委托基因合成公司合成。
[0037]
seq id no.1
[0038][0039][0040]
seq id no.2
[0041][0042]
2、基因亚克隆入表达载体
[0043]
将合成好的sars-cov2-rbd的表达序列克隆到表达载体中。并通过基因测序鉴定出正确的克隆，将测序结果正确的克隆，用大抽试剂盒大抽2mg。
[0044]
3、将正确克隆的表达载体转染hek 293细胞
[0045]
3.1、复苏hek293细胞，37℃，5％co2环境下，130rpm摇床培养，
[0046]
3.2、待hek293细胞长到1
×
106/ml的密度时，取100ml hek293细胞用于转染。
[0047]
3.3、取30ug正确克隆的表达载体和100ug聚醚酰亚胺(pei)混合后加入100ml hek293细胞中，置于摇床继续培养。
[0048]
4、抗生素筛选稳转细胞群
[0049]
3天后，加入5ug/ml的嘌呤霉素。1周后，宿主细胞中没有稳定插入表达载体的细胞都不能生长，存活的细胞系就是携带有目的基因和抗生素筛选标记基因的细胞群。
[0050]
5、利用facs筛选高表达稳转细胞群
[0051]
5.1、利用facs筛选107细胞，通过荧光法测定稳转细胞的表达量，并收集荧光最强的1％的细胞。
[0052]
稳转细胞的表达量结果如图1所示，方框中为表达量最高的的1％细胞群，大约10万个细胞。
[0053]
5.2、将高表达细胞群培养起来，用于高产单克隆细胞株的筛选。
[0054]
6高产单克隆细胞株的筛选
[0055]
将高表达细胞群，用有限稀释法挑取单克隆，挑选荧光亮度最高的克隆，扩大培养。并将单克隆细胞株用于重组sars-cov2-rbd的生产。
[0056]
共挑选了50个单细胞克隆，经过培养筛选，人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd克隆株表达量最高，此克隆株已经被武汉大学保藏中心收录，保藏号为：cctcc no.c2020155。
[0057]
按照0.5
×
106/ml接种，培养人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd克隆株到第7天，细胞密度可以达到1.4
×
107/ml，离心收集细胞上清，经镍柱纯化后，可获得50mg/l的sars-cov2-rbd蛋白。将获取的sars-cov2-rbd蛋白纯化后进行电泳检测。
[0058]
电泳检测的样本包括：1ug bsa(牛血清白蛋白)、2ug bsa、3ug bsa、1ug sars-cov2-rbd、3ug溶解于还原性bffer的sars-cov2-rbd、3ug溶解于非还原性bffer的sars-cov2-rbd。电泳结果如图2所示，可见，人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd克隆株可分泌sars-cov2-rbd蛋白，根据电泳图的亮度也可以看出，人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd克隆株分泌sars-cov2-rbd蛋白的量较高。
[0059]
实施例2简易连续灌流技术生产sars-cov2-rbd蛋白
[0060]
将上述单克隆细胞株人胚胎肾细胞hek293-sars-cov2-rbd，在293培养基中，37℃摇床中培养，待细胞长到5
×
106/毫升之后，将原来的培养基倒出70％，更换成新鲜培养基，并用此方法连续收集5天，最后将所有的培养基收集在一起进行下游纯化。
[0061]
用此方法可以将每升的产量从50mg/l提高到200mg/l,并且此方法不需要复杂的设备和场地。
[0062]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。